三七活血片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

王兆華　紀(jì)義波　張大軍

摘要：目的 建立三七活血片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜法對(duì)制劑中的三七、血竭進(jìn)行鑒別。采用高效液相色譜法測(cè)定赤芍中芍藥苷的含量，色譜柱為Shim-pack（島津）C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.3%磷酸水溶液（15.2∶84.8，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min。結(jié)果 三七、血竭的薄層色譜特征斑點(diǎn)分離清晰，陰性無(wú)干擾。芍藥苷在0.269 6～1.348 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 8）；供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，平均加樣回收率為98.68%，RSD=0.78%（n=6）。結(jié)論 本研究所建立的方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于控制三七活血片的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：三七活血片；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；三七；血竭；薄層色譜法；高效液相色譜法；芍藥苷

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.024

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）02-0087-03

Sduty on Quality Sdandard for Sanqi Huoxue Tablets WANG Zhao-hua1， JI Yi-bo2， ZHANG Da-jun1 （1. Academy of Chinese Medical Sciences of Jilin Province， Changchun 130012， China； 2. Jilin Medical Device Testing Institute， Changchun 130062， China）

Abstract： Objective To establish the quality standard for Sanqi Huoxue Tablets. Methods Notoginseng Radix et Rhizoma and Draconis Sanguis in Sanqi Huoxue Tablets were identified by TLC qualitatively； The content of paeoniflorin in Paeoniae Radix Rubra was determined by HPLC. The separation was performed on Shim-pack-C18 column （150 mm×4.6 mm， 5 μm） with mobile phase consisted of acetonitrile-0.3% phosphoric acid （15.2：84.8， V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 230 nm， and the column temperature was 30 ℃. Results Notoginseng Radix et Rhizoma and Draconis Sanguis in Sanqi Huoxue Tablets could be identified by TLC and separated well. Paeoniflorin was in a good linear relationship between 0.269 6–1.348 μg， with a correlation coefficient of 0.999 8. Solution was stable within 24 h， and the average recovery of paeoniflorin was 98.68%， RSD=0.78%. Conclusion The established method is simple， accurate and sensitive， and can be applied to the quality control of Sanqi Huoxue Tablets.

Key words： Sanqi Huoxue Tablets； quality standard； Notoginseng Radix et Rhizoma； Draconis Sanguis； TLC； HPLC； paeoniflorin

三七活血片是在吉林省中醫(yī)院院內(nèi)制劑三七活血膠囊基礎(chǔ)上確定的實(shí)驗(yàn)方劑，由三七、赤芍、血竭、骨碎補(bǔ)等7味中藥組成，具有活血止血、散瘀止痛等作用，用于急性軟組織損傷等癥臨床療效顯著，藥理

基金項(xiàng)目：吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20130727005YY）；長(zhǎng)春市科技計(jì)劃項(xiàng)目（14KG067）

實(shí)驗(yàn)表明該制劑在減輕損傷組織，促進(jìn)血腫吸收和瘀斑消散等方面作用確切[1]。為有效控制三七活血片的質(zhì)量，保證用藥安全有效，本研究建立三七活血片的質(zhì)量控制方法。采用薄層色譜法，以三七的主要功效成分人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1為對(duì)照，對(duì)方中三七進(jìn)行定性鑒別。為增加方法的專屬性及信息的全面性，以血竭特征性成分血竭素高氯酸鹽及血竭對(duì)

照藥材為對(duì)照，對(duì)方中血竭進(jìn)行定性鑒別。處方中赤芍用量最大且為主要藥味，故采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)其鎮(zhèn)痛抗炎的有效成分芍藥苷進(jìn)行含量測(cè)定，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

LC-10 AT高效液相色譜儀（日本島津公司），SPD-10A紫外檢測(cè)器（日本島津公司），KQ-250型超聲波處理器（天津奧特賽恩斯儀器公司），AE163電子天平（瑞士梅特勒公司）。

人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)110703-201128，供含量測(cè)定用）、三七皂苷R1對(duì)照品（批號(hào)110745- 201318供含量測(cè)定用）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)110704-201223，供含量測(cè)定用）、血竭素高氯酸鹽對(duì)照品（批號(hào)110811-201105，供含量測(cè)定用）、血竭對(duì)照藥材（批號(hào)906-9905）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)110736- 201337，供含量測(cè)定用），中國(guó)食品藥品檢定研究院。3批三七活血片（批號(hào)20140601、20140602、20140603，0.5 g/片）及陰性對(duì)照品，吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院制劑室自制。硅膠G板（手鋪，青島海洋化工有限公司），水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 三七 取三七活血片3片，研細(xì)，加甲醇30 mL，超聲處理（功率500 W，頻率20 kHz）20 min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL微熱使溶解，加乙醚振搖提取3次，每次20 mL，棄去乙醚液，水液繼用水飽和正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，再用正丁醇飽合氨試液洗滌2次，每次15 mL，棄去堿液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取去掉三七的其他藥材，按三七活血片制備工藝操作，制成不含三七的陰性樣品，按供試品溶液制備方法，制備不含三七的陰性對(duì)照溶液。另取人參皂苷Rb1、Rg1及三七皂苷R1對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL各含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）附錄Ⅵ B]試驗(yàn)，吸取上述5種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10 ℃以下放置過(guò)夜的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，其Rf值適宜，顯色清晰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，專屬性較好。

2.1.2 血竭 取三七活血片2片，研細(xì)，加乙醚10 mL，超聲處理（功率500W，頻率20 kHz）5 min，過(guò)濾，濾液作為供試品溶液。取除血竭的其他藥材，按三七活血片制備工藝制成不含血竭的陰性樣品，按供試品溶液制備方法，制備不含血竭的陰性對(duì)照溶液。另取血竭對(duì)照藥材0.1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取血竭素高氯酸鹽對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）附錄Ⅵ B]試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（19∶1）為展開劑，展開，取出，晾干[2-3]。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，其Rf值適宜，顯色清晰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，專屬性較好。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Shim-pack（島津）C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.3%磷酸水溶液（15.2∶84.8），流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，柱溫30 ℃[4]。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成67.4 μg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取三七活血片20片，研細(xì)，取粉末0.25 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇40 mL，超聲處理（功率500 W，頻率20 kHz）30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例制備不含赤芍的陰性樣品，再按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入色譜儀測(cè)定。結(jié)果供試品溶液中待測(cè)成分色譜峰與芍藥苷對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致，并且與雜質(zhì)峰可達(dá)到良好的分離，陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾，表明本方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液（67.4 μg/mL）4、8、12、16、20 μL，分別注入高效液相色譜儀中，測(cè)定峰面積，以濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程。Y=662 679.976X-2903.064，r=0.999 8，表明芍藥苷進(jìn)樣量在0.269 6～1.348 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積成良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取芍藥苷對(duì)照品溶液10 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果芍藥苷的峰面積RSD=0.63%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取三七活血片（批號(hào)20140601）供試品溶液10 μL，每隔3 h進(jìn)樣1次，連續(xù)考察24 h，結(jié)果芍藥苷峰面積RSD=0.68%，表明供試品溶液中指標(biāo)性成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)下方法，對(duì)同一批號(hào)三七活血片（批號(hào)20140601），平行制備6份供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。芍藥苷平均含量為12.13 mg/g，RSD=1.44%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知芍藥苷含量的同一批三七活血片樣品（批號(hào)20140601）6份，每份約0.12 g，精密稱定，分別精密加入濃度為0.756 2 mg/mL的芍藥苷對(duì)照品2 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

3 討論

制備三七薄層鑒別的供試品溶液時(shí)，本研究考察了氨試液、0.5%氫氧化鈉溶液及1%氫氧化鈉溶液洗滌效果，均可達(dá)到較好分離效果，而以氨試液洗滌操作更簡(jiǎn)便，不需再用水洗滌。筆者曾嘗試對(duì)方中的骨碎補(bǔ)進(jìn)行定性鑒別，以柚皮苷對(duì)照品為對(duì)照，試驗(yàn)了多種鑒別方法，但未能消除陰性對(duì)照中的干擾。

另外，曾嘗試用HPLC對(duì)方中三七所含有效成分人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1的總量進(jìn)行測(cè)定，因供試品色譜中待測(cè)成分未得到較好分離，測(cè)定結(jié)果重復(fù)性不好，未采用。

對(duì)赤芍有效成分芍藥苷進(jìn)行含量測(cè)定，本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[5-6]，對(duì)供試品溶液的制備方法進(jìn)行了考察。分別考察了50%甲醇、70%甲醇、甲醇的提取效果，結(jié)果以甲醇提取效果最好；通過(guò)比較超聲提取法和加熱回流提取法，發(fā)現(xiàn)超聲提取效果較好且操作更簡(jiǎn)單；分別考察了乙腈-0.3%磷酸水溶液（12.7∶87.3）、乙腈-0.3%磷酸水溶液（16∶84）、乙腈-0.3%磷酸水溶液（15.2∶84.8）作為流動(dòng)相對(duì)樣品分離效果的影響，結(jié)果以乙腈-0.3%磷酸水溶液（15.2∶84.8）為流動(dòng)相得到的分離效果最佳，峰形對(duì)稱，保留時(shí)間短且陰性對(duì)照無(wú)干擾。在測(cè)定時(shí)還發(fā)現(xiàn)芍藥苷保留時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則易產(chǎn)生拖尾。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳文學(xué)，于德偉.三七活血片抗軟組織損傷、鎮(zhèn)痛與抗炎藥理作用研究[J].中國(guó)藥房，2015，26（9）：3482.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：147.

[3] 高燕妮，高武翔.跌打七厘片的鑒別及含量測(cè)定方法改進(jìn)[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，33（9）：117.

[4] 葛美廳，胡雙豐.血竭與龍血竭的定性鑒別[J].中國(guó)藥事，2010， 19（22）：85.

[5] 高穎，房德敏.蘇氏接骨膠囊中骨碎補(bǔ)和菟絲子的質(zhì)量控制[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（4）：333.

[6] 王建，劉金花.反相高效液相色譜法測(cè)定胃靈顆粒中芍藥苷含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2015，24（1）：45.

（收稿日期：2015-03-17）

（修回日期：2015-04-09；編輯：陳靜）