海棠感染蘋果莖痘病毒發(fā)生與檢測

摘 要：【目的】研究海棠（Malus spp.）上病毒病的種類及田間侵染情況。

【方法】利用宏病毒組測序技術結合RT-PCR方法，對采自新疆7個海棠種植區(qū)的158份樣品進行病毒檢測。

【結果】宏病毒組測序結果只對比到蘋果莖痘病毒（Apple stem pitting virus， ASPV）一種植物病毒。158份海棠樣品中巴音郭楞蒙古自治州（簡稱巴州）、阿克蘇地區(qū)、喀什地區(qū)、昌吉回族自治州（簡稱昌吉州）、石河子市、伊犁哈薩克自治州（簡稱伊犁州）、奎屯市ASPV檢出率分別為0.00%、12.00%、0.00%、31.71%、29.41%、17.65%和0.00%。在檢測的7個種植區(qū)中，昌吉州檢出率最高，為31.71%；石河子市檢出率次之，為29.41%；巴州、喀什地區(qū)和奎屯市未檢測到ASPV。

【結論】海棠上的ASPV在北疆檢出率較高，在南疆檢出率較低。在觀賞海棠樣品中檢測到ASPV，其病毒檢出樣本均為田間發(fā)病癥狀葉片，與田間觀察到的發(fā)病情況相符合，海棠為ASPV的自然寄主之一。

關鍵詞：海棠；宏病毒組測序；蘋果莖痘病毒；RT-PCR；病毒檢測

中圖分類號：S436 ""文獻標志碼：A"" 文章編號：1001-4330（2024）12-3061-06

0 引 言

【研究意義】海棠是薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（Malus Mill.）中果徑小于5 cm的落葉喬木或小喬木的統(tǒng)稱，樹形優(yōu)美，花色花形繽紛多彩，葉色葉形多種多樣，尤其特別的是還有一些冬季觀果品種，是極具觀賞價值的園林綠化樹種^［1-3］。海棠是我國本土花木，栽培歷史悠久，在園林中廣泛運用。除了觀賞價值以外，海棠果實還具有食用價值和藥用價值，由于其口味酸甜清脆，可生食、做蜜餞、做果醬、做果醋、做果酒以及做果丹皮等，具有較高的食用價值；海棠果實及提取物還具有一定的藥用價值^［4-6］。【前人研究進展】蘋果莖痘病毒（Apple stem pitting virus， ASPV）是果樹病毒病中很重要的一種病毒，在蘋果和梨上普遍發(fā)生，廣泛分布。除了蘋果和梨，ASPV在花楸^［7］（Sorbus pohuashanensis）、榅桲^［8］（Cydonia oblonga）、櫻桃^［9］（Prunus avium）、枇杷^［10］（Eriobotrya japonica）、山楂^［11］（Crataegus pinnalifida）等果樹中也有報道。ASPV于1954年首次在歐洲野蘋果上報道^［12］，侵染果樹后癥狀一般不明顯，但造成果樹生長不良，樹勢衰退，導致果品和產量下降^［13］。早期研究者認為梨樹上的梨栓痘?。≒earcorky pit）、梨脈黃?。≒ear vein yellow）、梨黃化?。≒ear yellow）和梨壞死斑點?。≒ear necrotic spot）等病害是由不同病毒引起的，經研究發(fā)現(xiàn)以上幾種病害均是ASPV引起的^［14］。ASPV是凹陷病毒屬Foveavirus的代表種^［15］，其基因組為正義單鏈RNA，約9 306 nt，編碼5個開放閱讀框（open reading frame， ORF）^［14］。該病毒指示植物有斯派227（Spy227）、雜種榅桲（Pyronia veitchii）、光輝（R65-76 Radiant）等木本植物和西方煙37B（Nicotiana occidentalis）、西方煙亞種（Nicotiana occidentalis subsp‘obligua’）、千日紅（Gomphrena globosa）等草本植物^［16-18］。【本研究切入點】目前國內外對海棠病毒病的研究較少，需鑒定新疆海棠上蘋果莖痘病毒?！緮M解決的關鍵問題】在新疆7個地州采集了海棠葉片樣品，并對其進行檢測。將采集的樣品混樣通過宏病毒組測序和RT-PCR技術，明確其在海棠上的發(fā)生情況，為海棠病毒病進一步研究和精準防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 海棠疑似感病葉片

2022～2023年從新疆巴州、阿克蘇地區(qū)、喀什地區(qū)、昌吉州、石河子市、伊犁州、奎屯市采集了158份海棠疑似感病葉片樣品，癥狀為葉片黃化泛白、葉尖葉緣壞死、葉片畸形反卷。昌吉州、石河子市和伊犁州疑似感病癥狀較多，巴州、阿克蘇地區(qū)和奎屯市有少許疑似感病癥狀，喀什地區(qū)幾乎沒有疑似感病癥狀。無疑似感病樣品較多的種植區(qū)采集健康葉片樣品。所有樣本經蒸餾水清洗后放入自封袋，經液氮速凍后，用液氮罐帶回實驗室，保存到-80℃超低溫冰箱備用。圖1

1.1.2 所用儀器

DW-86L338J超低溫冰箱（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）；BCM-1000A超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；OSE-VX-01旋渦混合器，（天根生化科技（北京）有限公司）；TGL-16高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；HH.S-21-8電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；BIO-RAD T100 PCR儀（美國伯樂中國上海分公司）；keebio-600N電泳儀（上海嘉鵬科技有限公司）；KCBIO2008凝膠成像系統(tǒng)（北京原平皓生物技術有限公司）；BSD-TX270臺式智能精密搖床（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；BSP-150生化培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；移液槍。圖1

1.2 方 法

1.2.1 宏病毒組測序

將采集于巴州、阿克蘇地區(qū)、喀什地區(qū)、昌吉州、石河子市、伊犁州、奎屯市7個地州市的海棠疑似病毒病葉片樣品混和，送至諾禾生物科技有限公司進行宏病毒組測序。

1.2.2 總RNA的提取和RT-PCR反應

先用液氮預冷研缽，后將采集的樣本置于盛有液氮的研缽中研成粉末，使用FOREGENE公司的Plant Total RNA Isolation Kit Plus試劑盒提取樣本的總RNA，后使用瓊脂糖凝膠電泳和Nanadrop分光光度計檢測樣品RNA完整性和純度。使用北京全式金生物技術有限公司生產的EasyScript One- Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒將總RNA進行反轉錄，反應所得cDNA放-80℃冰箱保存或直接用于下游實驗。

PCR反應體系為2×Es Taq Mastermix（Dye）（北京康為生物科技有限公司）12.5 μL，上下游引物10 μmol/L各1 μL，模板cDNA為1 μL，滅菌ddH2O補足至25 μL；PCR反應程序 ：預變性94℃，2 min；變性94℃，30 s；退火53℃，30 s；延伸72℃，30 s；35個循環(huán)；終延伸72℃，10 min；保存4℃，∞。

1.2.3 檢測引物及可靠性驗證

病毒檢測引物ASPV-F（5’-ATGTCTGGAACCTCATGCTGCTGCAA-3’）和ASPV-R（5’-TTGGGATCAACTTTACTAAAAAGCATAA-3’）參考已報道引物序列^［19］，預測產物片段大小為370 bp，由生工生物工程（上海）有限公司合成。用1.5%的瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳，并在KCBIO2008凝膠成像儀下觀察并拍照記錄檢測結果，利用北京全式金生物技術有限公司生產的PCR產物純化回收試劑盒回收產物，將回收得到的目標片段連接到pUCm-T載體上，后熱擊轉化入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞（生工生物工程（上海）有限公司），經菌落PCR鑒定后，將得到的陽性克隆隨機挑選3個送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對158個采集樣本提取的總cDNA進行PCR擴增，反應體系同1.2.2，得到的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，與預測產物片段大小做對比，并計算檢出率：

檢出率（%）=檢出樣品數(shù)/樣品總數(shù)×100。

2 結果與分析

2.1 宏病毒組測序

研究表明，7個地州市采集的海棠樣品混樣進行宏病毒組測序，將獲得的contigs過濾掉宿主基因組序列后與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，只匹配到一種植物病毒，即蘋果莖痘病毒，其相關序列2條contigs。在對宏病毒組測序結果中一些較短且未分類的contigs序列對比時，發(fā)現(xiàn)有2條contigs也能對比到ASPV。

2.2 檢測引物及可靠性驗證

研究表明，以疑似感病海棠葉片RNA反轉錄得到的cDNA為模板，使用特異性引物（ASPV-F）＼＼（ASPV-R）進行PCR擴增，得到與ASPV大小相近的目的條帶，將膠回收目的基因片段克隆、陽性鑒定、測序。測序得到的目的基因序列經NCBI數(shù)據(jù)庫對比與ASPV的同源性為100%，與宏病毒組測序結果一致，宏病毒組測序結果和檢測引物具有可靠性。圖2，圖3

2.3 田間檢測結果

研究表明，共有27份樣品檢測到了ASPV，檢出率為17.09%。其中昌吉州的ASPV檢出率最高，為31.71%；石河子市次之，檢出率為29.41%；伊犁州檢出率為17.65%；阿克蘇地區(qū)檢出率為12.00%；庫爾勒地區(qū)、喀什地區(qū)、奎屯市三地均未有檢出。北疆種植區(qū)檢出率明顯高于南疆種植區(qū)檢出率。圖4，表1

3 討 論

3.1

ASPV可侵染多種果樹，是果樹病毒病重要病原之一^［7-11］。研究利用宏病毒組測序和RT-PCR檢測技術，明確海棠是ASPV自然寄主之一。海棠上的病毒病系統(tǒng)的研究較少，除了研究檢測到的ASPV，曹曉鳳^［20］在八棱海棠種子中利用RT-PCR方法檢測到了蘋果莖溝病毒（Apple Stem Grooving Virus， ASGV），并明確八棱海棠可以通過種子傳播ASGV。郭超等^［21］運用RT-PCR技術在八棱海棠果皮、果肉、種子以及種胚中均檢測到了蘋果銹果類病毒（ Apple skin scar viroid， ASSVd），并明確該病毒在八棱海棠中可以通過種子傳播。張富軍等^［22］利用RT-PCR方法在有“花臉”癥狀的火焰海棠的果皮上也檢測到了ASSVd。

3.2

研究調查了ASPV在新疆庫爾勒市、阿克蘇地區(qū)、喀什地區(qū)、昌吉州、石河子市、伊犁州、奎屯市7個地區(qū)的發(fā)生分布情況，檢測結果顯示，158份樣品中有27份呈ASPV陽性，檢出率為17.09%，檢出ASPV的樣品多數(shù)為有疑似病毒病癥狀的樣品，雖然有報道稱ASPV為潛隱性病毒，侵染多數(shù)栽培品種后并不引起明顯癥狀^［13］。但也有研究指出感染ASPV的樹體也可能出現(xiàn)明顯癥狀，如梨上的梨脈黃病、梨黃化病等^［14］，在弗吉尼亞小蘋果（Malus pumila cv.virginia crab）和Spy227上分別表現(xiàn)出木質部上產生莖痘斑，以及葉片畸形和樹勢衰退的癥狀^［23］，研究通過宏病毒組測序只檢測出ASPV一種植物病毒，但也不能完全確定ASPV和海棠葉片疑似病毒病癥狀的相關性，對于兩者之間的聯(lián)系仍有待進一步研究驗證。

4 結 論

對采自新疆7個地州的158份海棠葉片進行RT-PCR檢測，共檢出27份樣品，檢出率為17.09%，海棠上的ASPV在北疆地區(qū)檢出率較高，在南疆地區(qū)檢出率較低。

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Occurrence and detection of begonia infected by apple stem pitting virus

ZHANG Liya1， LIU Baojun1， SHAN Jiaqi1， WANG Shu1， GU Aixing1， BAI Jianyu2

（1. College of Agriculture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China; 2. Research Institute of Economic Forestry， Xinjiang Academy of Forestry Sciences， Urumqi 830063， China）

Abstract：【Objective】 To identify the species and field infection of viral diseases on ornamental Malus spp.

【Methods】 ""A total of 158 samples from 7 areas of Xinjiang were detected by macro virus sequencing technique combined with RT-PCR.

【Results】 Only one plant virus was compared with apple stem pitting virus （ASPV）.Among 158 samples of ornamental begonia， the ASPV detection rates were 0.00%， 12.00%， 0.00%， 31.71%， 29.41%， 17.65% and 0.00% in Bayingoleng Mongolian Autonomous Prefecture， Aksu Region， Kashgar Region， Changji Hui Autonomous Prefecture， Shihezi City， Yili Kazak Autonomous Prefecture and Kuitun City， respectively.Among the 7 areas tested， Changji had the highest detection rate （31.71%）.The detection rate of Shihezi City was 29.41%.ASPV was not detected in Kashgar Prefecture and Kuitun City.

【Conclusion】" The results showed that the detection rate of ASPV on ornamental begonia is higher in northern Xinjiang and lower in southern Xinjiang.ASPV is detected in ornamental begonia samples， and the virus detected samples were all symptomatic leaves in the field， which was consistent with the disease observed in the field.Ornamental begonia is one of the natural hosts of ASPV.

Key words：ornamental begonia; macro virus sequencing; apple stem pitting virus; RT-PCR; virus detection

Fund projects：The Forestry Science and Technology Special Project of the National Forestry and Grassland Administration \"Census of Alien Invasive Plant Pathogenic Microorganisms in Xinjiang Forest， Grassland and Wetland Ecosystem\" （65000022P00789110010X）

Correspondence author：GU Aixing（1973-），female，from Xinjiang，professor，Ph.D.， master and doctoral's supervisor，research direction：cotton disease resistant breeding，（E-mail）gax@xjau.edu.cn

BAI Jiunyu（1977-），male，from Hebei，researcher，research direction：monitoring，early warning and prevention of forestry pests，（E-mail）bjyhao2010@sina.com

基金項目：國家林業(yè)和草原局林業(yè)科技專項“新疆森林、草原、濕地生態(tài)系統(tǒng)外來入侵植物病原微生物普查”項目（65000022P00789110010X）

作者簡介：張李婭（ 1999- ），女，云南人，碩士研究生，研究方向為植物病理學，（E-mail）2768296845@qq.com

通訊作者：顧愛星（ 1973- ），女，新疆人，教授，博士，碩士生/博士生導師，研究方向為棉花抗病育種，（E-mail）gax@xjau.edu.cn

白劍宇（ 1977- ），男，河北人，研究員，研究方向為林業(yè)有害生物監(jiān)測預警與防控，（E-mail）bjyhao2010@sina.com