血清miRNA-744檢測(cè)在胃癌診斷中的意義

蔣曉婷，夏英捷

（浙江省人民醫(yī)院，浙江 杭州310014）

·臨床研究·

血清miRNA-744檢測(cè)在胃癌診斷中的意義

蔣曉婷，夏英捷

（浙江省人民醫(yī)院，浙江 杭州310014）

目的 探討檢測(cè)血清miR-744水平在胃癌診治中的作用。 方法 以2008年1月至2010年12月在浙江省人民醫(yī)院接受手術(shù)的胃癌患者219例為研究對(duì)象，另選取160例健康體檢者作為對(duì)照組。采用qRT-PCR方法檢測(cè)血清miR-744的表達(dá)量、電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清CEA和CA19-9水平，比較胃癌患者與健康體檢者血清miR-744、CEA和CA19-9水平差異，分析miR-744表達(dá)與胃癌臨床病理及預(yù)后的關(guān)系，并就miR-744水平對(duì)胃癌的診斷意義行ROC曲線分析。 結(jié)果 胃癌患者血清miR-744表達(dá)量明顯高于健康體檢者（P<0.001），其表達(dá)與胃癌的腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、分化程度、TNM分期以及預(yù)后相關(guān)。ROC曲線分析表明，miR-744以表達(dá)量3.5為臨界值時(shí)，對(duì)胃癌的診斷敏感性為86.9%，特異性為64.0%，曲線下面積0.762。術(shù)后監(jiān)測(cè)表明，胃癌根治性切除術(shù)后血清miR-744下降。結(jié)論 血清miR-744是一個(gè)潛在的胃癌血清標(biāo)志物，對(duì)胃癌的診斷和隨訪具有臨床意義。

miRNA-744；胃癌；診斷；隨訪

胃癌是全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，居各種惡性腫瘤死因的第二位。迄今為止，尚未找到對(duì)胃癌診治靈敏度和特異性均較為理想的標(biāo)志物。傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物如CEA、CA19-9、CA125、CA72-4等在胃癌診斷中的靈敏度約為10%～40%，特異性也不高，而且各種腫瘤標(biāo)志物在病程分析、治療指導(dǎo)、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、判斷預(yù)后等方面也不能滿足臨床需要。因此，尋找體液尤其是血液中胃癌特異性標(biāo)志物是胃癌研究工作的重點(diǎn)之一。microRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，能通過(guò)與靶mRNA 3'端非編碼區(qū)完全或部分互補(bǔ)結(jié)合引起靶mRNA降解或抑制其翻譯，從而對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[1]。MicroRNA涉及一系列生物過(guò)程包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡等[2]。microRNA作為癌基因或抑癌基因在腫瘤形成中扮演著重要作用[3-4]。本研究采用熒光定量PCR對(duì)胃癌患者及健康體檢者的血清miR-744水平進(jìn)行比較，分析血清miR-744對(duì)胃癌診斷、術(shù)后隨訪及預(yù)后評(píng)估的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2008年1月~2010年12月浙江省人民醫(yī)院219例胃癌患者的臨床資料。所有患者術(shù)前均未接受化療和放療，其中男144例，女75例，年齡35~82歲，平均（52.1±12.6）歲。依據(jù)組織分化程度分為高中分化癌97例，低分化及未分化癌122例；按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）2010版關(guān)于TNM分期進(jìn)行分期∶Ⅰ期29例，Ⅱ期53例，Ⅲ期91例，Ⅳ期46例；T1~T2期71例，T3~T4期148例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移150例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移31例。同期采集160例體檢健康者作為對(duì)照組，對(duì)照組均無(wú)腫瘤病史和腫瘤家族遺傳史。

1.2 方法 采集研究對(duì)象靜脈全血于抗凝管中，1小時(shí)內(nèi)，4℃，離心（2000×g）10分鐘后，取上清液分為2份∶1份至無(wú)RNA酶的試管中，4℃，再次離心（2000×g）10分鐘，然后吸取上清液至無(wú)RNA酶的試管中，-80℃保存；1份當(dāng)日行CEA和CA19-9測(cè)定。所有胃癌患者于術(shù)前采血，其中部分Ⅰ~Ⅲ期患者于術(shù)后1周、2周、1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月接受連續(xù)檢測(cè)。

1.2.1 qRT-PCR檢測(cè)血清miR-744水平 （1）RNA提取及質(zhì)檢。取300μL血漿，按照MirVana PARIS試劑盒（美國(guó)Ambion公司）說(shuō)明提取總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳分析提取質(zhì)量。（2）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按照TaqMan microRNA Assays（美國(guó)Applied Biosystems公司）說(shuō)明書(shū)操作，將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（其中引物及探針序列由Applied Biosystems提供）。（3）PCR反應(yīng)。以cDNA為模板，使用TaqMan microRNA Assays中的PCR引物探針混合液進(jìn)行PCR擴(kuò)增及熒光定量檢測(cè)，反應(yīng)體系包括TaqMan2×通用的PCR擴(kuò)增預(yù)混試劑10μL、無(wú)核酸酶水7.67μL、PCR引物（20×）1.0μL及逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（1∶15）1.33μL，共40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。RNU6B作為內(nèi)參。2-△CT法計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2 CEA和CA19-9水平測(cè)定 采用生物素化的單克隆抗體與釕物質(zhì)標(biāo)記的特異性單克隆抗體雙抗體夾心法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)儀器為羅氏公司COBAS 8000-e602電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。CEA正常值小于5.0μg/L，CA19-9正常值小于37 U/mL。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以（）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，采用χ2檢驗(yàn)評(píng)估m(xù)iR-744表達(dá)與胃癌臨床病理及預(yù)后之間的關(guān)系，生存率比較采用Kaplan-Meier法并作log-rank檢驗(yàn)?；颊咝g(shù)后接受定期隨訪，隨訪截至2016年1月。

2 結(jié)果

2.1 血清miR-744的表達(dá) 胃癌患者血清中miR-744相對(duì)表達(dá)量為4.47±3.20，明顯高于正常對(duì)照組的1.80±1.04（P＜0.01）。采用（x±2s）確定160例對(duì)照組血清miR-744的相對(duì)表達(dá)量cut-off值為3.5，在219例胃癌中，有92例血清miR-744高于此cut-off值，陽(yáng)性率為42.0%（92/129），而對(duì)照組陽(yáng)性率為 13.1%（21/160），兩組陽(yáng)性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。對(duì)血清miR-744檢測(cè)在胃癌組及對(duì)照組的ROC曲線分析顯示，ROC曲線下面積為0.762，敏感性86.9%，特異性64.0%，提示血清miR-744測(cè)定能較準(zhǔn)確地區(qū)別胃癌與正常對(duì)照者（圖1）。

圖1 胃癌組和對(duì)照組血清miR-744檢測(cè)的ROC曲線

2.2 血清miR-744表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系以正常人血清miR-744相對(duì)表達(dá)量cut-off值3.5為標(biāo)準(zhǔn)，將219例胃癌按血清miR-744相對(duì)表達(dá)量分為高表達(dá)組（≥3.5）和低表達(dá)組（＜3.5），結(jié)果提示，血清miR-744表達(dá)水平與胃癌的腫瘤大小、分化程度、浸潤(rùn)深度及TNM分期有關(guān)系，詳見(jiàn)表1。

表1 血清miR-744表達(dá)水平與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系

2.3 血清miR-744相對(duì)表達(dá)量與胃癌預(yù)后的關(guān)系血清miR-744相對(duì)表達(dá)量≥3.5的胃癌患者5年生存率為20.7%（19/92），而miR-744相對(duì)表達(dá)量＜3.5的患者5年生存率為43.3%（55/127），兩組生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），詳見(jiàn)圖3。

圖3 血清miR-744高表達(dá)和低表達(dá)胃癌生存曲線

2.4 不同分期胃癌血清中miR-744、CEA與CA19-9以miR-744相對(duì)表達(dá)量≥3.5 （正常人cut-off為3.5）、CEA和CA19-9高于正常值 （CEA＞5.0μg/L、CA19-9＞37U/mL）為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)219例胃癌中miR-744、CEA和CA19-9升高的病例進(jìn)行比較。結(jié)果提示，除Ⅰ期miR-744陽(yáng)性率和CA19-9陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各期胃癌中miR-744陽(yáng)性率均高于CEA和CA199，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。詳見(jiàn)表2。

表2 血清miR-744、CEA、CA19-9與胃癌分期關(guān)系（%）

3 討論

miR-744定位于染色體17p12。組織學(xué)水平研究已證明，miR-744在頭頸部癌、前列腺癌和鼻咽癌中異常高表達(dá)[5-7]，而在肝癌中低表達(dá)[8]。在血清學(xué)水平，Miyamae等[9]報(bào)道，血清miR-744可用于胰腺癌的早期篩查、術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)、預(yù)期預(yù)后及是否對(duì)吉西他濱化療抵抗等。miRNA在胃癌中異常表達(dá)，且體內(nèi)、外多個(gè)研究已證明miRNA在胃癌的形成中有不可或缺的作用[10-11]。Song等[12]對(duì)胃癌患者血漿中上調(diào)的16種miRNAs研究發(fā)現(xiàn)，miR-221、miR-376c和miR-744具有潛在的診斷早期胃癌的價(jià)值，且它們?cè)诜只畹奈赴┲斜磉_(dá)水平更高。

本研究提示，miR-744在胃癌患者外周血中的表達(dá)量明顯高于體檢健康者；ROC曲線分析也表明，血清miR-744測(cè)定能較準(zhǔn)確地診斷胃癌，結(jié)果與Song[12]報(bào)道一致，ROC曲線下面積為0.762，敏感性為86.9%，特異性為64.0%。另外，本組結(jié)果提示，血清miR-744表達(dá)水平與胃癌的腫瘤大小、分化程度、浸潤(rùn)深度及TNM分期有關(guān)系。作者還對(duì)血清miR-744、CEA和CA19-9在不同TNM分期胃癌中的陽(yáng)性率進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)胃癌患者中血清miR-744陽(yáng)性率基本高于CEA和CA19-9，除Ⅰ期miR-744陽(yáng)性率和CA19-9陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外。故miR-744對(duì)胃癌的發(fā)現(xiàn)要優(yōu)于CEA和CA19-9。

為明確血清miR-744與胃癌預(yù)后的關(guān)系，本研究對(duì)胃癌患者的隨訪發(fā)現(xiàn)，血清miR-744高表達(dá)患者5年生存率明顯低于miR-744低表達(dá)者（P＜0.01），對(duì)手術(shù)切除后的胃癌患者血清miR-744連續(xù)監(jiān)測(cè)顯示，術(shù)前miR-744水平高的患者，腫瘤切除后其水平也隨之降低；而術(shù)后miR-744水平再度升高時(shí)，則大多有腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移發(fā)生，提示miR-744水平可能與腫瘤負(fù)荷相關(guān)，監(jiān)測(cè)其變化可評(píng)估胃癌的病期及預(yù)后。

對(duì)miR-744分子功能的研究表明，在不同類型的腫瘤中，miR-744的作用并不相同。miR-744通過(guò)過(guò)表達(dá)cyclin-B1促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖[7]，通過(guò)與ARHGAP5的直接作用對(duì)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)揮增殖效能[6]。而在乳腺癌中，miR-744則通過(guò)下調(diào)eEF1A2抑制腫瘤細(xì)胞增殖，發(fā)揮腫瘤抑制作用[13]。有關(guān)miR-744對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響及其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] Ma YY，Tao HQ.Microribonucleic acids and gastric cancer. Cancer Sci，2012，103（4）∶620

[2] Bartel DP.MicroRNAs∶genomics，biogenesis，mechanism，and function.Cell，2004，116（2）∶281

[3] Iorio MV，Croce CM.MicroRNAs in cancer∶small molecules with a huge impact.J Clin Oncol，2009，27（34）∶5848

[4] Iorio MV，Croce CM.MicroRNA dysregulation in cancer∶diagnostics，monitoring and therapeutics.A comprehensive review.EMBO Mol Med，2012，4（3）∶143

[5] Nurul-Syakima AM，Yoke Kqueen C，Sabariah AR，et al. DifferentialmicroRNA expression and identification of putative miRNA targets and pathways in head and neck cancers.Int J Mol Med，2011，28（3）∶327

[6] Fang Y，Zhu X，Wang J，et al.MiR-744 functions as a protooncogene in nasopharyngealcarcinoma progression and metastasis via transcriptional control of ARHGAP5. Oncotarget，2015，6（15）∶13164

[7] Huang V，Place RF，Portnoy V，et al.Upregulation of Cyclin B1 by miRNA and its implications in cancer.Nucleic Acids Res，2012，40（4）∶695

[8]Tan YL，Bai ZG，Zou WL，et al.miR-744 is a potential prognostic marker in patients with hepatocellular carcinoma. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology，2015，39（3）∶359

[9] Miyamae M，Komatsu S，Ichikawa D.Plasma microRNA profiles∶identification of miR-744 as a novel diagnostic and prognostic biomarker in pancreatic cancer.Br J Cancer，2015，113（10）∶1467

[10]Tsai MM，Wang CS，Tsai CY，et al.Circulating microRNA-196a/b are novelbiomarkersassociated with metastatic gastric cancer.Eur J Cancer，2016，64∶137

[11]Tang R，Yang C，Ma X，et al.MiR-let-7a inhibits cell proliferation，migration，and invasion by down-regulating PKM2 ingastric cancer.Oncotarget，2016，7（5）∶5972

[12]SongMY，PanKF，SuHJ，etal.Identificationofserum microRNAs as novel non-invasive biomarkers for early detection of gastric cancer.PLoS One，2012，7（3）∶e33608

[13]Vislovukh A，Kratassiouk G，Porto E，et al.Proto-oncogenic isoform A2 of eukaryotic translation elongation factor eEF1 is a target of miR-663 and miR-744.Br J Cancer，2013，108（11）∶2304