兩個(gè)谷子CIPK基因在非生物逆境脅迫下的表達(dá)分析

余愛(ài)麗　趙晉鋒　王高鴻　杜艷偉　李顏方　張　正郭二虎　梁愛(ài)華

1山西大學(xué)生物技術(shù)研究所, 山西太原 030006;2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所 / 特色雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西長(zhǎng)治 046011

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兩個(gè)谷子CIPK基因在非生物逆境脅迫下的表達(dá)分析

余愛(ài)麗1,2趙晉鋒1,2王高鴻2杜艷偉2李顏方2張正2郭二虎2梁愛(ài)華1,*

1山西大學(xué)生物技術(shù)研究所, 山西太原 030006;2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所 / 特色雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西長(zhǎng)治 046011

摘要:CIPK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶, 該蛋白在植物響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本文利用生物信息學(xué)方法從谷子基因組中鑒定出2個(gè)CIPK基因, 命名為SiCIPK6和SiCIPK16。序列分析表明SiCIPK6基因組序列長(zhǎng)1994 bp,編碼451個(gè)氨基酸; SiCIPK16基因組序列長(zhǎng)1885 bp, 編碼473個(gè)氨基酸, 2個(gè)基因均無(wú)內(nèi)含子和可變剪切。生物信息學(xué)分析顯示這2個(gè)基因在蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)上與其他物種CIPK基因一樣非常保守。實(shí)時(shí)定量PCR分析表明SiCIPK6和SiCIPK16在ABA、低溫、高溫、干旱、高鹽誘導(dǎo)下表達(dá)量均有所上調(diào), SiCIPK6基因在ABA、干旱和鹽處理時(shí)表達(dá)量上調(diào)幅度較大, 而SiCIPK16基因在低溫、干旱和高溫處理時(shí)表達(dá)量上調(diào)幅度較大。半定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明SiCIPK6 和SiCIPK16兩個(gè)基因在拔節(jié)、孕穗、灌漿期時(shí)均有表達(dá), 在相應(yīng)生育時(shí)期受到干旱脅迫時(shí)它們表達(dá)量均有所提高。推測(cè)SiCIPK6和SiCIPK16基因在谷子的干旱或其他逆境脅迫中起一定作用。

關(guān)鍵詞:谷子; CIPK基因; 逆境

本研究由山西省基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2015011071), 山西省生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目和山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技自主創(chuàng)新能力提升工程項(xiàng)目(2015ZZCX-09)資助。

This study was supported by the grants from Natural Science Foundation of Shanxi Province (2015011071), the Key Laboratory Open Fund Project of Bio-engineering in Shanxi Provincial, and the Enhance Technology Independent Innovation Ability Project in Shanxi Academy of Agricultural Sciences (2015ZZCX-09).

第一作者聯(lián)系方式: E-mail: yuailimail@126.com

谷子[Setaria italica (L.) P. Beauv.]起源于我國(guó)黃河流域, 由狗尾草經(jīng)人工選擇和進(jìn)化而來(lái), 在我國(guó)已有8500多年的栽培史, 目前是我國(guó)干旱和半干旱地區(qū)廣泛種植的區(qū)域性特色資源作物[1]。谷子是C4作物, 種子發(fā)芽需水少、蒸騰系數(shù)低、凈光合強(qiáng)度和水分利用效率高, 具有抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特點(diǎn), 而且谷子基因組小, 高度保守、穩(wěn)定, DNA重復(fù)度低, 是抗逆遺傳和分子生物學(xué)研究的理想材料[2-3]。近年來(lái)隨著國(guó)內(nèi)外谷子測(cè)序工作的完成以及谷子全基因組序列的公布, 谷子耐逆關(guān)鍵基因發(fā)掘和逆境應(yīng)答調(diào)控機(jī)制逐漸成為研究熱點(diǎn)。

非生物逆境下脅迫會(huì)嚴(yán)重影響植物的萌發(fā)、幼苗存活、生物產(chǎn)量、葉片展開(kāi)度、光合作用強(qiáng)度以及生長(zhǎng)發(fā)育,嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致植株死亡[4-5]。研究表明非生物逆境脅迫中的干旱、鹽漬、低溫對(duì)植物的影響最為明顯, 是制約農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要限制因素[6]。在非生物逆境脅迫下植物不僅要感知逆境, 而且要把逆境信號(hào)傳遞下去, 激活下游的信號(hào)通路來(lái)應(yīng)對(duì)不利環(huán)境。Ca2+是眾所周知的第二信使, 能夠感知逆境的發(fā)生并且能夠傳遞信息啟動(dòng)逆境應(yīng)答機(jī)制[7-8]。CBL (calcineurin B-like protein)是一類鈣離子感應(yīng)蛋白, 能夠感知細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化, 然后與其靶蛋白CIPK (CBL-interacting protein kinase)互作, 構(gòu)成的復(fù)合物能夠把脅迫信號(hào)傳遞下去, 啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯來(lái)應(yīng)對(duì)脅迫[9]。

CIPK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶, 在植物體內(nèi)以多基因家族方式存在, 在苔蘚、蕨類、裸子植物以及單子葉和雙子葉植物中都發(fā)現(xiàn)有CIPK和CBL家族基因存在[10-12]。CIPK基因在響應(yīng)逆境脅迫、病原體與防御反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)元素吸收與平衡、激素應(yīng)答等植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用, 尤其與非生物逆境脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)[13]。擬南芥AtCIPK24 (SOS2)參與鹽脅迫應(yīng)答信號(hào)途徑, SOS2通過(guò)與鈣結(jié)合蛋白AtCBL4 (SOS3)互作, 分別在液泡膜和質(zhì)膜上行使各自功能保護(hù)植株免受鹽脅迫的傷害[14-19]。AtCBL1/AtCBL9-AtCIPK23和AKT1互作通過(guò)磷酸化/去磷酸化機(jī)制調(diào)控質(zhì)膜K+通道的活性和細(xì)胞K+吸收從而維持胞內(nèi)K+平衡[20-21]。AtCIPK8被高濃度硝酸鹽快速誘導(dǎo),通過(guò)控制硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體CHL1和NRT2.1的表達(dá)水平正調(diào)控硝酸鹽的低親和應(yīng)答, Atcipk8突變后抑制硝酸鹽響應(yīng)基因及硼轉(zhuǎn)運(yùn)體BOR1的表達(dá)[22]。小麥TaCIPK14、TaCIPK29和玉米ZmCIPK21被報(bào)道在鹽脅迫條件下會(huì)在鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)、ROS代謝, 鉀離子平衡和ABA信號(hào)傳導(dǎo)方面起一定作用[23-25]。水稻OsCIPK23和OsCBL1已被證實(shí)能激活水稻OsAKT1[26], 另外葡萄中的VvKT1.1和VvKT1.2也被證明在灌漿期會(huì)受到CBL和CIPK的調(diào)控[27-28]。ZmCIPK16被證明在鹽脅迫條件下能夠部分代替AtCIPK24的功能[29]。到目前為止針對(duì)CBL和CIPK開(kāi)展的主要研究領(lǐng)域聚焦在證明CBLs和CIPKs的互作以及他們互作的位置和突變體在不同逆境脅迫下的表型分析, 因此解析CBLs和CIPKs功能要基于對(duì)CIPK和CBL組成的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的充分了解, 首先要清楚CIPKs參與了哪些逆境脅迫應(yīng)答, 在哪些逆境信號(hào)通路中起作用。

已有研究表明CBL/CIPK信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)在植物對(duì)逆境應(yīng)答過(guò)程中起重要作用, 加之谷子是我國(guó)典型的抗旱耐瘠特色作物, 因此研究谷子的CIPK基因, 發(fā)掘谷子抗逆相關(guān)基因在分子水平上闡明谷子耐逆機(jī)理和調(diào)控機(jī)制具有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。目前在許多作物中均發(fā)現(xiàn)了CIPK基因家族, 谷子中僅有CBL被報(bào)道[30], CIPK基因尚未見(jiàn)被報(bào)道。本文通過(guò)生物信息學(xué)方法從谷子數(shù)據(jù)庫(kù)中得到2個(gè)谷子CIPK基因, 我們對(duì)這2個(gè)基因的結(jié)構(gòu)、序列特征進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析, 研究了它們?cè)谟酌缙诓煌婢趁{迫下的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式及在拔節(jié)、抽穗、灌漿等生育時(shí)期受到干旱脅迫時(shí)的表達(dá)情況, 旨在為進(jìn)一步分析CIPK基因在谷子逆境應(yīng)答中的功能和機(jī)制提供一些有益線索。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

以豫谷1號(hào)為試驗(yàn)材料, 當(dāng)幼苗生長(zhǎng)至三葉期時(shí)按照已有研究描述的方法[31-33]分別進(jìn)行ABA (100 μmol L–1)、低溫(4℃)、高溫(42℃)、干旱、鹽(250 mmol L–1NaCl)處理, 在處理的0、1、3、6、12和24 h取整株幼苗。另外, 當(dāng)植株生長(zhǎng)至拔節(jié)、抽穗、灌漿期時(shí), 采用自然控水方式至植株葉片微卷、葉色由鮮綠色變?yōu)榛疑尸F(xiàn)缺水狀態(tài)時(shí)取處理及對(duì)照樣品葉片, 立即在–80℃冰箱中速凍備用。試驗(yàn)設(shè)2次生物學(xué)重復(fù), 所用TRIzol、Real-time PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶、LA Taq DNA聚合酶和RNA酶抑制劑購(gòu)自寶生物工程有限公司; 引物由生工生物工程(上海)有限公司合成; 其他試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。

1.2植物總RNA的提取和引物設(shè)計(jì)

參照TRIzol試劑盒使用說(shuō)明用TRIzol試劑提取所有材料總RNA, 參照《分子克隆》第3版配制其他所需試劑[34]。根據(jù)SiCIPK、SiGAPB轉(zhuǎn)錄序列, 用軟件Primer Primer 5.0設(shè)計(jì)SiCIPK、SiGAPB的Real-time PCR和半定量PCR特異性引物。

1.3SiCIPK基因發(fā)掘和生物信息學(xué)分析

利用玉米中已鑒定CIPK基因序列進(jìn)行比對(duì), 在JGI谷子數(shù)據(jù)庫(kù)(Ver. 2.1)發(fā)現(xiàn)了2個(gè)CIPK基因(SiCIPK6、SiCIPK16)。利用ExPASy中ProtParam pI/Mw在線工具對(duì)蛋白序列的理化性質(zhì)、氨基酸組成等一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè);利用SignalP 4.1 Server進(jìn)行信號(hào)肽分析; 利用ProtScale進(jìn)行疏水性/親水性預(yù)測(cè)、Profun 2.2 Server進(jìn)行功能預(yù)測(cè);利用Psort在線工具對(duì)編碼蛋白亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè), GOR IV對(duì)蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè); 使用Blast工具在NCBI上查找氨基酸同源性序列。利用ClustalX1.83對(duì)候選基因序列比對(duì)分析, 利用Mega4.1軟件構(gòu)建不同物種CIPK基因進(jìn)化樹(shù)并比較分析[35]。

1.4半定量RT-PCR分析

用半定量RT-PCR檢測(cè)SiCIPK基因在不同生育期干旱脅迫下的表達(dá)情況。用分光光度計(jì)定量測(cè)定每個(gè)樣品總RNA的濃度和質(zhì)量?？俁NA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后對(duì)PCR條件進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化, 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)中基因PCR產(chǎn)物的線性增長(zhǎng)范圍確定循環(huán)數(shù)27, 反應(yīng)體積25 μL, PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 3 min; 94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 30 s, 27個(gè)循環(huán); 72℃ 5 min。以谷子持家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶基因B亞基(SiGAPB, Si035707m)為RT-PCR對(duì)照。反應(yīng)產(chǎn)物(15 μL)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.5Real-time PCR分析

將TRIzol法提取總RNA樣品反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 均一化后作為實(shí)時(shí)定量PCR模板, 以SiGAPB作為內(nèi)參基因。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后PCR反應(yīng)程序?yàn)? 50℃ 2 min; 95℃ 2 min; 94℃變性30 s, 61℃退火30 s, 讀版65℃ 1 s, 讀板, 40個(gè)循環(huán); 72℃延伸5 min; 繪制熔解曲線, 0.2℃ s–1。試驗(yàn)設(shè)計(jì)3次重復(fù), 采用相對(duì)定量2–ΔΔCt方法計(jì)算基因在某種逆境處理下某個(gè)時(shí)間點(diǎn)相對(duì)于對(duì)照的轉(zhuǎn)錄水平變化[36]。

2　結(jié)果與分析

2.1SiCIPK基因序列的獲得與參數(shù)分析

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)從谷子數(shù)據(jù)庫(kù)中得到2個(gè)谷子CIPK基因, 序列比對(duì)結(jié)果顯示這2個(gè)基因和玉米、水稻CIPK基因家族中的CIPK6和CIPK16同源性較高, 因此分別暫時(shí)命名為SiCIPK6和SiCIPK16。SiCIPK6基因組序列長(zhǎng)1994 bp, CDS序列1356 bp, 編碼451個(gè)氨基酸; SiCIPK16基因組序列長(zhǎng)1885 bp, CDS序列1422 bp, 編碼473個(gè)氨基酸(表1), 2個(gè)基因均無(wú)可變剪切和內(nèi)含子。功能域分析顯示2個(gè)基因蛋白都含有NAF結(jié)構(gòu)域(與CBL蛋白互作的必需), 另外還含有絲氨酸/蘇氨酸激酶域、ATP結(jié)合位點(diǎn)、蛋白磷酸化位點(diǎn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)位點(diǎn)等多個(gè)CIPK基因的特征結(jié)構(gòu)域。因此推斷SiCIPK6和SiCIPK16是谷子CIPK家族中的2個(gè)成員。

2.2SiCIPK基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1SiCIPK蛋白參數(shù)分析SiCIPK6蛋白分子式為C2149H3453N641O628S16, 分子量為48.83 kD, 等電點(diǎn)(pI) 9.14, 平均疏水性(GRAVY) –0.197, 脂肪系數(shù)(AI) 86.08。SiCIPK16蛋白分子式為C2266H3620N664O664S18, 分子量為51.37 kD, 等電點(diǎn)(pI) 8.81, 平均疏水性(GRAVY) –0.125,脂肪系數(shù)(AI) 87.27。GOR IV軟件預(yù)測(cè)2個(gè)蛋白無(wú)規(guī)則卷曲所占的比例最高, 其次是α-螺旋和延伸鏈, 不含β-螺旋。根據(jù)SignalP 4.1 Server軟件預(yù)測(cè)結(jié)果可推測(cè)SiCIPK6 和SiCIPK16基因所編碼的蛋白不存在信號(hào)肽為非分泌蛋白, 它們?cè)诩?xì)胞質(zhì)中合成后可能不被運(yùn)轉(zhuǎn)。ProtScale軟件預(yù)測(cè)2個(gè)蛋白均為弱親水性蛋白。Psort軟件預(yù)測(cè)SiCIPK6蛋白據(jù)其概率大小依次可能存在于質(zhì)膜、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(膜)、微體(過(guò)氧物酶體); 而SiCIPK16蛋白可能存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(膜)、質(zhì)膜、微體(過(guò)氧物酶體)、葉綠體類囊體膜。

2.2.2谷子SiCIPK基因啟動(dòng)子區(qū)域順式元件分析和功能預(yù)測(cè)順式元件分析發(fā)現(xiàn)在SiCIPK6和SiCIPK16啟動(dòng)子區(qū)域主要包括激素類應(yīng)答元件, 逆境類應(yīng)答元件, 光應(yīng)答元件以及其他類元件, 包括厭氧誘導(dǎo)必需(ARE)、細(xì)菌激發(fā)應(yīng)答(Box-Wi)、分生組織特異性激活(CCGTCC-box)、胚乳表達(dá)(GCN4-motif、SKn-1 motif)、晝夜節(jié)律(circadian)元件(表2)。Profun 2.2 Server軟件預(yù)測(cè)顯示SiCIPK6和SiCIPK16可能參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境應(yīng)答、免疫應(yīng)答等生理過(guò)程, 也可能參與生長(zhǎng)因子、激素、離子通道蛋白、受體、結(jié)構(gòu)蛋白等代謝途徑。

2.3不同非生物逆境脅迫下SiCIPK基因表達(dá)分析

圖1所示在5種脅迫處理下2個(gè)基因在不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量不盡相同, 總的來(lái)看在誘導(dǎo)過(guò)程中表達(dá)量均有所上調(diào)。SiCIPK6基因在ABA、干旱和NaCl處理時(shí)表達(dá)量上調(diào)幅度較大, 分別在1、24、1 h達(dá)到表達(dá)量的最大值, 相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照的4.65、6.42、7.46倍。SiCIPK16基因在低溫、干旱和高溫處理時(shí)表達(dá)量上調(diào)幅度較大, 在1、24、1 h達(dá)到表達(dá)量的最大值, 相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照的4.39、4.19、2.56倍。

2.4SiCIPK基因在不同生育期干旱脅迫下的表達(dá)

分別在豫谷1號(hào)生長(zhǎng)至拔節(jié)、孕穗、灌漿期時(shí)采用自然干旱方法取對(duì)照和干旱處理樣品葉片提取總RNA, 合成cDNA經(jīng)均一化和半定量PCR后, 檢測(cè)SiCIPK6和SiCIPK16樣在不同生育期干旱脅迫下的表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果表明SiCIPK6和SiCIPK16兩個(gè)基因在拔節(jié)、孕穗、灌漿期對(duì)照中均有表達(dá), 而在相應(yīng)生育時(shí)期受到干旱脅迫時(shí)它們表達(dá)量均有所提高(圖2)。

表2　SiCIPK6、SiCIPK16基因啟動(dòng)子區(qū)域順式元件預(yù)測(cè)Table 2　Putative cis-elements in the promoter of SiCIPK6 and SiCIPK16

圖1　SiCIPK6和SiCIPK16在ABA、低溫、干旱、高溫和鹽處理下的Real-time PCR表達(dá)分析Fig. 1　Real-time PCR analysis of expression levels of the SiCIPK6 and SiCIPK16 under ABA, cold, dehydration, heat, and salt stresses treatments

圖2　SiCIPK6和SiCIPK16基因在不同生育期自然脫水脅迫下的表達(dá)分析Fig. 2　Electrophoretogram displaying the loading patterns for expression of SiCIPK6 and SiCIPK16 under dehydration stresses in different growth periods

3　討論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法得到抗旱耐瘠作物谷子的2個(gè)CIPK基因, SiCIPK6基因編碼451個(gè)氨基酸, Si-CIPK16基因編碼473個(gè)氨基酸, 2個(gè)基因內(nèi)部沒(méi)有內(nèi)含子和可變剪切。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)它們與植物中的CIPK基因有較高同源性, 同時(shí)含有CIPK基因的標(biāo)志結(jié)構(gòu)域NAF-motif。功能域分析顯示SiCIPK6、SiCIPK16含有CIPK蛋白C端調(diào)控域、絲氨酸/蘇氨酸激酶催化域等CIPK蛋白特有的保守功能域, 因此推斷這2個(gè)基因?qū)儆诠茸覥IPK家族中的2個(gè)成員。用ClustalX1.83比較不同物種中CIPK蛋白序列, 發(fā)現(xiàn)SiCIPK6、SiCIPK16與擬南芥、水稻和玉米中同源CIPK基因同源性非常高,而且具有非常保守的序列和結(jié)構(gòu)。如圖3所示所有CIPK基因在C端調(diào)控域、N端激酶域、NAF結(jié)構(gòu)域、激活環(huán)結(jié)構(gòu)域、磷酸化和自磷酸化位點(diǎn)處序列高度一致, 非常保守。分析發(fā)現(xiàn)SiCIPK6與ZmCIPK6、OsCIPK6一致性分別為77.73％和72.17％, 與AtCIPK6一致性為52.49％; SiCIPK16與ZmCIPK16、OsCIPK16一致性分別為78.73％ 和74.55％, 與AtCIPK16一致性為45.33％。谷子中CIPK與水稻、玉米一致性要比谷子CIPK與擬南芥CIPK一致性高, 這與谷子與玉米、水稻親緣關(guān)系相對(duì)較近的現(xiàn)象是一致的(谷子、玉米、水稻同屬禾本科單子葉作物, 擬南芥屬十字花科雙子葉作物)。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中SiCIPK6、SiCIPK16分別和玉米、水稻相應(yīng)基因聚在一起也驗(yàn)證了這一結(jié)論, 另外發(fā)育樹(shù)中除小立碗蘚中的PpCIPK6外,其他物種的CIPK6和CIPK16大都聚集在一起, 這也說(shuō)明CIPK6和CIPK16這2個(gè)基因的祖先在單雙子葉植物分離之前就已存在。這些證明我們發(fā)現(xiàn)的SiCIPK6、SiCIPK16是植物CIPK家族中的2個(gè)成員, 它們和其他植物CIPK基因一樣具有非常保守的序列和結(jié)構(gòu)。SiCIPK6、SiCIPK16和玉米、水稻中相應(yīng)基因同源性較高一方面說(shuō)明谷子和玉米、水稻具有較近的親緣關(guān)系, 另一方面也暗示它們?cè)谀婢硲?yīng)答或其他信號(hào)通路中可能有相似的功能。

圖3　SiCIPK6、SiCIPK16與其他已知CIPK氨基酸序列比對(duì)Fig. 3　Sequences alignment of SiCIPK6, SiCIPK16 and other known CIPKs

另外, 我們對(duì)這2個(gè)基因的生物信息學(xué)特征進(jìn)行了系統(tǒng)的預(yù)測(cè)和分析, 希望能夠發(fā)掘?qū)ρ芯克鼈兊墓δ苡袔椭男畔?。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示SiCIPK6和SiCIPK16很多性狀和參數(shù)非常接近類似, 這些結(jié)論不僅驗(yàn)證了它們同屬CIPK基因家族, 而且預(yù)示SiCIPK6和SiCIPK16可能共同參與或調(diào)控某些信號(hào)途徑。順式元件分析和功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示SiCIPK6和SiCIPK16基因可能會(huì)參與ABA或其他激素介導(dǎo)的生理生化過(guò)程, 預(yù)測(cè)的部分功能和已證實(shí)的不同物種中CIPK基因功能是相吻合的, 已有研究結(jié)果也表明CIPK基因在逆境應(yīng)答中起重要作用[9,12-13,41], 因此我們用ABA (100 μmol L–1)、低溫(4℃)、高溫(42℃)、干旱、高鹽(250 mmol L–1NaCl)處理谷子豫谷1號(hào)幼苗, 用Real-time PCR分析他們?cè)诓煌幚硐碌谋磉_(dá)情況。結(jié)果表明2個(gè)谷子SiCIPK基因在5種脅迫處理下不同時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)量均有所上調(diào)或下調(diào), 但具體動(dòng)態(tài)表達(dá)模式不盡相同, 例如SiCIPK6基因在ABA脅迫下, 表達(dá)量在1 h迅速增加到最大值, 為對(duì)照的4.65倍, 隨后3～24 h表達(dá)水平逐漸下降; 在干旱誘導(dǎo)脅迫下1 h表達(dá)量快速增加, 3 h表達(dá)量急劇減少, 6 h又明顯上升, 12 h有所減少, 在24 h又反彈到最高值, 為對(duì)照的6.42倍。整體來(lái)看SiCIPK6基因在ABA、干旱和NaCl處理時(shí)表達(dá)量上調(diào)幅度較大,相對(duì)表達(dá)量最高時(shí)分別是對(duì)照的4.65、6.42、7.46倍。SiCIPK16基因在低溫、干旱和高溫處理時(shí)表達(dá)量上調(diào)幅度較大, 相對(duì)表達(dá)量在最高點(diǎn)時(shí)分別是對(duì)照的4.39、4.19、2.56倍。這些試驗(yàn)結(jié)果與它們?cè)跀M南芥、水稻和玉米中的同源基因有著相似的結(jié)論, 在擬南芥中AtCIPK6表達(dá)量受鹽、滲透脅迫和ABA誘導(dǎo), AtCIPK16對(duì)鹽有強(qiáng)烈應(yīng)答, 進(jìn)一步研究表明AtCIPK6參與了鹽、滲透脅迫以及ABA應(yīng)答過(guò)程, AtCIPK16在細(xì)胞內(nèi)Na+外排方面起一定作用[37-39]。水稻中的同源基因OSCIPK6受干旱、ABA和低溫誘導(dǎo), OSCIPK16受NaCl、ABA、PEG、Cold誘導(dǎo), 分析表明它們可能參與干旱、低溫、鹽等逆境脅迫和ABA應(yīng)答[41]。玉米中的同源基因ZmCIPK16受NaCl、20％PEG、高溫、ABA、干旱的強(qiáng)烈誘導(dǎo), 但卻不受低溫脅迫誘導(dǎo), 進(jìn)一步試驗(yàn)表明, ZmCIPK16在鹽脅迫條件下能夠部分代替AtCIPK24的功能, 在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株能部分互補(bǔ)野生型植株表型[29]。這些結(jié)論可能暗示SiCIPK6和SiCIPK16與其他物種中的同源基因有相似或部分相似的功能, 可能參與了干旱、低溫、鹽、高溫以及ABA的應(yīng)答, 但在不同的逆境應(yīng)答過(guò)程中具體參與調(diào)控模式有所不同。

由于SiCIPK6和SiCIPK16均在干旱誘導(dǎo)下表達(dá)量上調(diào)幅度較大, 因此我們進(jìn)一步用半定量方法研究了SiCIPK6和SiCIPK16在拔節(jié)、孕穗、灌漿期期干旱脅迫下的表達(dá)情況。如圖所示, SiCIPK6在拔節(jié)、孕穗、灌漿期對(duì)照中均有表達(dá), 表達(dá)量為拔節(jié)期>孕穗期>灌漿期,在受到干旱脅迫時(shí), SiCIPK6表達(dá)量受誘導(dǎo)迅速增加, 表達(dá)量為拔節(jié)期>孕穗期>灌漿期。SiCIPK16在拔節(jié)、孕穗、灌漿期對(duì)照中也均有表達(dá), 在3個(gè)時(shí)期表達(dá)量基本一致,在受到干旱脅迫時(shí), SiCIPK16表達(dá)量受誘導(dǎo)迅速增加, 拔節(jié)期和孕穗期表達(dá)量上調(diào)幅度較大, 灌漿期上調(diào)幅度稍微小一些。SiCIPK6和SiCIPK16在不同生育時(shí)期受到干旱脅迫后表達(dá)量迅速上調(diào)說(shuō)明SiCIPK6和SiCIPK16基因

可能參與了谷子在拔節(jié)、孕穗、灌漿期的干旱應(yīng)答。這些試驗(yàn)結(jié)論與我們的順式元件預(yù)測(cè)和功能預(yù)測(cè)分析結(jié)論以及其他物種中相應(yīng)同源基因報(bào)道是一致的(表1)。另外在2個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)域還發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲(CGTCA-motif、TGACG-motif)、植物激素(TGA)、水楊酸(TCA-element、胚乳表達(dá)(SKn-1 motif)、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控(O2-site)、缺氧特異性誘導(dǎo)(GC-motif)、分生組織表達(dá)(CAT-box)、分生組織特異性激活(CCGTCC-box)、細(xì)菌激發(fā)應(yīng)答(Box-Wi)、厭氧誘導(dǎo)必需(ARE), 這些順式元件的存在暗示SiCIPK6和SiCIPK16可能參與相應(yīng)的生理生化過(guò)程。值得一提的是在啟動(dòng)子區(qū)域還發(fā)現(xiàn)了大量的光應(yīng)答元件和晝夜節(jié)律調(diào)控(circadian)核心元件, 眾所周知谷子是光溫敏感性作物, 預(yù)示SiCIPK6和SiCIPK16可能參與調(diào)控谷子的光溫應(yīng)答調(diào)控。盡管這些推測(cè)都需要嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑囼?yàn)證明, 但還是為我們今后的功能研究提供了一些線索。

本文報(bào)道的谷子SiCIPK基因豐富和完善了植物CIPK成員, 為進(jìn)一步闡明CBL/CIPK信號(hào)系統(tǒng)在谷子逆境應(yīng)答中的功能、機(jī)制提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151207.1121.018.html

Expression Analysis of Two CIPK genes under Abiotic Stress in Foxtail Millet

YU Ai-Li1,2, ZHAO Jin-Feng1,2, WANG Gao-Hong2, DU Yan-Wei2, LI Yan-Fang2, ZHANG Zheng2, GUO Er-Hu2, and LIANG Ai-Hua1,*
1Insitute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China;2Millet Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences / Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Breeding in Minor Crops, Changzhi 046011, China

Abstract:CIPK (CBL interacting protein kinase) is a type of serine or threonine protein kinases, which plays an important role in response to stress. In this study, we identified two CIPK genes designated as SiCIPK6 and SiCIPK16 from foxtail millet (Setaria italica) genome using bioinformatics methods. The sequence analysis showed that SiCIPK6 has a length of 1994 bp in the genome, encoding 513 amino acids residues, and SiCIPK16 is 1885 bp, encoding 473 amino acids residues. These two genes have no alternative splicing and intron. The characters predicted based on the bioinformatics analysis revealed that the protein sequences and structure of the two SiCIPK genes were very conservative just like CIPK genes in other species. Real-time PCR analysis discovered that the expression of SiCIPK6 and SiCIPK16 was up-regulated by ABA, cold, heat, drought and salt stress, respectively. The expression was strongly induced by ABA, drought and salt treatments for SiCIPK6, and by cold, drought and heat treatments for SiCIPK16. The semi-quantitative PCR analysis showed that SiCIPK6 and SiCIPK16 were expressed at the jointing, booting and filling stages, and induced by drought stress in the corresponding growth period. Foxtail millet CIPK genes reported in this study would enrich CIPK members in plant kingdom and provides important information for further elucidating the function and mechanisms of the CBL/CIPK network system responsive to stresses in foxtail millet.

Keywords:Foxtail millet; Calcineurin B-like-interacting protein kinase gene; Stress

收稿日期Received(): 2015-07-20; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2015-12-07.

通訊作者*(Corresponding author): 梁愛(ài)華, E-mail: aliang@sxu.edu.cn

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00295