基于微衛(wèi)星標記建立翹嘴鱖親子鑒定技術

成為為，楊　凱，高銀愛，朱思華，李　波，王青云，羅　峰，夏儒龍，程穎紅，

鄧國喬，鄭翠華

(武漢市水產科學研究所，武漢市農業(yè)科學技術研究院，武漢　430207)

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基于微衛(wèi)星標記建立翹嘴鱖親子鑒定技術

成為為，楊凱，高銀愛，朱思華，李波，王青云，羅峰，夏儒龍，程穎紅，

鄧國喬，鄭翠華

(武漢市水產科學研究所，武漢市農業(yè)科學技術研究院，武漢430207)

摘要：利用9個多態(tài)性較高的微衛(wèi)星標記對翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)進行親子鑒定分析。結果顯示，22個家系翹嘴鱖個體中共觀測到95個等位基因，其觀測雜合度和期望雜合度的平均值(范圍)分別為0.578(0.219~0.800)和0.607(0.200~0.806)，多態(tài)信息含量(范圍)為0.552(0.187~0.787)。通過軟件Cervus統(tǒng)計分析得到9個微衛(wèi)星座位累計排除率為99.9658%，在27個可能的父母對條件下，混養(yǎng)養(yǎng)殖家系后代個體鑒定準確率為91%，研究結果表明篩選的這些多態(tài)微衛(wèi)星分子標記可以用于翹嘴鱖優(yōu)勢家系的鑒定和分離，通過驗證的微衛(wèi)星標記建立的親子鑒定技術為基礎選育翹嘴鱖生長速度快的優(yōu)勢家系，為培育出生長速度快、抗病力強的翹嘴鱖新品種奠定基礎。

關鍵詞：翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)；微衛(wèi)星標記；親子鑒定；家系選育

翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)為我國淡水名優(yōu)魚類。自鱖人工繁殖成功以來，翹嘴鱖人工養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴大，但繁養(yǎng)單位不注重鱖親魚選育和保種工作，在繁殖過程中近親繁殖嚴重，導致養(yǎng)殖群體種質資源退化、抗病力下降等。培育抗病能力強、生長速度快的優(yōu)勢品種是鱖養(yǎng)殖產業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展亟待解決的重要課題之一。在實際的養(yǎng)殖實施過程中，若通過分池飼養(yǎng)可保證準確的家系信息，卻存在占用空間大、管理強度大等問題，最重要的是不同的養(yǎng)殖環(huán)境對性狀的影響會導致遺傳性狀參數的估計誤差。

目前，親子鑒定技術在水產動物中已得到廣泛的應用，關于親子鑒定準確率的研究已經有很多報道，在水產動物如鳀(Engraulisencrasicolus)[1]、鮑魚(Haliotisdiscushanna)[2]、綠蚌貝(Pernacanaliculus)[3]、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[4]、日本對蝦(Penaeusjaponicus)[5]等水產動物親子關系鑒定中也有相應的應用。水產動物早期親子鑒定的遺傳標記主要有同功酶電泳、隨機擴增多態(tài)性DNA標記(RAPD)和限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)，但存在多態(tài)信息含量相對較低，以及重復性、穩(wěn)定性和可比性相對較差的問題。高度變異的微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)具有檢出率高、信息量大、高度保守、共顯性遺傳、遺傳穩(wěn)定、遵循孟德爾遺傳規(guī)律且檢測方便快速等特點就成為最有效的分子遺傳標記[6]，在種質資源調查、遺傳多樣性評估和系譜鑒定中顯示了強大的確證作用[7]，可用于確定其父母本、分析家系譜系和確證種屬關系[8-9]。Dena等[10]的研究更證實微衛(wèi)星標記在沒有外部物理標記的人工混合養(yǎng)殖情況下也可以區(qū)分出混養(yǎng)群體所屬的正確家系。本研究以武漢市水產科學研究所通過家系選育的翹嘴鱖個體為實驗材料，選取微衛(wèi)星標記在翹嘴鱖家系譜系鑒定中進行應用，利用9對高度多態(tài)的翹嘴鱖微衛(wèi)星標記，通過計算機軟件模擬分析，摸索微衛(wèi)星親子鑒定的條件，以及親子鑒定在翹嘴鱖譜系鑒定中的應用條件及價值，為翹嘴鱖新品種的選育提供分子生物學理論依據。

1材料和方法

1.1實驗材料

2010年5月，課題組分別從廣東省佛山市南海區(qū)石啃魚苗場和武漢市佳恒水產有限公司引進種苗5 000尾，選留500尾具備生長優(yōu)勢的個體作為廣東養(yǎng)殖群體建系親本和湖北養(yǎng)殖群體建系親本；2012年3月從湖北省嘉魚縣長江白沙洲段捕撈50尾1 kg以上的2齡個體作為野生群體的建系親本。2014年4月，18尾翹嘴鱖繁殖親魚(來自湖北群體、廣東群體和野生群體雌性和雄性各3尾)通過人工繁殖獲得27個翹嘴鱖全同胞家系，剛開始各個家系分開養(yǎng)殖，待苗長到2 cm時，在每個家系取2尾確定親緣關系用于驗證微衛(wèi)星標記親子鑒定技術的可靠性。隨后將所有家系后代個體在各個家系取1 000尾子代個體樣本后進行混池養(yǎng)殖，并且在相同的條件下進行飼養(yǎng)，待子代個體長到12月時，所有子代個體全部起塘，選取具有生長優(yōu)勢的個體274尾(體重大于500 g)剪鰭條用無水乙醇保存，并在背部掛上數字掛牌標志用于區(qū)分選育的家系個體。

1.2PCR擴增及電泳檢測

DNA提取采用試劑盒法提取基因組DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后稀釋到約100 ng/μL用于PCR擴增。實驗先選取34個翹嘴鱖微衛(wèi)星標記用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行多態(tài)性篩選，隨后選取其中9對多態(tài)性高的微衛(wèi)星標記[11-12]合成熒光引物(FAM和HEX)，在各自特定的退火溫度下進行PCR擴增，PCR擴增體系和反應程序如下，PCR反應體系為25 μL：TaqDNA聚合酶0.5 μL(1 U/μL)，10×TaqBuffer 2.5 μL，MgCl22.5 μL，dNTP 0.5 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，DNA 100 ng。擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，退火40 s(各引物最適退火溫度見表1)，72 ℃延伸45 s，38個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物經自動測序儀ABI 3730 xl(Rox-500 standard)測序并用軟件GENEMAPPER V.4.0[13]讀取等位基因大小。

1.3家系鑒定分析

利用軟件Cervus 2.0[14]分析各個基因座上的等位基因頻率、觀測雜合度Ho和期望雜合度He、多態(tài)信息含量PIC、非親權排除率(NEP)和累計非親權排除率(CEP)，檢測微衛(wèi)星位點是否符合Hardy-Weinberg平衡及各位點無效等位基因頻率，再以父母本雙盲建模(simulation)模擬運行10 000次得到Delta分布值，以每個候選父母的LOD(the nature log of the overall Likelihood atio)值進行親子鑒定分析[15]。

2結果與分析

2.1微衛(wèi)星座位模擬分析

實驗所用9對微衛(wèi)星引物均能擴增出目的條帶，9個微衛(wèi)星標記分析檢測得到95個等位基因。其中等位基因數最少的為座位MDJ879和DQ789303，最多的為座位D290和D295，均檢測到17個等位基因(如表1)，其中的6對標記聚丙烯酰胺凝膠電泳結果如圖1所示，微衛(wèi)星測序圖如圖2所示。其觀測雜合度為0.219~0.800(平均值為0.578)，期望雜合度為0.200~0.806(平均值為0.607)，多態(tài)性信息含量為0.187~0.787(平均值為0.552)，所有座位均不偏離Hardy-Weinberg指數。微衛(wèi)星標記主要多態(tài)性參數見表1，非親排除率(NEP)和累積非親權排除率(CEP)見表2。

表1　本研究所用的9個微衛(wèi)星引物的主要多態(tài)性參數和Hardy-Weinberg檢測結果

注：NS表示未顯著偏離 Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)；

圖1　部分引物篩選聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖2　翹嘴鱖微衛(wèi)星座位基因分型結果

2.2分養(yǎng)家系的鑒定

通過Cervus 2.0軟件分養(yǎng)家系44個子代個體與18個親本親子鑒定分析結果顯示，9個微衛(wèi)星座位累計非親權排除率為99.9658%， 共有40尾在95%非親權置信區(qū)間LOD值大于零且沒有錯配座位(部分數據如表3)。進一步證實了這9個微衛(wèi)星標記用于翹嘴鱖親子鑒定的準確性。

表2　非親權排除率(NEP)和累積非親權排除率(CEP)

表3　翹嘴鱖親子鑒定結果

注：F：子代個體；HB：湖北漁場；YT：長江江段；GD：廣東漁場

2.3混養(yǎng)家系的鑒定

選用已經驗證可以用于翹嘴鱖親子鑒定的9個微衛(wèi)星座位對選育出來的278尾優(yōu)勢翹嘴鱖進行親子鑒定分析，結果顯示，其中86尾來自廣東2號(雌)與廣東5號(雄)繁殖后代，51尾來自廣東3號(雌)與廣東5號(雄)繁殖后代；而湖北親本總共產生49尾優(yōu)勢后代個體，3尾雌魚親本和3尾雄魚親本優(yōu)勢后代沒有顯著性差異；長江2號(雌)和3號(雌)分別與3尾雄魚產生優(yōu)勢后代為18尾和15尾。

3討論

3.1翹嘴鱖的家系鑒定

傳統(tǒng)物理標記主要有外部形態(tài)的區(qū)分[16]、茜素絡合物或鹽酸四環(huán)素溶液浸泡魚仔、耳石標記、可見熒光標記(VIE)或編碼金屬標(CWT)[17]，這些方法存在操作繁瑣、費用昂貴、對魚體有傷害且標志容易脫落等缺點。而微衛(wèi)星分子標記因其數量較多、分布廣泛、多態(tài)性豐富等諸多優(yōu)點，近年廣泛應用于基因連鎖圖譜構建[18]、親緣關系鑒定[19-20]、遺傳多樣性分析[21]等諸多領域。翹嘴鱖選育過程中為保持正確的系譜關系需借助分子標記進行親緣關系鑒定。用微衛(wèi)星DNA測序法進行親子鑒定技術精確度高，且發(fā)展快，但早期由于成本較高在水產動物中較難開展和推廣，隨著分子生物學的發(fā)展和測序成本的降低，親子鑒定技術在水產動物中得到廣泛的應用?；谝陨虾Y選合適的分子標記用于親子鑒定，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的血型、DNA指紋等方法。

本研究中，通過9個有效的微衛(wèi)星標記從18個候選親本中鑒定子代父母本，鑒定的準確率則很大程度上受所選微衛(wèi)星分子標記的影響，即對數目相同的標記而言多態(tài)性越豐富其鑒定準確率越高，本研究中當座位數達到4個時，CEP(累積排除概率)就超過了97.50%；座位數達到6個時，CEP值為99.92%；座位數為9個時，CEP為99.97%(表2)，進一步確定了這9個座位用于翹嘴鱖親子鑒定的準確性，將親子鑒定技術運用在翹嘴鱖育種過程中，能夠更加準確地構建家系，有效地避免近親交配，防止種質退化。

3.2優(yōu)勢家系個體的確定

品種是生產養(yǎng)殖的物質基礎，培育生長速度快、高產優(yōu)質和抗病力強的優(yōu)良品系是當前水產養(yǎng)殖增產和農民增收的有效途徑。傳統(tǒng)的新品種培育方法主要是選擇育種，已經培育的水產動物新品種，如荷包紅鯉(Cyprinuscarpiovar.Wuyuanensis)、德國鏡鯉(C.carpioL.)、彭澤鯽(Carassiusauratusvar.Pengzesis)選育系等。傳統(tǒng)育種方法對推動世界水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展發(fā)揮了重要的作用，但育種周期長、預見性差、工作量大、工作效率低等問題嚴重制約了選擇育種的快速發(fā)展。

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(責任編輯：張紅林)

Microsatellite DNA markers for parentage test of

Siniperca chuatsi

CHENG Wei-wei,YANG Kai,GAO Yin-ai,ZHU Si-hua,LI Bo,WANG Qing-yun,LUO Feng,

XIA Ru-long,CHENG Ying-hong,DENG Guo-qiao,ZHENG Cui-hua

(WuhanFisheriesScienceResearchInstitute,WuhanAcademyofAgriculturalScience&Technology,Wuhan430207)

Abstract：In this study,9 microsatellite markers were used to analyses the paternity test ofS.chuatsi.A total of 95 alleles were obtained and the mean observed and expected heterozygosis was 0.578 and 0.607,respectively.The combined non-exclusion probability (first parent) of 9 loci was 99.9658%.For the 27 putative parents,the testing accuracy was 91%.The results indicated that the microsatellite DNA markers can be used for the parentage determination ofS.chuatsi.

Key words：Sinipercachuatsi;microsatellite loci;parentage test;superior families

中圖分類號：S917.4

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)01-0029-04

作者簡介：第一成為為(1986-)，女，博士，主要研究方向為遺傳育種。E-mail：chengweiwei9922@163.com通訊作者：高銀愛。E-mail：304104752@qq.com

收稿日期：2015-04-20；

修訂日期：2015-10-10

資助項目：武漢市農科院創(chuàng)新項目