豬瘟病毒RT-LAMP-LFD檢測方法的建立與應(yīng)用

朱俊靈, 葉佐東， 鄧潔汝， 勾紅潮， 陳金頂

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

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豬瘟病毒RT-LAMP-LFD檢測方法的建立與應(yīng)用

朱俊靈?, 葉佐東?， 鄧潔汝， 勾紅潮， 陳金頂

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

摘要：【目的】建立一種新型的、能在基層場地進(jìn)行實(shí)時(shí)便捷診斷的豬瘟病毒檢測方法。【方法】環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)-橫向流動試紙條技術(shù)(Lateral flow dipstick, LFD)相結(jié)合，針對豬瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)NS5B基因設(shè)計(jì)一套特異性引物及生物素標(biāo)記探針，結(jié)合異硫氰酸熒光素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，建立RT-LAMP-LFD檢測方法?！窘Y(jié)果】所建立的方法能夠特異地檢測出CSFV的存在，檢測PRRSV、JEV、PCV-2等其他病毒均為陰性；所建立的CSFV-RT-LAMP 方法對RNA的最低檢測限為50 pg；反應(yīng)快速，整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)可在1 h 內(nèi)完成；操作簡單, 不需要PCR 儀等復(fù)雜的儀器，結(jié)果可經(jīng)肉眼觀察?！窘Y(jié)論】應(yīng)用RT-LAMP-LFD 檢測CSFV特異性強(qiáng)、靈敏度高，并且操作安全、簡便、快捷，可以滿足基層檢疫的需要。

關(guān)鍵詞：豬瘟病毒；NS5B基因； 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)； 橫向流動試紙條技術(shù)； 病毒檢測

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的豬的一種高度接觸性、急性傳染病。該病的高發(fā)病率和高死亡率給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的發(fā)展[1-2]。目前對CSFV的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒、實(shí)時(shí)RT-PCR等病原學(xué)方法，以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和中和試驗(yàn)(NT)等血清學(xué)方法[3-6]。病毒分離通常是確診疫病的經(jīng)典方法，但由于CSFV 不同毒株的毒力差異很大，CSFV 感染豬的臨床癥狀和病理變化差別很大, 一般很難根據(jù)臨床表現(xiàn)和病理變化來確診；實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的方法快速、靈敏，但對于設(shè)施設(shè)備等試驗(yàn)條件的要求較高；而ELISA、IFA、NT等血清學(xué)方法在操作簡便性、檢測敏感性和特異性方面存在不足[7-8]。因此，建立一種快速、簡便、靈敏度較高的檢測豬瘟病毒的方法十分有意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是在基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，然后在恒溫條件下特異擴(kuò)增目的DNA 的技術(shù)。與其他檢測方法相比，該技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便，無特殊設(shè)備要求，適用于基層及現(xiàn)場診斷使用[9]。橫向流動試紙條(Lateral flow dipstick，LFD)法是利用含有生物素 (Biotin) 標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物能與異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC) 標(biāo)記的探針特異性雜交, 從而與膠體金標(biāo)記的抗FITC的抗體結(jié)合形成三元復(fù)合物，結(jié)合在含生物素抗體的檢測線上，而未雜交的FITC標(biāo)記探針形成不含生物素的兩元復(fù)合物，結(jié)合在含抗FITC的質(zhì)控線上[10]。近年來，LAMP-LFD檢測方法已經(jīng)成功用于許多動物病毒性病原的檢測。其優(yōu)勢在于不僅快速、特異、操作簡單，而且避免了瓊脂糖凝膠電泳或熒光染料染色肉眼觀察所引起的假陽性。

本研究針對CSFVNS5B基因的保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)LAMP引物。建立了豬瘟病毒RT-LAMP方法，然后結(jié)合LFD技術(shù)，建立了一種豬瘟病毒RT-LAMP-LFD檢測方法，該方法簡單、快速、靈敏度高，為基層養(yǎng)殖場和獸醫(yī)站提供了CSFV初步篩選檢測的理想方法。

1材料與方法

1.1病毒

豬瘟病毒GXW-07株、石門株，日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)SA14-14-2株，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)GD08-2株，胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室保藏；豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus-2，PCV-2)LG株油乳劑滅活疫苗購自上海海利生物科技有限公司；偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)Bartha-K61株滅活疫苗購自哈爾濱維科生物科技有限公司。

1.2主要試劑

dNTP、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、RRI、Ex-TaqDNA聚合酶和瓊脂糖為TaKaRa公司產(chǎn)品；BstDNA聚合酶為New England公司產(chǎn)品；硫酸鎂、甜菜堿(Betaine)、氯化錳、鈣黃綠素(Calcein)為美國Sigma公司產(chǎn)品；RT-LAMP引物由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物教研室設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成；核酸試紙條密閉反應(yīng)裝置(LFD)為中國杭州優(yōu)思達(dá)公司產(chǎn)品。

1.3主要儀器

高壓滅菌鍋為日本Sanyo MLS-320產(chǎn)品。純水儀為瑞士ELAG電子有限公司產(chǎn)品。臺式冷凍高速離心機(jī)為美國Thermo公司產(chǎn)品。小型高速離心機(jī)為德國Eppendorf公司產(chǎn)品。LX-100手掌型離心機(jī)為江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品。凝膠圖像分析系統(tǒng)為MOLECULAR IMAGING公司產(chǎn)品。ABI 9700PCR擴(kuò)增儀為美國ABI公司產(chǎn)品。DK-8D型電熱恒溫水槽為上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品。BIO-RAD電泳儀為Powerpac Basic公司產(chǎn)品。

1.4病毒核酸提取

根據(jù)MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 5.0說明書進(jìn)行DNA/RNA抽提。

1.5引物和熒光探針的設(shè)計(jì)合成

運(yùn)用Primer Primier5.0軟件，針對CSFVNS5B基因的保守序列設(shè)計(jì)1對PCR引物P1和P2(表1)。根據(jù)LAMP引物設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer Exporer 4.0針對CSFVNS5B基因的保守區(qū)域序列(GenBank No. EU915211.1)，進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)。引物包括1對外引物(F3和B3)、1對內(nèi)引物(FIP和BIP)、1條環(huán)引物(LB)以及1條探針(Probe)(表1)，所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成并標(biāo)記(圖1)。

1.6環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增條件的優(yōu)化

1.6.1CSFV RT-LAMP-LFD檢測方法的建立以豬瘟病毒GXW-07株基因組RNA為模板，25 μL反應(yīng)體系包含:10×Thermopol Buffer 2.5 μL、dNTP(2.5 mmol·L-1)4.0 μL、甜菜堿(10 mol·L-1)2.5 μL、FIP(10 μmol·L-1)+BIP(10 μmol·L-1)4.0 μL、LF(10 μmol·L-1)+LB(10 μmol·L-1)2.0 μL、F3(10 μmol·L-1)+B3(10 μmol·L-1)0.5 μL、Probe(10 μmol·L-1)2.0 μL、硫酸鎂(100 mmol·L-1)0.5 μL、BstDNA polymerase(8 U·μL-1)1.0 μL、AMV反轉(zhuǎn)錄酶(5 U·μL-1) 0.5 μL、模板RNA 5 μL，加DEPC水至25 μL。陰性對照不加模板。每個(gè)反應(yīng)至少重復(fù)3次，用20 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

表1　CSFV RT-LAMP-LFD 引物序列

圖1　CSFV RT-LAMP-LFD引物設(shè)計(jì)示意圖

1.6.2CSFV RT-LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化分別在59、60、61、62、63、64、65、66 ℃ 8個(gè)溫度梯度進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，根據(jù)擴(kuò)增效果確定最佳反應(yīng)條件。分別設(shè)計(jì)10、20、30、40、50、60、70 min 7個(gè)時(shí)間梯度, 在已優(yōu)化得到的最佳反應(yīng)溫度下進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，根據(jù)擴(kuò)增效果確定最佳反應(yīng)條件。

1.6.3CSFV RT-LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化分別按2、4、6、8、10 mmol·L-15個(gè)Mg2+濃度梯度進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng), 其余成分不變，根據(jù)擴(kuò)增效果得出CSFV RT-LAMP反應(yīng)的最佳Mg2+濃度。分別按0、0.5、1.0、1.5、2.0 mol·L-15個(gè)甜菜堿濃度梯度進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，以優(yōu)化的條件和成分，根據(jù)擴(kuò)增效果得出CSFV RT-LAMP反應(yīng)的最佳甜菜堿濃度。分別按0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol·L-16個(gè)dNTP濃度梯度進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，以優(yōu)化的條件和成分，根據(jù)擴(kuò)增效果得出CSFV RT-LAMP反應(yīng)的最佳dNTP濃度。分別按4、8、12、16、20 U 5個(gè)BstDNA聚合酶濃度梯度進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，以優(yōu)化的條件和成分，根據(jù)擴(kuò)增效果得出CSFV RT-LAMP反應(yīng)的最佳BstDNA聚合酶濃度。分別按1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 U 5個(gè)AMV反轉(zhuǎn)錄酶濃度梯度進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，以優(yōu)化的條件和成分，根據(jù)擴(kuò)增效果得出CSFV RT-LAMP反應(yīng)的最佳AMV反轉(zhuǎn)錄酶濃度。以外引物的用量為參照，設(shè)計(jì)外引物與環(huán)引物的比例分別為1∶0、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8共6個(gè)梯度，以優(yōu)化的條件和成分，根據(jù)擴(kuò)增效果得出CSFV RT-LAMP反應(yīng)的最佳環(huán)引物濃度。

1.7CSFV RT-LAMP-LFD方法的特異性分析

PRRSV GD08-2株、JEV SA14-14-2株基因組RNA，PCV-2、PRV、APP的基因組DNA為模板作為特異性對照，按優(yōu)化的條件，檢測該方法的特異性，同時(shí)以CSFV GXW-07株、CSFV石門株為陽性對照，每個(gè)反應(yīng)至少重復(fù)3次。其中5 μL反應(yīng)產(chǎn)物用于20 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，剩余20 μL產(chǎn)物用于LFD檢測。

1.8CSFV RT-LAMP-LFD方法的靈敏度分析

抽提CSFV GXW-07株的RNA模板并制備出CSFV標(biāo)準(zhǔn)品(10 ng·μL-1)作為初始模板，將初始模板進(jìn)行10倍梯度稀釋(10-1～10-7)，按優(yōu)化的條件進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物分別用LFD、鈣黃綠素-可視化RT-LAMP、20 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。每個(gè)試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.9CSFV RT-PCR方法

參照試劑盒說明書進(jìn)行RNA抽提，逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系20 μL：5×AMV Buffer 4 μL、dNTP (10 mmol·L-1)2 μL、RNase inhibitor (40 U) 0.5 μL、Random primer (50 pmol)1 μL、AMV(5 U)1 μL、RNA10 μL，補(bǔ)DEPC水至20 μL。42 ℃反應(yīng)1 h。獲得的cDNA作模板，P1、P2作為上、下游引物進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTPs (2.5 mmol)2 μL、P1 (10 μmol)和P2(10 μmol)各0.5 μL、Ex-Taq(5 U) 0.25 μL、模板2 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

2結(jié)果

2.1CSFV RT-LAMP-LFD檢測方法的建立

以豬瘟病毒GXW-07株RNA為模板進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，反應(yīng)后的產(chǎn)物分別用20 g·L-1凝膠電泳、鈣黃綠素法以及LFD進(jìn)行檢測，驗(yàn)證檢測方法的可行性。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示CSFV陽性模板有梯狀條帶而空白對照無條帶(圖2A)；鈣黃綠素法的結(jié)果顯示CSFV陽性模板結(jié)果出現(xiàn)熒光綠色而空白對照為橘黃色(圖2B)；RT-LAMP-LFD結(jié)果顯示，CSFV陽性模板出現(xiàn)2條紅色條帶，分別位于檢測區(qū)(T)內(nèi)和質(zhì)量控制區(qū)(C)內(nèi)，而空白對照組僅在質(zhì)量控制區(qū)(C)出現(xiàn)1條紅色條帶(圖2C)。結(jié)果表明，該CSFV RT-LAMP-LFD檢測方法可行。

M：2 000 bp DNA marker；1、4、6：空白對照；2、3、5：CSFV陽性模板。

2.2CSFV RT-LAMP擴(kuò)增條件的確立

在反應(yīng)條件優(yōu)化試驗(yàn)中，在59～66 ℃ 8個(gè)不同溫度間進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，結(jié)果(圖3A)顯示泳道2擴(kuò)增條帶最亮，因此選擇60 ℃為CSFV RT-LAMP反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度；反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果(圖3B)顯示, 從30 min時(shí)開始即可以通過瓊脂糖凝膠電泳檢測到RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)50 min后產(chǎn)物量趨于飽和，因此選定50 min 為CSFV RT-LAMP反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)間。反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果如圖4，CSFV RT-LAMP最佳反應(yīng)體系為：3 mmol·L-1的鎂離子(圖4A)， 1.5 mol·L-1甜菜堿(圖4B)，0.5 mmol·L-1的dNTP(圖4C)，8 U的BstDNA聚合酶(圖4D)和2.5 U的AMV的逆轉(zhuǎn)錄酶(圖4E)，外引物與環(huán)引物用量比為1∶4(圖4F)。

M：2 000 bp DNA marker；A：反應(yīng)溫度優(yōu)化試驗(yàn)，1～8分別為：59～66 ℃；B：反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化試驗(yàn)，1～7分別為：10～70 min。

圖3CSFV RT-LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

Fig.3Optimization of reaction conditions of CSFV RT-LAMP

M:2 000 bp DNA marker；A：硫酸鎂濃度優(yōu)化試驗(yàn)，1～5分別為：0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mmol·L-1硫酸鎂；B：甜菜堿濃度優(yōu)化試驗(yàn)，1～5分別為：0、0.5、1.0、1.5、2.0 mol·L-1甜菜堿；C：dNTP濃度優(yōu)化試驗(yàn)， 1～6分別為：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol·L-1dNTP；D：BstDNA聚合酶濃度優(yōu)化試驗(yàn)，1～5分別為：4、8、12、16、20 UBstDNA聚合酶；E：AMV逆轉(zhuǎn)錄酶濃度優(yōu)化試驗(yàn)，1～5分別為：1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶；F：外引物與環(huán)引物的用量比例優(yōu)化試驗(yàn)，1～6示外引物與環(huán)引物用量比分別為：1∶0、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8。

圖4CSFV RT-LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化

Fig.4Optimization of reaction components of CSFV RT-LAMP

2.3CSFV RT-LAMP-LFD檢測方法特異性分析

為了確認(rèn)CSFV RT-LAMP-LFD檢測方法的特異性，用優(yōu)化的條件，分別以PRRSV、JEV、PCV-2、PRV、APP、CSFV GXW-07株和CSFV石門株的核酸模板進(jìn)行RT-LAMP方法檢測，并用瓊脂糖凝膠電泳法作為方法對照。結(jié)果表明，CSFV GXW-07株和石門株為陽性，其余病原均為陰性(圖5)，該結(jié)果表明所建立的CSFV RT-LAMP-LFD檢測方法具有良好的特異性。

M：2 000 bp DNA marker； 1～7分別為：CSFV GWX-07株、CSFV石門株、APP、 PCV-2、 PRV、 JEV、 PRRSV;A：RT-LAMP瓊脂糖凝膠電泳檢測；B：RT-LAMP-LFD方法檢測。

圖5CSFV RT-LAMP-LFD檢測方法特異性分析

Fig.5The specificity of CSFV RT-LAMP-LFD detection method

2.4CSFV RT-LAMP-LFD檢測方法的靈敏度分析

對CSFV GXW-07株基因組RNA進(jìn)行10倍梯度稀釋試驗(yàn)表明，鈣黃綠素-可視化RT-LAMP方法(圖6A)、RT-LAMP瓊脂糖凝膠電泳檢測方法(圖6B)以及RT-LAMP-LFD檢測方法(圖6C)的敏感性一致，最低檢測模板濃度均為50 pg，但比RT-PCR檢測(500 pg)方法(圖6D)的靈敏度高10倍。

1：5 ng；2：500 pg；3：50 pg；4：5 pg；5：500 fg；6：50 fg；7：5 fg；M1：2 000 bp DNA marker；M2：1 000 bp DNA marker;A：鈣黃綠素-可視化RT-LAMP自然光條件下靈敏度試驗(yàn)；B：RT-LAMP瓊脂糖凝膠電泳方法的靈敏度試驗(yàn);C：RT-LAMP-LFD檢測方法的靈敏度試驗(yàn)；D：RT-PCR方法的靈敏度試驗(yàn)。

圖6CSFV RT-LAMP-LFD檢測方法靈敏度分析

Fig.6The sensitivity of CSFV RT-LAMP-LFD detection method

2.5CSFV RT-LAMP-LFD檢測方法的臨床應(yīng)用研究

將臨床采集的43份疑似CSFV感染的病料進(jìn)行RT-PCR和RT-LAMP-LFD方法檢測。結(jié)果(表2)顯示，應(yīng)用RT-PCR方法檢測時(shí)，29份呈陽性，陽性率為67.4%；應(yīng)用RT-LAMP-LFD方法檢測時(shí)，31份呈陽性，陽性率為72.1%，二者的符合率為93.5%。CSFV RT-LAMP-LFD檢測方法的臨床檢出率更高。

表2　CSFV RT-LAMP-LFD檢測方法的臨床應(yīng)用

3討論

豬瘟是豬重大烈性傳染病之一，在中國主要采用豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)接種的方法預(yù)防和控制CSF的流行，但是近年來，CSF在我國重新抬頭，出現(xiàn)非典型、持續(xù)感染、免疫抑制的流行特征，傳統(tǒng)疫苗的作用越來越小[11-12]。傳統(tǒng)的診斷方法如PCR、IFA等雖然精確，但卻受制于設(shè)備的需求以及檢測耗時(shí)較長的原因而不能在基層廣泛應(yīng)用。因此，建立一種新型、快速、簡便的豬瘟檢測方法對基層豬瘟預(yù)防和診斷具有重大意義。

本研究采用RT-LAMP和橫向流動試紙條(LFD)技術(shù)相結(jié)合的方法，建立一種CSFV RT-LAMP-LFD檢測方法，該法只需在水浴鍋中恒溫60 ℃反應(yīng)50 min，然后通過標(biāo)記的探針在密閉的橫向流動試紙條雜交，5 min后用肉眼就可觀察到檢測結(jié)果。整個(gè)過程可在1 h之內(nèi)完成，且無需特殊設(shè)備要求。目前CSFV國標(biāo)的檢測方法是間接免疫熒光方法，該方法是基于檢測CSFV表面抗原蛋白進(jìn)行的。在實(shí)際應(yīng)用中，間接免疫熒光方法存在耗時(shí)較長，操作復(fù)雜等弊端，比較難以具體開展。而本研究所建立的CSFV RT-LAMP-LFD檢測方法是基于病毒核酸檢測，因此我們選擇與行業(yè)中常用的而又較易開展的核酸檢測方法RT-PCR方法進(jìn)行平行比較。旨在通過比較其對病毒核酸方面的檢測時(shí)間、可操作性及臨床應(yīng)用效果，探索一種可在基層場地對臨床病料進(jìn)行實(shí)時(shí)便捷分析的檢測方法。與傳統(tǒng)CSF診斷方法相比，本試驗(yàn)建立的方法并不需要特殊設(shè)備要求，與RT-PCR相比，檢測時(shí)間大大縮短，靈敏度高了10倍，跟鈣黃綠素-可視化RT-LAMP方法相比，消除了因?yàn)槿庋塾^察顏色導(dǎo)致人為誤差，而且試紙條是在密閉容器里完成，因此也沒有其他因外加熒光染料導(dǎo)致的RT-LAMP產(chǎn)物的污染產(chǎn)生的誤差，避免了假陽性產(chǎn)生。因此對于基礎(chǔ)臨床病料診斷具有良好的應(yīng)用前景。

由于該方法是針對CSFVNS5B基因設(shè)計(jì)的引物，而CSF強(qiáng)弱毒株基因組NS5B序列上沒有太大的區(qū)別，所以本研究所建立方法不能用于區(qū)分CSFV強(qiáng)弱毒株，對于該方法在強(qiáng)弱毒株的鑒別方面的不足，我們需對強(qiáng)弱毒株的基因組進(jìn)行進(jìn)一步分析，并探索可用于RT-LAMP-LFD檢查方法的新引物。

RT-LAMP引物的設(shè)計(jì)是整個(gè)檢測方法的關(guān)鍵，好的引物能夠保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)首先對設(shè)計(jì)的針對CSFVNS5B基因的 RT-LAMP引物進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的針對CSFVNS5B基因的特異性引物具有良好的特異性，并不與其他病原產(chǎn)生陽性反應(yīng)。有研究表明，RT-LAMP的反應(yīng)條件和體系也直接影響了檢測的特異性和敏感度，如內(nèi)外引物的濃度、Mg2+濃度以及酶濃度等[9, 13]。因此本試驗(yàn)對建立的CSFV RT-LAMP檢測方法進(jìn)行體系和條件的優(yōu)化。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的1對環(huán)引物大大加快了擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。有趣的是，過量的dNTPs和Bst酶會導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物濃度降低。由此可見，體系成分和條件的優(yōu)化對增加檢測方法的靈敏度和特異性很有必要。另外在臨床病料檢測試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)CSFV RT-LAMP-LFD檢測方法比RT-PCR的臨床檢出率更高。

我們將RT-LAMP技術(shù)與LFD技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于對CSFV的檢測，該方法可用于檢測CSFV感染的組織或血清等臨床樣品。本試驗(yàn)所建立的CSFV RT-LAMP-LFD檢測方法旨在探索一種可在基層場地對正常與疑似CSFV感染豬進(jìn)行實(shí)時(shí)便捷診斷的檢測方法，其應(yīng)用價(jià)值主要在于CSFV豬瘟病毒感染豬的初步診斷、進(jìn)出口貿(mào)易中CSF的快速篩查以及無CSF疫苗免疫豬場的CSF凈化。這對于開發(fā)CSFV感染的新型診斷工具，具有良好的應(yīng)用前景。

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【責(zé)任編輯柴焰】

Rapid detection of classical swine fever virus by loop-mediatedisothermal

amplification combined with lateral flow dipstick method

ZHU Junling?, YE Zuodong?, DENG Jieru, GOU Hongchao, CHEN Jinding

(College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Abstract：【Objective】 The experiment was conducted to establish a rapid real time detection method of classical swine fever virus at local fields. 【Method】 A rapid detection method(RT-LAMP-LFD) of classical swine fever virus(CSFV) was developed by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) combined with lateral flow dipstick (LFD) method. The LAMP method for amplification of the CSFVNS5Bgene using fluorescein isothiocyanate-labeled primer was combined with a chromatographic LFD for rapid and simple visual detection of CSFV. 【Result】 This method could specifically detect CSFV, but not other virus such as PRRSV, JEV and PCV-2. The minimum detection limit of the CSFV-RT-LAMP-LFD method was 50 pg. The detection could be finished within 1 h without using complex instruments such as PCR machine and the results were visible by eye. 【Conclusion】 This RT-LAMP-LFD method is a highly specific and sensitive, safe, rapid and simple way for field detection of CSFV infection.

Key words：classical swine fever virus；NS5Bgene； LAMP； LFD； virus detection

中圖分類號：S855.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-411X(2016)01-0001-07

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(U1405216, 31172321和31472200)；廣東省高等教育科技創(chuàng)新特殊項(xiàng)目(2012CXZD0013)

作者簡介：朱俊靈(1989—)，男，碩士研究生，E-mail: 919736608@qq.com; 葉佐東(1990—)，男，碩士研究生，E-mail: zuodongye@126.com；?對本文貢獻(xiàn)相同；通信作者：陳金頂(1968—)，男，教授，博士，E-mail: jdchen@scau.edu.cn

收稿日期：2015-04-13優(yōu)先出版時(shí)間：2015-12-07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20151207.1115.002.html

朱俊靈， 葉佐東， 鄧潔汝，等.豬瘟病毒RT-LAMP-LFD檢測方法的建立與應(yīng)用[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,37(1):1-7.