低頻強(qiáng)聲對巴馬香豬聽功能及耳蝸毛細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的影響

徐海艷　吳瑋,　王剛　韓浩倫　李保衛(wèi)　王鴻南　劉旭

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低頻強(qiáng)聲對巴馬香豬聽功能及耳蝸毛細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的影響

徐海艷1吳瑋1,2王剛2韓浩倫2李保衛(wèi)2王鴻南2劉旭2

【摘要】目的了解高強(qiáng)度低頻率噪聲(低頻強(qiáng)聲)對巴馬香豬聽功能及耳蝸毛細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的影響。方法將8只巴馬香豬隨機(jī)分為對照組(2只)及實(shí)驗(yàn)組(6只)，均于實(shí)驗(yàn)前行聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)檢測后，將實(shí)驗(yàn)組再分為噪聲暴露后即刻、36小時及84小時組，每組2只；實(shí)驗(yàn)各組動物暴露于50 Hz、142 dB SPL的低頻噪聲中5 min，再于暴露后即刻、36小時、84小時分別行ABR檢測，然后分別在掃描電鏡下觀察各組動物耳蝸毛細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化。對照組不給予噪聲暴露，其他步驟同實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果8只(16耳)巴馬香豬低頻強(qiáng)聲暴露前ABR反應(yīng)閾值為91.25±10.72 dB SPL；實(shí)驗(yàn)組低頻強(qiáng)聲暴露后即刻、36 h及84 h所有動物雙耳ABR均未能引出。實(shí)驗(yàn)組噪聲暴露后即刻掃描電鏡下可見內(nèi)外毛細(xì)胞氣球樣變，外毛細(xì)胞靜纖毛融合及散在性缺失；噪聲暴露后36 h可見內(nèi)外毛細(xì)胞輕度氣球樣變、靜纖毛散亂；噪聲暴露后84 h可見耳蝸底回內(nèi)外毛細(xì)胞缺失，中回及頂回內(nèi)外毛細(xì)胞靜纖毛缺失，且以第三排外毛細(xì)胞靜纖毛缺失最重；噪聲暴露后聽毛細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)損傷以基底回和中回為主，頂回?fù)p傷較輕。結(jié)論50 Hz、142 dB SPL噪聲暴露后巴馬香豬雙耳ABR反應(yīng)閾值較暴露前明顯升高；掃描電鏡下可見內(nèi)、外毛細(xì)胞靜纖毛融合、散亂及缺失等改變。

【關(guān)鍵詞】低頻強(qiáng)聲；巴馬香豬；聽性腦干反應(yīng)；毛細(xì)胞

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-12-2815：13

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噪聲是一種普遍存在于生活、職業(yè)環(huán)境中的有害因素，可導(dǎo)致人體心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等多方面的損害，對聽覺系統(tǒng)的危害是最顯著及最特異的[1，2]。由于模擬低頻率高聲壓級噪聲發(fā)生裝備受限，目前大多研究主要關(guān)注高頻噪聲對嚙齒類動物聽功能的影響及其噪聲損傷的發(fā)生機(jī)制。而人類的生活環(huán)境中普遍存在低頻噪聲，且低頻噪聲具有衰減慢、聲波長及較易穿越障礙物的特點(diǎn)，對人體的影響比高頻噪聲更長遠(yuǎn)[3]。因小型豬解剖結(jié)構(gòu)與人類相似，目前已廣泛應(yīng)用于心血管系統(tǒng)、皮膚及糖尿病的研究，且近期研究發(fā)現(xiàn)小型豬作為哺乳動物出生時耳蝸已發(fā)育成熟，其中耳及內(nèi)耳解剖及發(fā)育特點(diǎn)與人類極其相近[4]，因此，本研究擬探討低頻強(qiáng)噪聲暴露對巴馬香豬耳蝸毛細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)及聽功能的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組取外耳道潔凈的健康巴馬香豬(第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)8只，6月齡，體重10~20 kg，雌雄各半，分為對照組2只， 實(shí)驗(yàn)組6只，實(shí)驗(yàn)組再分為噪聲暴露后即刻、36 h、84 h組，每組各2只。

1.2低頻強(qiáng)噪聲暴露方法由動力源、低頻信號發(fā)射器、功率放大器和聲源發(fā)生器組成(第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)發(fā)聲設(shè)備，在聲場內(nèi)發(fā)出50 Hz、142 dB SPL低頻強(qiáng)聲(窄帶噪聲)，將實(shí)驗(yàn)各組巴馬香豬置于該低頻強(qiáng)聲聲場(各處聲壓級相同)內(nèi)，持續(xù)暴露5 min。對照組不給予噪聲暴露，其他飼養(yǎng)條件與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.3聽性腦干反應(yīng)(ABR)測試于實(shí)驗(yàn)前各組動物在隔聲靜電屏蔽室內(nèi)進(jìn)行雙耳ABR檢測，實(shí)驗(yàn)各組分別于噪聲暴露后即刻、36 h、84 h行雙耳ABR檢測。測試方法：3%戊巴比妥(1 mg/kg)耳緣靜脈麻醉后顱頂正中接記錄電極，測試耳參考電極，鼻尖處接地極，單耳閉合聲場給聲；刺激聲為短音，帶通濾波為100～3 000 Hz，信號放大100 000倍，刺激重復(fù)率21.1次/秒，聲刺激持續(xù)時間100 μs，間歇期10 ms，疊加1 024次；刺激聲強(qiáng)度從125 dB SPL開始，先以10 dB遞減，接近反應(yīng)閾時以5 dB遞減，至剛好出現(xiàn)波形，再重復(fù)一次，以能重復(fù)出現(xiàn)穩(wěn)定的波V判斷為ABR反應(yīng)閾值；如果125 dB SPL不能引出反應(yīng)閾則默認(rèn)其閾值為130 dB SPL。測試時注意動物保溫。

1.4耳蝸毛細(xì)胞掃描電鏡觀察實(shí)驗(yàn)各組完成聽性腦干反應(yīng)檢測后，迅速斷頭，用顱骨鉆于顱頂打孔，咬骨鉗將頂骨去除，完整剝離腦組織后，自顱底取出聽泡，挑出鐙骨后，暴露卵圓窗，用2.5%戊二醛溶液耳蝸內(nèi)灌流固定,然后用灌注磷酸緩沖液(pH=7.4)沖洗，一側(cè)耳蝸置于2.5%戊二醛固定液中4 ℃保存，用雙氧水沖洗，再經(jīng)1%四氧化鋨后固定，雙氧水沖洗，梯度酒精脫水，臨界點(diǎn)干燥，離子濺射真空鍍膜，Hitachi S4800掃描電鏡(北京理化分析測試中心提供)下觀察基底膜內(nèi)外毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。對照組完成ABR測試后同法取耳蝸掃描電鏡觀察。

2結(jié)果

2.1各組巴馬香豬噪聲暴露前后ABR反應(yīng)閾比較實(shí)驗(yàn)前8只巴馬香豬(16耳)ABR反應(yīng)閾為80~110 dB SPL，其中，左耳分別為90、105、80、105、80、80、90、110 dB SPL，右耳分別為80、105、95、85、80、90、85、100 dB SPL，16耳平均值為91.25±10.72 dB SPL；噪聲暴露后實(shí)驗(yàn)組6只(12耳)動物ABR反應(yīng)閾均未引出。

實(shí)驗(yàn)各組巴馬香豬經(jīng)低頻強(qiáng)聲暴露后耳蝸毛細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)產(chǎn)生改變，如毛細(xì)胞氣球樣變、靜纖毛倒伏融合、基底板破裂等。噪聲暴露即刻組基底回(圖1b)內(nèi)毛細(xì)胞氣球樣變，外毛細(xì)胞靜纖毛散亂及散在性缺失；中回(圖2b)內(nèi)毛細(xì)胞氣球樣變，外毛細(xì)胞靜纖毛散亂融合，指突、柱細(xì)胞頭突起；頂回(圖3b)內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛廣泛性散亂、倒伏、融合。噪聲暴露36 h組基底回(圖1c)內(nèi)外毛細(xì)胞氣球樣變，中回(圖2c)內(nèi)外毛細(xì)胞靜纖毛散亂，頂回(圖3c)內(nèi)、外毛細(xì)胞輕度氣球樣變性。噪聲暴露84 h組基底回(圖1d)內(nèi)外毛細(xì)胞廣泛性缺失；中回(圖2d)內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛廣泛性缺失，外毛細(xì)胞氣球樣變及靜纖毛散亂、倒伏；頂回(圖3d)內(nèi)外毛細(xì)胞氣球樣變?？梢妼?shí)驗(yàn)各組內(nèi)、外毛細(xì)胞及其靜纖毛以基底回和中回?fù)p傷(特別是基底回)為主，輕者以內(nèi)、外毛細(xì)胞氣球樣變及其靜纖毛散亂、倒伏為主，重者則出現(xiàn)嚴(yán)重的機(jī)械性損傷，如：內(nèi)、外毛細(xì)胞靜纖毛廣泛性缺失甚至外毛細(xì)胞區(qū)表皮板破裂。

圖1　各組動物耳蝸基底回掃描電鏡觀察

a.對照組，內(nèi)外毛細(xì)胞正常；b. 噪聲暴露后即刻組基底回：→內(nèi)外毛細(xì)胞氣球樣變，↑外毛細(xì)胞散在缺失，第三層外毛細(xì)胞缺失較多，↓外毛細(xì)胞靜纖毛融合；c.噪聲暴露后36 h組基低回：↑內(nèi)、外毛細(xì)胞氣球樣變?yōu)橹鳎籨.噪聲暴露后84 h組低基底回：內(nèi)、外毛細(xì)胞缺失

圖2　各組動物耳蝸中回掃描電鏡觀察

a.對照組中回：內(nèi)外毛細(xì)胞局限性輕度氣球樣變；b.噪聲暴露后即刻組中回：↑內(nèi)外毛細(xì)胞靜纖毛散亂,輕度氣球樣變，→指突、柱細(xì)胞頭突起；c.噪聲暴露后36 h組中回：↑內(nèi)、外毛細(xì)胞靜纖毛散亂為主；d.噪聲暴露后84 h組中回：↑外毛細(xì)胞靜纖毛缺失

圖3　各組動物耳蝸頂回掃描電鏡觀察

a.對照組頂回：→外毛細(xì)胞氣球樣變,以第三層外毛細(xì)胞為主；c.噪聲暴露后即刻組頂回：內(nèi)毛細(xì)胞正常,↑外毛細(xì)胞靜纖毛融合；c.噪聲暴露后36 h組頂回↑內(nèi)、外毛細(xì)胞輕度氣球樣變；d.噪聲暴露后84 h組頂回：↑內(nèi)、外毛細(xì)胞氣球樣變，以外毛細(xì)胞為主；↓內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛局限性缺失

3討論

目前在噪聲對聽功能影響的研究方面普遍選用豚鼠或小鼠制備動物模型，但嚙齒類動物的聽覺系統(tǒng)是出生后發(fā)育成熟的，且與人存在明顯的種屬差異；而小型豬作為哺乳動物與人類耳蝸在胚胎期的發(fā)育過程相似，出生時耳蝸已發(fā)育成熟，且小型豬的面神經(jīng)的走形、鼓索神經(jīng)分支的發(fā)出部位、三塊聽小骨的排列與人耳相似[4]；因此，小型豬也可作為中耳及內(nèi)耳相關(guān)研究的良好動物模型。

動物的種屬差異及月齡[5]大小可能會影響ABR反應(yīng)閾，2月齡黑色貴州小型豬聽性腦反應(yīng)閾為25~35 dB[6]，1月齡榮昌豬及5~7周齡的越南小型豬ABR反應(yīng)閾為40~50 dB SPL[5，7]；10~60日齡的巴馬香豬ABR反應(yīng)閾為25~30 dB SPL[8]。本研究選用的6月齡巴馬香豬正處于青春期階段[9]，噪聲暴露前巴馬香豬雙耳平均ABR反應(yīng)閾為91.25±10.72 dB SPL，ABR閾值較高可能與本實(shí)驗(yàn)選用的小型豬為6月齡較其他實(shí)驗(yàn)者所用動物月齡大有關(guān)。

王建軍等[10]認(rèn)為100 Hz、130 dB SPL的低頻強(qiáng)聲持續(xù)暴露4 h對豚鼠耳蝸毛細(xì)胞無明確的損傷，但開啟了凋亡的程序。從本研究結(jié)果看，對照組內(nèi)、外毛細(xì)胞靜纖毛和豚鼠毛細(xì)胞靜纖毛相比長短不齊，頂端毛細(xì)胞靜纖毛比基底回的靜纖毛長，和人耳蝸超微結(jié)構(gòu)相類似[11]；實(shí)驗(yàn)各組耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞及其靜纖毛的病理改變在耳蝸基底回、中回、頂回依次減輕，且以第三排外毛細(xì)胞及靜纖毛損傷最重；該表現(xiàn)和既往關(guān)于高強(qiáng)度低頻穩(wěn)態(tài)噪聲對大鼠耳蝸損傷的規(guī)律相似[12]。本實(shí)驗(yàn)觀察到了低頻強(qiáng)聲對巴馬香豬耳蝸產(chǎn)生了明顯不可逆性的機(jī)械性損傷，與王建軍等[10]實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所不同，可能與該實(shí)驗(yàn)所用130 dB SPL的噪聲[10]低于本實(shí)驗(yàn)所選用的142 dB SPL噪聲聲強(qiáng)有關(guān)。

Chen等[13]將大鼠置于115 dB、中心頻率13.6 kHz噪聲環(huán)境持續(xù)暴露4 h發(fā)現(xiàn)動物噪聲性聽力損傷程度和基底膜內(nèi)、外毛細(xì)胞的缺失密切相關(guān)，噪聲暴露后存活的毛細(xì)胞功能基本正常，而受損傷甚至缺失的毛細(xì)胞幾乎死亡；一定數(shù)量的有功能的毛細(xì)胞是聽覺敏感性的前提條件。豚鼠經(jīng)166 dB的連續(xù)脈沖噪聲暴露后出現(xiàn)耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛的折斷、倒伏及表皮板的穿孔，以上結(jié)構(gòu)的改變是形成永久性閾移的原因之一[14]。從本研究結(jié)果看，噪聲暴露后84 h動物的基底回內(nèi)、外毛細(xì)胞出現(xiàn)廣泛性缺失；噪聲暴露后不同時間各組耳蝸損傷輕者以內(nèi)、外毛細(xì)胞氣球樣變及其靜纖毛散亂、倒伏為主，重者則出現(xiàn)內(nèi)外毛細(xì)胞廣泛性缺失甚至外毛細(xì)胞區(qū)表皮板破裂等嚴(yán)重的機(jī)械性損傷；噪聲暴露后實(shí)驗(yàn)各組動物ABR反應(yīng)閾均未引出，因此推測低頻強(qiáng)聲暴露后巴馬香豬雙耳聽性腦干反應(yīng)閾上移與其內(nèi)耳結(jié)構(gòu)的不可逆性機(jī)械性損傷相關(guān)。

綜上所述，6月齡正常巴馬香豬ABR反應(yīng)閾平均為91.25±10.72 dB SPL，經(jīng)低頻強(qiáng)噪聲暴露后雙耳聽性腦干反應(yīng)閾值明顯上移，掃描電鏡下可見耳蝸聽毛細(xì)胞靜纖毛融合、散亂及缺失等改變，且以基底回及中回?fù)p傷為主。今后擬增加樣本量進(jìn)一步探討低頻強(qiáng)聲對耳蝸的損傷機(jī)制。

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(2015-03-25收稿)

(本文編輯周濤)

·實(shí)驗(yàn)研究·

The Effects of Intense Low Frequency Noise on Hearing Functions and

Hair Cell Surface Structures in Bama Pigs

Xu Haiyan*, Wu Wei, Wang Gang, Han Haolun, Li Bao wei, Wang Hongnan, Liu Xu

(*Chinese PLA Medical School, Beijing,100853,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of intense low frequency noise on hearing functions and hair cell surface structures in bama pigs.MethodsEight bama pigs were randomly divided into a normal control group(2 pigs) and experimental groups(6 pigs). Auditory brainstem response(ABR) was performed before and after noise exposure. The control group was not exposed to the noise but other conditions were the same as the experimental groups. The experimental groups(6 pigs) were randomly divided into immediate group,36 h group, and 84 h group(2 pigs per group),and then were exposed to intense low frequency noise at 142 dB,50 Hz for 5 min according to the three time points. ABR was tested again before the cochleas were collected at the different. The hair cell surface structures were examined with scanning electron microscope(SEM).ResultsFor 8 bama pigs(16 ears), the average ABR threshold before the noise exposure was 91.25±10.72 dB SPL, but they were not elicited after the exposure to the noise at the level of 142 dB,50 Hz for 5 min. The scanning electron microscopy showed inner/outer hair cells ballooning ,outer hair cell stereocillia fusion and sporadic deletion in the immediate group; 36 h group showed inner/outer hair cells ballooning , the outer hair cell scattered stereocillia;84 h group showed missing inner/outer hair cell in the basal turn, the middle and apical turns showed inner/outer hair cell missing stereocillia and greater damage in the third row .The hair cell surface structures showed greater damage in the basal and middle turn than apical turn.

1解放軍醫(yī)學(xué)院(北京100853)；2解放軍第306醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

ConclusionABR thresholds were elevated after noise exposure. SEM showed inner/outer hair cell stereocillia fusion/scattered and deletion etc.

【Key words】Low frequency noise;Bama pig;Auditory brainstem response;Hair cell

通訊作者：吳瑋(Email:entwuwei@126.com)

作者簡介：徐海艷，女，河南人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)樵肼曅悦@。

【中圖分類號】R764.43+3

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1006-7299(2016)01-0045-04

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.01.011