分子印跡固相萃取/高效液相色譜法測(cè)定豬肝中鹽酸克倫特羅的方法研究

湯凱潔，羅秋水*，余瑞龍，吳秋浩

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)　食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西　南昌　330045；2.南昌市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與

控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西　南昌　330045)

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分子印跡固相萃取/高效液相色譜法測(cè)定豬肝中鹽酸克倫特羅的方法研究

湯凱潔1,2，羅秋水1,2*，余瑞龍1,2，吳秋浩1,2

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045；2.南昌市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與

控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045)

摘要：建立了分子印跡固相萃取/高效液相色譜法測(cè)定豬肝中鹽酸克倫特羅殘留量的方法。以ASB C18色譜柱( 250 mm ×4.60 mm，5 μm )分離，流動(dòng)相為甲醇-水(45∶55，pH 3.0)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)243 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速0.6 mL/min,柱溫30 ℃。分子印跡固相萃取條件為：上樣溶劑為雙蒸水，上樣流速為0.6 mL/min；洗脫劑為1%三氟乙酸的甲醇溶液。上述優(yōu)化條件下,該方法在0.432~4.32 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 0。加標(biāo)回收率為84.7%~92.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.5%~1.8%。方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足殘留分析的要求。

關(guān)鍵詞：分子印跡固相萃??；高效液相色譜法；豬肝；鹽酸克倫特羅

鹽酸克倫特羅(Clenbuterol hydrochloride，CLB)，俗名“瘦肉精”，化學(xué)名為“2-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽”，藥品名為“克喘素”，是一種β2-腎上腺素激動(dòng)劑[1-2]。CLB在動(dòng)物體內(nèi)能增強(qiáng)脂解和減慢蛋白質(zhì)分解代謝，具有調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流向和重新分配的作用。人食用有CLB殘留的動(dòng)物組織后，會(huì)對(duì)肝、腎等內(nèi)臟器官產(chǎn)生毒害，出現(xiàn)心悸、頭痛、目眩、惡心、嘔吐、心率加快、肌肉震顫等癥狀，嚴(yán)重者甚至抽搐、暈厥,對(duì)患有高血壓、心臟病、甲亢、前列腺肥大的患者危害更大[3-4]。1997 年我國(guó)農(nóng)業(yè)部正式禁止將“瘦肉精”作為添加劑應(yīng)用在飼料中，但受利益的驅(qū)使，近年來(lái)仍存在違法濫用該藥的現(xiàn)象，由此造成的消費(fèi)者中毒事件屢有報(bào)道，嚴(yán)重危害了廣大人民群眾的身體健康，因而加強(qiáng)“瘦肉精”殘留的監(jiān)測(cè)工作仍然十分必要。

王培龍等[5]報(bào)道了動(dòng)物尿液中鹽酸克倫特羅的分子印跡固相萃取/氣相色譜-質(zhì)譜研究方法，分子印跡固相萃取能較好地凈化動(dòng)物尿液樣品，在鹽酸克倫特羅出峰位置無(wú)任何干擾峰。豬肉中克倫特羅殘留的高效液相色譜分析方法已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道[6-8]，而豬肝作為重要的解毒器官之一，其可能的殘留量更高，應(yīng)引起消費(fèi)者和相關(guān)執(zhí)法部門重視。采用分子印跡固相萃取柱預(yù)處理豬肝樣品，并進(jìn)行鹽酸克倫特羅檢測(cè)的方法研究國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

國(guó)標(biāo)GB/T 5009.192-2003中的鹽酸克倫特羅殘留檢測(cè)有3種方法[9]，分別為酶聯(lián)免疫法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)。ELISA法方便快速，但由于干擾物質(zhì)多，易產(chǎn)生假陽(yáng)性，且不能準(zhǔn)確定性和定量，陽(yáng)性樣品需進(jìn)一步采用儀器方法確證。HPLC法和GC-MS法雖然定性定量準(zhǔn)確，但國(guó)標(biāo)樣品預(yù)處理步驟多、過(guò)程繁瑣，需要反復(fù)萃取和凈化，不僅耗時(shí)長(zhǎng)，而且由于步驟多導(dǎo)致回收率偏低。分子印跡聚合物的應(yīng)用已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道[10-12]，基于具有特異識(shí)別性能的分子印跡固相萃取小柱進(jìn)行預(yù)處理，可減少樣品預(yù)處理步驟，提高回收率。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了分子印跡固相萃取條件、流動(dòng)相組成和pH值，建立了分子印跡固相萃取/高效液相色譜檢測(cè)豬肝樣品中鹽酸克倫特羅的方法，相比國(guó)標(biāo)方法，該方法的樣品預(yù)處理操作更簡(jiǎn)單、快速，回收率高，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可滿足分析要求。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1材料與儀器

豬肝：購(gòu)自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場(chǎng)。鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)樣品：上海藥物研究所；甲醇、甲酸、三氟乙酸、醋酸銨均為國(guó)產(chǎn)色譜純?cè)噭?/p>

分子印跡固相萃取柱(Supelco MIP-clenbuterol，Sigma-Aldrich 公司)；高效液相色譜儀(美國(guó)Waters 公司);KQ3200型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；WD-12水浴氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)；BS224S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；JK-12固相萃取裝置(北京京科瑞達(dá)科技有限公司)；TDL-5臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制準(zhǔn)確稱取鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品0.043 2 g，以甲醇溶解，定容至100 mL，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.432 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中避光存放。臨用前再用甲醇稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2樣品預(yù)處理準(zhǔn)確稱取搗碎的新鮮豬肝10 g于離心管中，加20 mL甲醇-雙蒸水(50∶50)，超聲處理30 min，取出上清液，殘?jiān)性偌?0 mL甲醇-雙蒸水(50∶50)，超聲提取30 min，合并兩次上清液。將上清液于4 000 r/min離心30 min，傾出上清液至濃縮瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60 ℃濃縮至干。

1.2.3HPLC色譜條件色譜柱：ASB C18柱( 250 mm ×4.60 mm，5 μm )；流動(dòng)相：甲醇-水(45∶55，pH 3.0)，使用前經(jīng)0.45 μm濾膜抽濾裝置脫氣。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：243 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.6 mL/min;柱溫：30 ℃。

2結(jié)果與討論

2.1流動(dòng)相的優(yōu)化

流動(dòng)相的組成直接影響待測(cè)物的峰形和出峰時(shí)間，目前檢測(cè)鹽酸克倫特羅的流動(dòng)相有甲醇-水[13]、甲醇-0.02%乙酸銨[14]、甲醇-0.02%磷酸二氫鈉[15]、乙腈-20 mmol/L磷酸二氫鉀[16]等。本實(shí)驗(yàn)參照了國(guó)標(biāo)GB/T 5009.192-2003中高效液相色譜測(cè)定動(dòng)物性食品中鹽酸克倫特羅殘留量的流動(dòng)相配比，但鹽酸克倫特羅的色譜峰與溶劑峰無(wú)法達(dá)到完全分離(見(jiàn)圖1a)，因此在國(guó)標(biāo)流動(dòng)相的基礎(chǔ)上對(duì)流動(dòng)相配比和pH值做了進(jìn)一步的考察。當(dāng)在甲醇-水(45∶55)流動(dòng)相中添加甲酸調(diào)節(jié)pH值時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同的pH值對(duì)樣品和溶劑峰的分離有很大影響(圖2)，當(dāng)pH 3.0時(shí)，樣品峰和溶劑峰得到了良好的分離(見(jiàn)圖1b)。

進(jìn)一步研究了流動(dòng)相pH值對(duì)鹽酸克倫特羅峰形和出峰時(shí)間的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)流動(dòng)相pH值為3.0時(shí)，樣品峰與溶劑峰的分離度及峰形良好。而當(dāng)流動(dòng)相pH值為3.4時(shí)，樣品在非極性色譜柱上的保留增強(qiáng)，出峰時(shí)間略晚，且不能與溶劑峰完全分開。當(dāng)流動(dòng)相pH值為2.8時(shí)，色譜圖分離不理想。因此本實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相均采用甲醇-水(45∶55)，以甲酸調(diào)至pH 3.0。

2.2分子印跡固相萃取條件的優(yōu)化

Supelco MIP-clenbuterol分子印跡固相萃取(MISPE)柱填料是以鹽酸克倫特羅為模板合成的高分子印跡材料，該柱可選擇性吸附復(fù)雜樣品中的鹽酸克倫特羅，而對(duì)雜質(zhì)為非選擇性吸附，易淋洗。因此，采用該樣品預(yù)處理方法可簡(jiǎn)化國(guó)標(biāo)方法中的多步液液反復(fù)萃取、凈化步驟，提高萃取回收率。MISPE方法中上樣溶劑、上樣速度和洗脫溶劑對(duì)待測(cè)物回收率的影響最明顯，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)該三因素進(jìn)行了優(yōu)化。

2.2.1上樣溶劑對(duì)回收率的影響分別以乙腈、二氯甲烷和雙蒸水為上樣溶劑，收集上樣流出液，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定上樣流出液中鹽酸克倫特羅的含量。圖3是3種上樣溶劑流出液中鹽酸克倫特羅的回收率，當(dāng)采用雙蒸水為上樣溶劑時(shí)，流出液中鹽酸克倫特羅的含量非常少，為1.87 %，說(shuō)明鹽酸克倫特羅被特異性吸附在分子印跡固相萃取柱的填料中。而采用乙腈作為上樣溶劑時(shí)，流出液中有較多的鹽酸克倫特羅被測(cè)出，含量約為23.45%，說(shuō)明鹽酸克倫特羅不能在乙腈溶劑中被特異性吸附。二氯甲烷作為上樣溶劑時(shí),其保留性介于雙蒸水和乙腈之間。由于雙蒸水的保留效果最好，因此實(shí)驗(yàn)采用雙蒸水作為上樣溶劑。

2.2.2上樣速度對(duì)回收率的影響考察了不同上樣速度(0.6，0.8，1.0，1.2 mL/min)對(duì)回收率的影響。準(zhǔn)確移取5.0 mL樣液分兩次加于固相萃取小柱，通過(guò)真空閥調(diào)節(jié)壓力，控制不同流速，收集上樣流出液，氮?dú)獯蹈桑捎? mL甲醇超聲波溶解，高效液相色譜分析。結(jié)果表明，隨著上樣速度的增加鹽酸克倫特羅的回收率下降，當(dāng)上樣速度為0.6 mL/min時(shí)，其回收率最高(92.3%)，但相對(duì)耗時(shí)；而上樣速度大于1.0 mL/min時(shí)，回收率低于90%。因此實(shí)驗(yàn)選擇上樣速度為0.6 mL/min。

2.2.3洗脫溶劑對(duì)回收率的影響分別比較了甲醇、甲醇-10%乙酸和1%三氟乙酸的甲醇溶液對(duì)目標(biāo)化合物的洗脫效果。結(jié)果顯示，3種洗脫溶劑均有一定的洗脫效果(回收率均大于60%)，但1%三氟乙酸的甲醇溶液洗脫效果更好，回收率較高(達(dá)95.3%)，因此選擇1%三氟乙酸的甲醇溶液作為洗脫溶劑。

2.3線性范圍與相關(guān)系數(shù)

將標(biāo)樣儲(chǔ)備液配制成5個(gè)不同濃度的工作液，在優(yōu)化條件下進(jìn)行高效液相色譜分析，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次，以化合物的濃度(x,μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)表明，鹽酸克倫特羅在0.432~4.32 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=30 358x-307.74，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 0。

表1　鹽酸克倫特羅的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

2.4加標(biāo)回收率、檢出限與定量下限

取10 g豬肝空白樣品，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品0.216，0.432，0.864 μg，按照“1.2.2”方法進(jìn)行樣品預(yù)處理。每個(gè)添加量做3次平行，計(jì)算其平均回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。在3個(gè)加標(biāo)水平下，鹽酸克倫特羅的平均回收率為84.7%~92.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.5%~1.8%，符合殘留分析要求?；厥章实慕Y(jié)果與錢鳴蓉等[17]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的測(cè)定結(jié)果(方法的回收率為82%~90%)接近。加標(biāo)樣品色譜圖如圖4所示。根據(jù)信噪比(S/N=3)計(jì)算檢出限(LOD)為0.02 μg/mL。以每次進(jìn)樣體積為10 μL計(jì)算，定量下限(LOQ，S/N=10)為0.34 μg/mL。

3結(jié)論

本文建立了分子印跡固相萃取/高效液相色譜測(cè)定豬肝中鹽酸克倫特羅殘留量的分析方法。實(shí)驗(yàn)對(duì)國(guó)標(biāo)GB/T 5009.192-2003方法中的流動(dòng)相做了調(diào)整，優(yōu)化了Supelco MIP-clenbuterol分子印跡固相萃取條件。在優(yōu)化條件下測(cè)定加標(biāo)豬肝樣品中鹽酸克倫特羅的殘留量，測(cè)定平均回收率為84.7%~92.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%~1.8%，方法的準(zhǔn)確度及精密度結(jié)果滿足獸藥殘留的分析要求。

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Study on Residue Determination of Clenbuterol in Pork Liver by Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction/High Performance Liquid ChromatographyTANG Kai-jie1,2,LUO Qiu-shui1,2*,YU Rui-long1,2,WU Qiu-hao1,2

(1.College of Food Science and Engineering of Jiangxi Agricultural University,Nangchang330045,China;2.Key Lab

of Agricultural Products Processing and Quality Control of Nanchang City,Nangchang330045,China)

Abstract：A molecularly imprinted solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatographic (HPLC) method was firstly developed for the determination of clenbuterol hydrochloride residues in pork liver.The chromatographic conditions were as follows:the column:ASB C18column(250 mm × 4.60 mm,5 μm),mobile phase:methanol-water (45∶55,pH 3.0),UV detection wavelength:243 nm,sample volume:10 μL,flow rate:0.6 mL/min,column temperature:30 ℃.Molecularly imprinted solid phase extraction conditions were as follows:solvent of sample loading:double distilled water,flow rate of loading:0.6 mL/min;elution solvent:methanol solution containing 1%trifluoroacetic acid.Under the optimal conditions,the calibration curve was linear in the range of 0.432-4.32 μg/mL,with linear equation of y=30 358x-307.74(r=0.999 0).The spiked recoveries were in the range of 84.7%-92.0%,with RSDs of 1.5%-1.8%.The accurancy and precision of the method could satisfy the requiremennts for residuals analysis.

Key words：molecularly imprinted solid phase extraction;high performance liquid chromatography(HPLC);pork liver;clenbuterol hydrochloride

中圖分類號(hào)：O657.72；TQ460.72

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào)：1004-4957(2016)01-0115-04

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.01.020

通訊作者：*羅秋水，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：食品質(zhì)量與安全，Tel：15979009720，E-mail：tkjie999@sina.com

基金項(xiàng)目：江西省科技廳支撐項(xiàng)目(2010BSA17500)

收稿日期：2015-07-23；修回日期：2015-08-13