分子印跡固相萃取/高效液相色譜法測定豬肝中鹽酸克倫特羅的方法研究

湯凱潔，羅秋水*，余瑞龍，吳秋浩

(1.江西農(nóng)業(yè)大學　食品科學與工程學院，江西　南昌　330045；2.南昌市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與

控制重點實驗室，江西　南昌　330045)

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分子印跡固相萃取/高效液相色譜法測定豬肝中鹽酸克倫特羅的方法研究

湯凱潔1,2，羅秋水1,2*，余瑞龍1,2，吳秋浩1,2

(1.江西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，江西南昌330045；2.南昌市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與

控制重點實驗室，江西南昌330045)

摘要：建立了分子印跡固相萃取/高效液相色譜法測定豬肝中鹽酸克倫特羅殘留量的方法。以ASB C18色譜柱( 250 mm ×4.60 mm，5 μm )分離，流動相為甲醇-水(45∶55，pH 3.0)，紫外檢測波長243 nm，進樣量10 μL，流速0.6 mL/min,柱溫30 ℃。分子印跡固相萃取條件為：上樣溶劑為雙蒸水，上樣流速為0.6 mL/min；洗脫劑為1%三氟乙酸的甲醇溶液。上述優(yōu)化條件下,該方法在0.432~4.32 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 0。加標回收率為84.7%~92.0%，相對標準偏差(RSD)為1.5%~1.8%。方法的準確度和精密度滿足殘留分析的要求。

關(guān)鍵詞：分子印跡固相萃?。桓咝б合嗌V法；豬肝；鹽酸克倫特羅

鹽酸克倫特羅(Clenbuterol hydrochloride，CLB)，俗名“瘦肉精”，化學名為“2-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽”，藥品名為“克喘素”，是一種β2-腎上腺素激動劑[1-2]。CLB在動物體內(nèi)能增強脂解和減慢蛋白質(zhì)分解代謝，具有調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)的流向和重新分配的作用。人食用有CLB殘留的動物組織后，會對肝、腎等內(nèi)臟器官產(chǎn)生毒害，出現(xiàn)心悸、頭痛、目眩、惡心、嘔吐、心率加快、肌肉震顫等癥狀，嚴重者甚至抽搐、暈厥,對患有高血壓、心臟病、甲亢、前列腺肥大的患者危害更大[3-4]。1997 年我國農(nóng)業(yè)部正式禁止將“瘦肉精”作為添加劑應(yīng)用在飼料中，但受利益的驅(qū)使，近年來仍存在違法濫用該藥的現(xiàn)象，由此造成的消費者中毒事件屢有報道，嚴重危害了廣大人民群眾的身體健康，因而加強“瘦肉精”殘留的監(jiān)測工作仍然十分必要。

王培龍等[5]報道了動物尿液中鹽酸克倫特羅的分子印跡固相萃取/氣相色譜-質(zhì)譜研究方法，分子印跡固相萃取能較好地凈化動物尿液樣品，在鹽酸克倫特羅出峰位置無任何干擾峰。豬肉中克倫特羅殘留的高效液相色譜分析方法已有多篇文獻報道[6-8]，而豬肝作為重要的解毒器官之一，其可能的殘留量更高，應(yīng)引起消費者和相關(guān)執(zhí)法部門重視。采用分子印跡固相萃取柱預(yù)處理豬肝樣品，并進行鹽酸克倫特羅檢測的方法研究國內(nèi)外鮮見文獻報道。

國標GB/T 5009.192-2003中的鹽酸克倫特羅殘留檢測有3種方法[9]，分別為酶聯(lián)免疫法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)。ELISA法方便快速，但由于干擾物質(zhì)多，易產(chǎn)生假陽性，且不能準確定性和定量，陽性樣品需進一步采用儀器方法確證。HPLC法和GC-MS法雖然定性定量準確，但國標樣品預(yù)處理步驟多、過程繁瑣，需要反復萃取和凈化，不僅耗時長，而且由于步驟多導致回收率偏低。分子印跡聚合物的應(yīng)用已有多篇文獻報道[10-12]，基于具有特異識別性能的分子印跡固相萃取小柱進行預(yù)處理，可減少樣品預(yù)處理步驟，提高回收率。本實驗優(yōu)化了分子印跡固相萃取條件、流動相組成和pH值，建立了分子印跡固相萃取/高效液相色譜檢測豬肝樣品中鹽酸克倫特羅的方法，相比國標方法，該方法的樣品預(yù)處理操作更簡單、快速，回收率高，重現(xiàn)性好，結(jié)果準確可靠，可滿足分析要求。

1實驗部分

1.1材料與儀器

豬肝：購自江西農(nóng)業(yè)大學菜市場。鹽酸克倫特羅標準樣品：上海藥物研究所；甲醇、甲酸、三氟乙酸、醋酸銨均為國產(chǎn)色譜純試劑。

分子印跡固相萃取柱(Supelco MIP-clenbuterol，Sigma-Aldrich 公司)；高效液相色譜儀(美國Waters 公司);KQ3200型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；WD-12水浴氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)；BS224S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；JK-12固相萃取裝置(北京京科瑞達科技有限公司)；TDL-5臺式離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2實驗方法

1.2.1標準樣品的配制準確稱取鹽酸克倫特羅標準品0.043 2 g，以甲醇溶解，定容至100 mL，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.432 mg/mL的標準儲備液，置于4 ℃冰箱中避光存放。臨用前再用甲醇稀釋成適當濃度的標準工作液。

1.2.2樣品預(yù)處理準確稱取搗碎的新鮮豬肝10 g于離心管中，加20 mL甲醇-雙蒸水(50∶50)，超聲處理30 min，取出上清液，殘渣中再加10 mL甲醇-雙蒸水(50∶50)，超聲提取30 min，合并兩次上清液。將上清液于4 000 r/min離心30 min，傾出上清液至濃縮瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60 ℃濃縮至干。

1.2.3HPLC色譜條件色譜柱：ASB C18柱( 250 mm ×4.60 mm，5 μm )；流動相：甲醇-水(45∶55，pH 3.0)，使用前經(jīng)0.45 μm濾膜抽濾裝置脫氣。紫外檢測波長：243 nm；進樣量：10 μL；流速：0.6 mL/min;柱溫：30 ℃。

2結(jié)果與討論

2.1流動相的優(yōu)化

流動相的組成直接影響待測物的峰形和出峰時間，目前檢測鹽酸克倫特羅的流動相有甲醇-水[13]、甲醇-0.02%乙酸銨[14]、甲醇-0.02%磷酸二氫鈉[15]、乙腈-20 mmol/L磷酸二氫鉀[16]等。本實驗參照了國標GB/T 5009.192-2003中高效液相色譜測定動物性食品中鹽酸克倫特羅殘留量的流動相配比，但鹽酸克倫特羅的色譜峰與溶劑峰無法達到完全分離(見圖1a)，因此在國標流動相的基礎(chǔ)上對流動相配比和pH值做了進一步的考察。當在甲醇-水(45∶55)流動相中添加甲酸調(diào)節(jié)pH值時，發(fā)現(xiàn)不同的pH值對樣品和溶劑峰的分離有很大影響(圖2)，當pH 3.0時，樣品峰和溶劑峰得到了良好的分離(見圖1b)。

進一步研究了流動相pH值對鹽酸克倫特羅峰形和出峰時間的影響，結(jié)果見圖2。當流動相pH值為3.0時，樣品峰與溶劑峰的分離度及峰形良好。而當流動相pH值為3.4時，樣品在非極性色譜柱上的保留增強，出峰時間略晚，且不能與溶劑峰完全分開。當流動相pH值為2.8時，色譜圖分離不理想。因此本實驗中流動相均采用甲醇-水(45∶55)，以甲酸調(diào)至pH 3.0。

2.2分子印跡固相萃取條件的優(yōu)化

Supelco MIP-clenbuterol分子印跡固相萃取(MISPE)柱填料是以鹽酸克倫特羅為模板合成的高分子印跡材料，該柱可選擇性吸附復雜樣品中的鹽酸克倫特羅，而對雜質(zhì)為非選擇性吸附，易淋洗。因此，采用該樣品預(yù)處理方法可簡化國標方法中的多步液液反復萃取、凈化步驟，提高萃取回收率。MISPE方法中上樣溶劑、上樣速度和洗脫溶劑對待測物回收率的影響最明顯，因此本實驗對該三因素進行了優(yōu)化。

2.2.1上樣溶劑對回收率的影響分別以乙腈、二氯甲烷和雙蒸水為上樣溶劑，收集上樣流出液，通過高效液相色譜法測定上樣流出液中鹽酸克倫特羅的含量。圖3是3種上樣溶劑流出液中鹽酸克倫特羅的回收率，當采用雙蒸水為上樣溶劑時，流出液中鹽酸克倫特羅的含量非常少，為1.87 %，說明鹽酸克倫特羅被特異性吸附在分子印跡固相萃取柱的填料中。而采用乙腈作為上樣溶劑時，流出液中有較多的鹽酸克倫特羅被測出，含量約為23.45%，說明鹽酸克倫特羅不能在乙腈溶劑中被特異性吸附。二氯甲烷作為上樣溶劑時,其保留性介于雙蒸水和乙腈之間。由于雙蒸水的保留效果最好，因此實驗采用雙蒸水作為上樣溶劑。

2.2.2上樣速度對回收率的影響考察了不同上樣速度(0.6，0.8，1.0，1.2 mL/min)對回收率的影響。準確移取5.0 mL樣液分兩次加于固相萃取小柱，通過真空閥調(diào)節(jié)壓力，控制不同流速，收集上樣流出液，氮氣吹干，采用1 mL甲醇超聲波溶解，高效液相色譜分析。結(jié)果表明，隨著上樣速度的增加鹽酸克倫特羅的回收率下降，當上樣速度為0.6 mL/min時，其回收率最高(92.3%)，但相對耗時；而上樣速度大于1.0 mL/min時，回收率低于90%。因此實驗選擇上樣速度為0.6 mL/min。

2.2.3洗脫溶劑對回收率的影響分別比較了甲醇、甲醇-10%乙酸和1%三氟乙酸的甲醇溶液對目標化合物的洗脫效果。結(jié)果顯示，3種洗脫溶劑均有一定的洗脫效果(回收率均大于60%)，但1%三氟乙酸的甲醇溶液洗脫效果更好，回收率較高(達95.3%)，因此選擇1%三氟乙酸的甲醇溶液作為洗脫溶劑。

2.3線性范圍與相關(guān)系數(shù)

將標樣儲備液配制成5個不同濃度的工作液，在優(yōu)化條件下進行高效液相色譜分析，每個濃度重復測定3次，以化合物的濃度(x,μg/mL)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線。實驗表明，鹽酸克倫特羅在0.432~4.32 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=30 358x-307.74，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 0。

表1　鹽酸克倫特羅的加標回收率及相對標準偏差(n=3)

2.4加標回收率、檢出限與定量下限

取10 g豬肝空白樣品，分別加入標準品0.216，0.432，0.864 μg，按照“1.2.2”方法進行樣品預(yù)處理。每個添加量做3次平行，計算其平均回收率，實驗結(jié)果見表1。在3個加標水平下，鹽酸克倫特羅的平均回收率為84.7%~92.0%，相對標準偏差(RSD)為1.5%~1.8%，符合殘留分析要求?；厥章实慕Y(jié)果與錢鳴蓉等[17]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的測定結(jié)果(方法的回收率為82%~90%)接近。加標樣品色譜圖如圖4所示。根據(jù)信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD)為0.02 μg/mL。以每次進樣體積為10 μL計算，定量下限(LOQ，S/N=10)為0.34 μg/mL。

3結(jié)論

本文建立了分子印跡固相萃取/高效液相色譜測定豬肝中鹽酸克倫特羅殘留量的分析方法。實驗對國標GB/T 5009.192-2003方法中的流動相做了調(diào)整，優(yōu)化了Supelco MIP-clenbuterol分子印跡固相萃取條件。在優(yōu)化條件下測定加標豬肝樣品中鹽酸克倫特羅的殘留量，測定平均回收率為84.7%~92.0%，相對標準偏差為1.5%~1.8%，方法的準確度及精密度結(jié)果滿足獸藥殘留的分析要求。

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Study on Residue Determination of Clenbuterol in Pork Liver by Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction/High Performance Liquid ChromatographyTANG Kai-jie1,2,LUO Qiu-shui1,2*,YU Rui-long1,2,WU Qiu-hao1,2

(1.College of Food Science and Engineering of Jiangxi Agricultural University,Nangchang330045,China;2.Key Lab

of Agricultural Products Processing and Quality Control of Nanchang City,Nangchang330045,China)

Abstract：A molecularly imprinted solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatographic (HPLC) method was firstly developed for the determination of clenbuterol hydrochloride residues in pork liver.The chromatographic conditions were as follows:the column:ASB C18column(250 mm × 4.60 mm,5 μm),mobile phase:methanol-water (45∶55,pH 3.0),UV detection wavelength:243 nm,sample volume:10 μL,flow rate:0.6 mL/min,column temperature:30 ℃.Molecularly imprinted solid phase extraction conditions were as follows:solvent of sample loading:double distilled water,flow rate of loading:0.6 mL/min;elution solvent:methanol solution containing 1%trifluoroacetic acid.Under the optimal conditions,the calibration curve was linear in the range of 0.432-4.32 μg/mL,with linear equation of y=30 358x-307.74(r=0.999 0).The spiked recoveries were in the range of 84.7%-92.0%,with RSDs of 1.5%-1.8%.The accurancy and precision of the method could satisfy the requiremennts for residuals analysis.

Key words：molecularly imprinted solid phase extraction;high performance liquid chromatography(HPLC);pork liver;clenbuterol hydrochloride

中圖分類號：O657.72；TQ460.72

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)01-0115-04

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.01.020

通訊作者：*羅秋水，碩士，實驗師，研究方向：食品質(zhì)量與安全，Tel：15979009720，E-mail：tkjie999@sina.com

基金項目：江西省科技廳支撐項目(2010BSA17500)

收稿日期：2015-07-23；修回日期：2015-08-13