不同固定液對(duì)大鼠耳蝸一氧化氮合酶表達(dá)及透射電鏡觀察的影響△

陳小婉　江英　仇志強(qiáng)　張小兵

?

不同固定液對(duì)大鼠耳蝸一氧化氮合酶表達(dá)及透射電鏡觀察的影響△

陳小婉1江英2仇志強(qiáng)1張小兵1

【摘要】目的探尋用于觀察大鼠耳蝸誘生型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase，iNOS)表達(dá)及透射電鏡檢查最適合的固定液配比，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)手段。方法將正常大鼠6只(12耳,正常組)和慶大霉素耳中毒模型大鼠6只(12耳，模型組)各分為A、B兩組(每組各3只，6耳)，A組給予2.5%多聚甲醛-2.5%戊二醛、B組給予4%多聚甲醛-0.5%戊二醛混合液心內(nèi)灌注耳蝸固定處死,然后進(jìn)行耳蝸免疫組化染色及透射電鏡觀察，比較兩組耳蝸的染色和電鏡固定效果。結(jié)果正常組與模型組大鼠的耳蝸外毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)等均有iNOS陽(yáng)性表達(dá);但正常組及模型組的A組耳蝸組織免疫組化染色有輕度溶解，背景染色不佳，B組耳蝸組織細(xì)胞染色清晰，對(duì)比度及透明度好，背景無(wú)明顯著色。正常組及模型組中A、B兩組電鏡下耳蝸細(xì)胞器等微結(jié)構(gòu)清晰。結(jié)論4%多聚甲醛-0.5%戊二醛混合液心內(nèi)灌注的方法既能較好地固定大鼠耳蝸細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)，也能較好的保留iNOS抗原。

【關(guān)鍵詞】大鼠；誘生型一氧化氮合酶；透射電鏡；固定液；慶大霉素

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-12-299：23

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20151229.0923.004.html

△蘭州大學(xué)第一醫(yī)院青年基金資助(ldyyynqn201005)

1蘭州大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科(蘭州730000)；2蘭州大學(xué)

NO的過(guò)量表達(dá)在慶大霉素耳毒性的機(jī)制中起到了重要的作用。誘生型一氧化氮合成酶(induced nitric oxide synthase，iNOS)的檢測(cè)被廣泛應(yīng)用于慶大霉素類藥物耳毒性的相關(guān)研究中，且常同時(shí)聯(lián)合電子顯微鏡觀察耳蝸細(xì)胞器的形態(tài)變化，已有研究分別采用4.0%甲醛和2.5%戊二醛固定耳蝸的方法[1，2]，但是處理耳蝸耗費(fèi)時(shí)間較多、對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的要求較高，易影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。近年的報(bào)道多采用多聚甲醛-戊二醛混合液心內(nèi)灌注的固定方法[3~6]，本研究擬通過(guò)采用2.5%多聚甲醛-2.5%戊二醛混合液及4%多聚甲醛-0.5%戊二醛混合液對(duì)大鼠進(jìn)行心內(nèi)灌注，比較兩種固定液處理后大鼠耳蝸iNOS表達(dá)及電鏡觀察結(jié)果，以期探尋適合同時(shí)進(jìn)行耳蝸iNOS檢測(cè)和電鏡觀察的固定液配比。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為Wistar大鼠12只(24耳)，雄性，體重200~250 g(蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，ABR反應(yīng)閾均正常；將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為兩組：正常組6只(12耳)、慶大霉素耳中毒模型組(模型組)6只(12耳)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器iNOS試劑盒(武漢博士德公司)，多克隆二抗(武漢博士德公司)。透射電鏡(日本JEOL-1230型，日本電子公司)。

1.3慶大霉素模型組造模模型組大鼠每天腹腔注射慶大霉素150 mg/kg，連續(xù)10天；正常組每天腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)10天；完成注射后兩組分別檢測(cè)ABR。

1.4耳蝸取材固定方法模型組及正常組完成腹腔注射及ABR測(cè)試后，將每組大鼠再分為A、B兩組，每組3只(6耳)，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后A組給予2.5%多聚甲醛-2.5%戊二醛混合液、B組給予4%多聚甲醛-0.5%戊二醛心內(nèi)灌注處死，至灌注側(cè)對(duì)側(cè)股靜脈流出清亮固定液后繼續(xù)推注固定液約50 ml，取出耳蝸，4 ℃相應(yīng)固定液中過(guò)夜。

1.5各組耳蝸及腎臟組織iNOS表達(dá)檢測(cè)所有大鼠左耳以10%甲酸脫鈣后石蠟包埋，連續(xù)切片，檸檬酸修復(fù)，檢測(cè)耳蝸組織中iNOS的表達(dá)；iNOS免疫組化SABc法步驟：切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，梯度水化，抗原修復(fù)，正常山羊血清封閉，滴加兔抗鼠iNOS抗體(購(gòu)自武漢博士德試劑公司)，4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS洗，加二抗(生物素化羊抗兔IgG)，37 ℃放置30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片；陰性對(duì)照用PBS代替一抗，其余步驟相同；取正常組大鼠腎臟4 ℃相應(yīng)固定液中過(guò)夜，作為陽(yáng)性對(duì)照。耳蝸毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)等部位的細(xì)胞核、胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為iNOS表達(dá)陽(yáng)性；腎小管細(xì)胞的胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為表達(dá)陽(yáng)性，顏色越深表達(dá)越強(qiáng)。

每側(cè)耳蝸連續(xù)切片5張，每張腎臟切片隨機(jī)抽取10個(gè)高倍視野，染色后依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：①切片完整、貼片恰當(dāng)10分；②切片較薄和均勻20分； ③無(wú)皺折10分；④無(wú)刀痕10分；⑤染色清晰、對(duì)比度、透明度好30分；⑥目標(biāo)細(xì)胞是否完整、溶解 10分；⑦靶點(diǎn)是否正確10分；⑧有無(wú)背景著色5分；總分越高，切片質(zhì)量越好。

1.6透射電鏡觀察各組耳蝸細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)各組大鼠的右耳耳蝸以10%EDTA脫鈣后樹(shù)脂包埋，切片，透射電鏡觀察耳蝸毛細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，觀察線粒體、高爾基體等結(jié)構(gòu)是否清晰、組織對(duì)比度是否良好。

2結(jié)果

2.1各組給藥前后ABR閾值正常組給藥前后ABR閾值無(wú)明顯變化，模型組動(dòng)物給藥后ABR閾值較給藥前明顯增高(表1)。

±s)

注：*與同組給藥前比較，P<0.05

2.2不同固定液處理后各組耳蝸iNOS表達(dá)比較A、B兩組動(dòng)物的耳蝸毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋內(nèi)均有iNOS棕黃色顆粒沉著，其中正常組大鼠顯色強(qiáng)度較模型組大鼠弱。正常組及模型組的A組細(xì)胞有輕度溶解、背景染色不佳(圖1a、b)。正常組及模型組的B組組織固定效果較好，耳蝸切片較薄、均勻，細(xì)胞染色清晰、對(duì)比度、透明度好，背景無(wú)明顯著色(圖1d、e)。正常組及模型組中A、B亞組切片質(zhì)量評(píng)分見(jiàn)表2，B組評(píng)分均高于A組。正常大鼠腎臟兩種固定液組(A、B組)的iNOS均在腎小管表達(dá)(圖1c、f)。

表2　正常組及模型組中A、B兩組耳蝸切片

注：*與B組比較，P<0.05

2.3正常組及模型組耳蝸電鏡觀察電子顯微鏡下觀察，兩組內(nèi)耳毛細(xì)胞內(nèi)的線粒體、高爾基體等均結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)明顯差別(圖2)。

3討論

慶大霉素的耳毒性機(jī)制被證實(shí)和氧化損傷有關(guān)，NO在其中起重要作用；近來(lái)研究的熱點(diǎn)集中在抗氧化劑、iNOS抑制劑等對(duì)其耳毒性的保護(hù)作用，如丹參、?；撬岬人幬锟梢酝ㄟ^(guò)降低iNOS的表達(dá)保護(hù)耳蝸的功能[2,7~9]。由于NO氣體分子的特性，現(xiàn)常采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)NOS 的水平以評(píng)估NO的水平，需同時(shí)觀察組織的形態(tài)學(xué)變化時(shí)，多聯(lián)合電子顯微鏡觀察組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。免疫組化方法要求最大限度破壞細(xì)胞膜， 增加抗體的穿透性來(lái)標(biāo)記抗原，多采用4%的多聚甲醛固定組織，而電子顯微鏡要求保留細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)，使顯微結(jié)構(gòu)清晰，多用2.5%戊二醛固定組織。因此，以往的實(shí)驗(yàn)大多采用將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物快速斷頭取出聽(tīng)泡，兩耳分別給予4.0%多聚甲醛和2.5%戊二醛進(jìn)行前庭窗灌注的方法來(lái)固定[1，2]；這種方法對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的技術(shù)要求較高，而且易引起毛細(xì)胞的自溶而影響試驗(yàn)結(jié)果。近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)中逐漸采用不同濃度配比的戊二醛-甲醛混合液固定組織，并且采用心內(nèi)灌注的方法。故本研究采用2.5%多聚甲醛-2.5%戊二醛混合液及文獻(xiàn)有報(bào)道的4%多聚甲醛-0.5%戊二醛混合液[3~6]，以心內(nèi)灌注的方法分別處死固定大鼠耳蝸，比較兩種方法處理后大鼠耳蝸iNOS的表達(dá)和透射電鏡觀察效果。這種固定液心內(nèi)灌注的方法能夠讓固定液在脈管系統(tǒng)內(nèi)快速到達(dá)內(nèi)耳組織進(jìn)行固定，縮短了將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斷頭、取出聽(tīng)泡、開(kāi)放前庭腔注入固定液固定的時(shí)間，從而減少組織離體至開(kāi)始固定的時(shí)間對(duì)免疫組化結(jié)果的影響，也能達(dá)到電鏡標(biāo)本快速固定的要求。

圖1　各組不同固定液固定后耳蝸、腎臟切片(HE×200)

a 正常組大鼠A組耳蝸；b 模型組大鼠A組耳蝸；c 正常組大鼠A組腎小管；d 正常組大鼠B組耳蝸；e 模型組大鼠B組耳蝸；f 正常組大鼠B組腎小管

圖2　各組耳蝸透射電鏡結(jié)果

a. 正常組大鼠A組耳蝸外毛細(xì)胞；b. 模型組大鼠A組耳蝸外毛細(xì)胞；c. 正常組大鼠B組耳蝸外毛細(xì)胞；d. 模型組大鼠B組耳蝸外毛細(xì)胞

iNOS表達(dá)在正常大鼠腎臟的腎小管，A、B兩組大鼠腎臟的腎小管均有iNOS表達(dá)，表明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，混合固定液可以保存iNOS抗原。有作者采取分子雜交的方法發(fā)現(xiàn)正常耳蝸有iNOS RNA條帶及蛋白條帶的顯色；有報(bào)道運(yùn)用免疫熒光的方法發(fā)現(xiàn)正常耳蝸也有iNOS熒光顯示；這些結(jié)果從RNA和蛋白水平均證明正常大鼠耳蝸組織有iNOS的弱表達(dá)，表達(dá)位置有毛細(xì)胞、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)[9~13]。從文中結(jié)果看，正常組及模型組大鼠耳蝸外毛細(xì)胞、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)等部位的細(xì)胞胞核棕色深染，正常組大鼠表達(dá)強(qiáng)度明顯較模型組弱，與Shi等[1]結(jié)果相似；Shi等在試驗(yàn)中是采用斷頭處死動(dòng)物、蝸尖鉆孔后注入多聚甲醛的固定方法，而本研究是使用多聚甲醛-戊二醛配比固定液心內(nèi)灌注的固定方法，說(shuō)明本研究方法也可以較好地保存iNOS抗原，結(jié)果可靠。文中結(jié)果顯示，A、B兩組電子顯微鏡下內(nèi)耳毛細(xì)胞的纖毛等超微結(jié)構(gòu)清晰，胞內(nèi)的細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異，說(shuō)明兩種固定液對(duì)于耳蝸細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察無(wú)明顯差異。但是正常組大鼠及模型組大鼠中A組的HE染色質(zhì)量評(píng)分均低于B組，與A組固定液中多聚甲醛濃度偏低，戊二醛濃度偏高有關(guān)；戊二醛穿透性強(qiáng)，它能快速而不可逆地與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)，使蛋白凝固從而固定組織，也可以固定和蛋白質(zhì)有關(guān)的或含有氨基和亞氨基的脂類；但無(wú)法阻止后面的脫水、滲透和包埋過(guò)程對(duì)樣品脂類的抽提，因而對(duì)細(xì)胞膜的固定效果不理想；同時(shí)與氨基的不可逆反應(yīng)導(dǎo)致部分抗原封閉進(jìn)而影響免疫組化的結(jié)果，從而導(dǎo)致A組的免疫組化染色不佳，組織有溶解現(xiàn)象；而B(niǎo)組所用的固定液提高多聚甲醛的濃度后很好地解決了這些問(wèn)題，故B組免疫組化染色質(zhì)量?jī)?yōu)于A組。

文中結(jié)果表明，采用4%多聚甲醛-0.5%戊二醛混合液心內(nèi)灌注固定即能夠較好地保存iNOS抗原,又能夠較好地固定細(xì)胞器，從而達(dá)到較好的電鏡觀察標(biāo)本的固定效果，也能達(dá)到較滿意的免疫組化染色效果。實(shí)驗(yàn)操作不需要斷頭取出耳蝸分別處理，縮短了取出標(biāo)本固定的時(shí)間，技術(shù)操作簡(jiǎn)單易行，值得推廣。

參考文獻(xiàn)4

1Shi L, An Y, Wang A, et al.The protective effect of Salvia miltiorrhiza on gentamicin-induced ototoxicity[J].Am J Otolaryngol,2014,35:171.

2Liu HY, Chi FL, Gao WY.Taurine attenuates aminoglycoside ototoxicity by inhibiting inducible nitric oxide synthase expression in the cochlea[J]. Neuroreport,2008,19:117.

3張文麗，李倩，郭靜,等.未脫鈣耳蝸組織樹(shù)脂包埋與切片方法[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2013，29：1142.

4胡吟燕，孫建和，汪學(xué)勇,等.耳蝸組織低溫包埋切片技術(shù)[J].聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志，2005, 13：378.

5張亞，鄒靜，Pyykko I,等.線粒體毒素誘導(dǎo)伴有眩暈的突發(fā)性耳聾模型的建立[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27：14.

6謝鼎華,郭運(yùn)凱,伍偉景,等. 慶大霉素對(duì)內(nèi)側(cè)橄欖耳蝸傳出神經(jīng)毒性作用的形態(tài)學(xué)觀察[J].中華耳鼻咽喉科雜志,1999，34：157.

7穆恩，姜學(xué)鈞，楊寧,等.ATP對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素引起的大鼠耳蝸iNOS表達(dá)的影響[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004， 33：314.

8周晶,戴春富.一氧化氮合酶抑制劑對(duì)大鼠耳蝸誘生型一氧化氮合酶mRNA表達(dá)的影響[J].中國(guó)眼耳鼻喉科雜志,2008，8：151.

9王愛(ài)梅，湯浩，沈靜,等.丹參注射液對(duì)慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸血管紋NOS活性的影響[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜，2001, 30：85.

10石麗娟，官捷，湯浩,等. 鏈霉素耳中毒豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)iNOS、Ache表達(dá)及丹參的保護(hù)作用[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2009,25:264.

11沈靜,湯浩,章曉芳,等.誘生型一氧化氮合酶在正常豚鼠耳蝸內(nèi)的分布[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，29：180.

12Yamamoto H, Omelchenko I, Shi X, et al.The influence of NF-kappaB signal-transduction pathways on the murine inner ear by acoustic overstimulation[J]. J Neurosci Res,2009,87:1832.

13付興華,鄧艷麗,盧鶴翔,等.彌漫性腦損傷后SD大鼠內(nèi)耳HO-1、iNOS蛋白與mRNA的表達(dá)[J].中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2012，15：1407.

(2015-04-22收稿)

(本文編輯雷培香)

·實(shí)驗(yàn)研究·

The Effects of Different Fixative on Transmission Electron Microscopy Examination

and Induced Nitric Oxide Synthase Expression in Rat

Chen Xiaowan*, Jiang Ying, Chou Zhiqiang, Zhang Xiaobing

(*Department of Otolaryngology Head and Neck Srugery, The Frist Hospital

of Lanzhou University, Lanzhou, 730000,China)

【Abstract】ObjectiveTo find a more suitable fixative for examining transmission electron microscopy (TEM) and induced nitric oxide synthase(iNOS) measure.MethodsA total of 12 adult male rats (24 ears)with normal hearing were used in this study and randomly divided into control group(6 rats,12 ears) and gentamicin group (6 rats,12 ears). Three rats in each group was fixed with 4%paraform-0.5% glutaraldehyde mixture, the another 3 rats were fixed with 2.5%paraform-2.5% glutaraldehyde mixture. The cochleae were examined by transmission electron microscopy(TEM) to observe ultrastructural changes. In addition, iNOS expression was measured. ResultsThe positive staining of iNOS was observed in the cochlea in all groups. The control groups were weakly positive, while the gentamicin groups were strongly positive. Those tissue sections showed cell dissolved ,uneven dyeing, poor background staining which were fixed with 2.5% paraform-2.5% glutaraldehyde mixture. While there were no significant differences between different fixed groups in TEM results.ConclusionOur resucts indicate that 4%paraform-0.5% glutaraldehyde mixture is better than 2.5%paraform-2.5% glutaraldehyde mixture for fixing rat by heart perfusing for TEM examine and iNOS expression measure.

【Key words】Rat;Induced nitric oxide synthase( iNOS);Transmission electron microscopy(TEM);Fixative;Gentamicin

通訊作者：張小兵(Email:790736924@qq.com)

作者簡(jiǎn)介：陳小婉,女,甘肅人,博士研究生,主要研究方向?yàn)槎茖W(xué)。

【中圖分類號(hào)】R764.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1006-7299(2016)01-0058-04

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.01.015