新型聚中性紅膜修飾碳糊電極的制備、表征及應(yīng)用

顧　玲，石愛華,武彩艷,張彥茹,張　苗

(1.陜西科技大學(xué)，教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點實驗室，陜西　西安　710021；

2.陜西華星電子集團有限公司，陜西　咸陽　712099)

?

新型聚中性紅膜修飾碳糊電極的制備、表征及應(yīng)用

顧玲1*，石愛華1,武彩艷1,張彥茹1,張苗2

(1.陜西科技大學(xué)，教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點實驗室，陜西西安710021；

2.陜西華星電子集團有限公司，陜西咸陽712099)

摘要：運用一種新型的化學(xué)引發(fā)-電聚合方式將中性紅膜固定到碳糊電極表面，制備出聚中性紅薄膜修飾碳糊電極(PNR/CPE)。利用循環(huán)伏安法(CV)和交流阻抗譜(EIS)對修飾電極的電化學(xué)性能進行研究，借助于掃描電子顯微鏡(SEM)對修飾電極表面進行表征，并采用紅外吸收光譜法(IR)和紫外可見吸收光譜法(UV-Vis)對PNR薄膜結(jié)構(gòu)進行測試。結(jié)果表明，中性紅成功地固定在碳糊電極表面，修飾電極的表面呈現(xiàn)特定的立體化結(jié)構(gòu)，表面的電活性位點增多，電催化性能增大。在優(yōu)化條件下，將該電極應(yīng)用于鯡魚精DNA(hsDNA)的檢測，PNR電極上出現(xiàn)了1對較強的氧化還原峰，峰電流與其濃度在1.0×10-6~8.0×10-5mol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為1.0×10-7mol/L。

關(guān)鍵詞：聚中性紅;化學(xué)引發(fā);碳糊電極;表征;鯡魚精DNA(hsDNA)

修飾電極的表征主要有電化學(xué)和化學(xué)方法兩類，常用的電化學(xué)表征方法有循環(huán)伏安法(CV)、交流阻抗譜(EIS)、計時電流法、計時電量法等。相對而言，化學(xué)表征方法多種多樣，典型的有掃描電子顯微鏡(SEM)、紅外吸收光譜法(IR)、紫外可見吸收光譜法(UV-Vis)、X射線光電子能譜(XPS)等[1]，其中EIS和SEM被廣泛地應(yīng)用于化學(xué)修飾電極的表征[2-3]。

中性紅(NR)是一種良好的電子媒介體，是電極表面設(shè)計時常用的有機染料修飾劑，具有氧化還原性[4]，可以制備導(dǎo)電性良好的氧化還原薄膜修飾電極。聚中性紅修飾電極的應(yīng)用研究較多，但對其表面的表征研究較少[5]。

脫氧核糖核酸(DNA)是一種生物大分子，攜帶生物遺傳因子，在生物的生命活動中起著重要作用[6]。生物體內(nèi)DNA序列的微小改變會引起機體病變，與胚胎發(fā)育、腫瘤生長和癌癥治療息息相關(guān)，在藥物分析與臨床研究中，DNA作為體內(nèi)抗癌藥物的標靶[7]，可用于構(gòu)造良好的幾何體支架來進行藥物研究和臨床診斷，因此，DNA的分析檢測在分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著重要的研究意義[8]。目前，檢測DNA的方法有熒光法[9]、電化學(xué)傳感法[10-12]、雜交技術(shù)[13]、比色法[14]、擴增法[15]、高效液相色譜法[16]、計數(shù)法[17]、拉曼光譜法[18]、等離子體共振法[19]等，其中電化學(xué)傳感器操作簡單、微型靈敏[20]，但中性紅染料修飾電極檢測DNA的研究尚未見報道。本研究采用化學(xué)引發(fā)-電聚合的方法制備了一種新型的聚中性紅膜修飾碳糊電極，并運用CV,EIS,SEM,UV和IR法分別對修飾電極表面進行表征，采用該電極對鯡魚精DNA進行檢測，從而為DNA的檢測提供了新方法。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

LK98BⅡ型電化學(xué)分析系統(tǒng)(天津蘭力科高技術(shù)有限公司)，CHI660e電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，三電極系統(tǒng)：裸碳糊電極和修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲電極為輔助電極；掃描電子顯微鏡(Hitachi S-4800型)；85-1恒溫磁力攪拌器(常州國華電器有限公司);VECTOR-22型傅立葉紅外光譜儀(FT-IR，德國Bruker公司)；DR5000型紫外可見吸收光譜儀(UV-Vis，美國Hatch公司)。

石墨粉(光譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；中性紅(分析純，上海試劑三廠)；含氫硅油(0.18%色譜純)；K2S2O8(分析純，西安化學(xué)試劑廠)；過氧化苯甲酰(BPO，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠)；(NH4)2S2O8(分析純，天津市化學(xué)試劑六廠)；鯡魚精DNA(Sigma公司)；其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水，所有實驗均于室溫下進行。

1.2電極的制備

1.2.1裸碳糊電極(CPE)的制備及活化將質(zhì)量比為4∶1的石墨粉和含氫硅油放入研缽中混合均勻，研磨呈糊狀，在內(nèi)徑3 mm的聚四氟乙烯管的一端內(nèi)填入碳糊，管的另一端插入銅絲作為導(dǎo)線，將制備好的電極在稱量紙上拋光后備用。更新電極表面時，擠出碳糊1~2 mm切除即可。測定或修飾前需將其置于空白底液中活化。

1.2.2中性紅修飾碳糊電極(PNR/CPE)的制備將預(yù)處理的CPE置于1/15 mol/L磷酸鹽緩沖液(PB)+ KNO3底液中活化，取出晾干后再將其浸入含0.1 mmol/L NR+1/15 mol/L PB(pH 5.91)+0.3 mol/L KNO3+6.0 mmol/L K2S2O8的聚合溶液中，65 ℃下恒溫攪拌5 min，待溶液冷卻后，通過CV法在-0.80~0.80 V電位范圍內(nèi)以50 mV/s掃描40圈，取出電極，用水沖洗，自然晾干，即制得化學(xué)引發(fā)-電聚合的PNR/CPE。

1.3實驗方法

運用SEM對所制備的電極進行表征，觀察電極表面的形貌；將電極置于電解質(zhì)溶液中，利用CV和EIS法對其電化學(xué)性能進行研究；將聚合前和聚合后的CPE通過UV與IR方法進行對比分析，對其聚合機理進行推測。以PB+1.0 mmol/L鯡魚精DNA為測定體系，于-0.80~0.00V電位范圍內(nèi)以100 mV/s的掃描速率進行DPV測定，記錄各濃度下的I~E曲線。

2結(jié)果與討論

2.1PNR/CPE的表面形貌

利用SEM對裸碳糊電極(CPE)和新型修飾碳糊電極(PNR/CPE)的表面進行觀察，由圖1可見，CPE表面(圖1A)呈片狀結(jié)構(gòu)，較為平整，而PNR/CPE表面(圖1B)在片狀結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上布滿了大量不規(guī)則的球狀顆粒。這種特異的表面形貌表明中性紅已成功修飾在碳糊電極表面，且球狀結(jié)構(gòu)增大了電極的表面積，增加了電極表面的活性位點，同時也增加了電極與待測物質(zhì)的接觸面積，有利于電極電催化的進行。

2.2PNR/CPE的電化學(xué)性能表征

將經(jīng)過活化的CPE和PNR/CPE分別置于以KCl為支持電解質(zhì)的1.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)]6溶液中，在-0.20~0.80 V電位范圍內(nèi)以100 mV/s掃速進行循環(huán)伏安掃描。由圖2可知，兩支電極上均出現(xiàn)1對較強的氧化還原峰，與CPE(曲線a)上的峰電流(Ipa=16.02 μA;Ipc=22.21 μA)相比，PNR/CPE(曲線b)上的峰電流(Ipa=20.12 μA;Ipc=27.37 μA)明顯增大，是裸電極上峰電流的1.4倍，而且峰形更尖銳，還原峰電位有微小的正移。由此說明，中性紅已被固定在電極表面，形成了聚合物薄膜修飾電極，由于中性紅本身是活潑的電子轉(zhuǎn)移體，使K3[Fe(CN)]6在修飾電極表面的電子轉(zhuǎn)移速率增加，從而提高了K3[Fe(CN)]6在該電極上發(fā)生氧化還原過程的可逆性，增強了電極的電催化性能。

采用交流阻抗法研究了CPE和PNR/CPE在1.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)]6溶液中的阻抗譜圖(如圖3)，電極的電荷轉(zhuǎn)移電阻(Ret)在數(shù)值上等于阻抗譜圖半圓的直徑。由圖3可知，CPE(曲線a)的半圓彎曲弧度較PNR/CPE(曲線b)的彎曲弧度大，所以CPE的電荷轉(zhuǎn)移電阻比PNR/CPE的電荷轉(zhuǎn)移電阻大。當電極表面修飾上中性紅后，PNR/CPE阻礙電子傳遞的能力減小，這是因為修飾電極的表面積增大，電催化活性位點增多，提高了電子轉(zhuǎn)移速率，間接地說明中性紅被修飾到裸碳糊電極表面，降低了電荷轉(zhuǎn)移電阻，提高了修飾電極的電催化性能。

2.3中性紅聚合物薄膜的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1UV-Vis光譜分析用四氫呋喃將PNR/CPE表面的中性紅聚合物溶解出，在相同的pH值條件下，對中性紅單體(NR)和聚合物(PNR)進行紫外光譜測定，結(jié)果見圖4。由圖可見，在普通紫外區(qū)，NR和PNR在291,275，250 nm處分別有1個吸收峰，聚合物的吸收峰發(fā)生較小的藍移，根據(jù)中性紅的分子結(jié)構(gòu)式，此處是苯環(huán)和雜環(huán)化合物的吸收峰；在可見紫外區(qū)，NR在525 nm和440 nm處分別有1個紫外吸收峰，但440 nm處的吸收峰不明顯，被525 nm處的吸收峰掩蓋，形成一個肩峰，而PNR僅在440 nm處有一個明顯的可見吸收峰。據(jù)推測，中性紅經(jīng)過聚合后，結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，525 nm處的吸收峰消失，440 nm處的吸收峰反而增強，可能是某些官能團發(fā)生改變，導(dǎo)致了藍移現(xiàn)象的發(fā)生。另外，空間位阻等因素對分子有效共軛程度的影響也會導(dǎo)致此現(xiàn)象。研究結(jié)果進一步說明經(jīng)過化學(xué)引發(fā)后制備的電極表面存在中性紅聚合物。

2.3.2紅外光譜(IR)分析為了進一步證明中性紅被修飾在碳糊電極表面，對中性紅聚合物的結(jié)構(gòu)進行了紅外光譜鑒定，結(jié)果如圖5所示。

圖5A中3 127 cm-1與3 320 cm-1處的兩個峰是NR中伯胺的ν(N—H)，表明中性紅單體以—NH2形式存在，在2 960 cm-1左右有一個小吸收峰，為苯環(huán)中C—H的吸收峰，1 198，1 327，1 497，1 627 cm-1處是苯環(huán)的骨架振動峰。圖5B中3 400~3 500 cm-1之間的吸收峰是共軛度較大的聚合物大分子的ν(N—H)，1 375 cm-1處是—CH3的彎曲振動，其余的吸收峰和NR紅外譜圖中的峰位相同，為苯環(huán)的骨架振動峰，800 cm-1左右是苯環(huán)二取代的吸收峰。對比兩者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過聚合后化合物的紅外譜圖中3 400~3 500 cm-1處的吸收峰較強，3個峰未完全分開，可能是中性紅聚合物結(jié)構(gòu)中伯胺與仲胺的吸收峰。物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，由此進一步證實，經(jīng)過化學(xué)引發(fā)-電聚合的方式，中性紅單體發(fā)生了聚合轉(zhuǎn)變?yōu)榫酆衔铮恍揎椀铰闾己姌O表面，增加了電極表面的電活性位點，可以促進物質(zhì)的電催化氧化。

2.4hsDNA在PNR/CPE上的電化學(xué)響應(yīng)

將CPE與PNR/CPE置于1.0×10-3mol/L hsDNA+Na2HPO4-C6H8O7的待測體系中，于-0.40~0.60 V電位范圍內(nèi)，以100 mV/s掃速進行循環(huán)伏安檢測。如圖6所示，CPE(曲線a)對hsDNA無電化學(xué)響應(yīng)，循環(huán)伏安曲線平滑，裸電極上無任何峰出現(xiàn)，但在PNR/CPE(曲線b)上出現(xiàn)了1對明顯的氧化還原峰(Epa=0.075 V，Epc=-0.033 V)，說明修飾電極對hsDNA具有很好的電化學(xué)響應(yīng)，可用于hsDNA的測定。

2.5引發(fā)劑的選擇

中性紅作為修飾劑時常采用電引發(fā)方法制備修飾電極[5]，而本研究基于中性紅的聚合機理采用化學(xué)引發(fā)的手段，將過硫酸鉀、過硫酸銨和過氧化苯甲酰作為中性紅聚合的引發(fā)劑，制備出3種不同的修飾電極，分別對hsDNA進行檢測。結(jié)果顯示，hsDNA在過氧化苯甲酰作為引發(fā)劑時制備的PNR/CPE上的氧化還原峰電流較弱；而過硫酸銨作為引發(fā)劑時，hsDNA的催化氧化還原峰電流較強；當用過硫酸鉀作為引發(fā)劑時，修飾電極對hsDNA的響應(yīng)最強。由此表明，過硫酸鉀作為引發(fā)劑時，中性紅在電極表面更容易發(fā)生聚合，聚合效果較好。此外，中性紅聚合只出現(xiàn)了還原聚合峰，可推斷過硫酸鉀在引發(fā)聚合的同時還對中性紅進行了氧化，而還原態(tài)的中性紅具有更多的電活性位點，促進了hsDNA的氧化還原反應(yīng)。因此本研究選用過硫酸鉀為聚合時的引發(fā)劑。

2.6化學(xué)引發(fā)時溫度對電極的影響

化學(xué)引發(fā)時引發(fā)劑對溫度有較高的要求，所以引發(fā)溫度是影響中性紅聚合的重要因素。實驗考察了在50，55，60，65，70，75 ℃下制備的PNR/CPE對鯡魚精DNA的響應(yīng)。結(jié)果顯示，當溫度較低時，其還原峰電流值較小，隨著溫度升至60 ℃，還原峰電流急劇增大，溫度升至65 ℃時，峰電流最大，此后繼續(xù)升高溫度，峰電流逐漸下降。說明溫度升高對中性紅聚合前的引發(fā)有一定的促進作用，使中性紅聚合物更容易固定在電極表面，并以65 ℃時中性紅的聚合效果最好，為最佳引發(fā)溫度。但隨著溫度進一步升高，電極表面發(fā)生了沸裂，破壞了修飾電極的表面結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致該電極的電催化性能急劇下降。

2.7線性范圍與檢出限

在優(yōu)化實驗條件下，運用差分脈沖伏安法(DPV)，以Na2HPO4-C6H8O7緩沖液+不同濃度的hsDNA作為工作溶液，進行檢測。結(jié)果顯示：在1.0×10-6~8.0×10-5mol/L范圍內(nèi)，hsDNA的峰電流與其濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Ipc=0.001 75c+0.767(r=0.993 4)，檢出限(S/N=3)為1.0×10-7mol/L。

2.8重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及干擾實驗

用同一支PNR/CPE對hsDNA溶液平行測定6次，相對標準偏差(RSD)為4.8%，新制備的修飾電極在空白溶液中放置1周后，在相同條件下測定hsDNA，電流降幅不大，說明此電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好。

3結(jié)論

本研究表明,與CPE對比，新型的中性紅聚合薄膜內(nèi)具有多個電化學(xué)活性位點，阻抗電荷傳導(dǎo)的能力下降，提高了電子轉(zhuǎn)移速率。UV-Vis與IR光譜結(jié)果說明中性紅分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，從分子層面驗證了中性紅經(jīng)過化學(xué)引發(fā)-電聚合的方式發(fā)生聚合。此外，PNR/CPE對hsDNA有很強的電化學(xué)響應(yīng)，實現(xiàn)了有機染料修飾碳糊電極測定生物大分子的預(yù)期，建立了一種hsDNA的電化學(xué)檢測新方法。

參考文獻：

[1]Jiang W C.ShanghaiChem.Ind.(蔣偉春.上?；?,2004,29(3):33-35.

[2]Kuralay F,Erdem A,AbacS,?zy?rük H.Colloid.Surf.B,2013,105:1-6.

[3]Dadarwal R,Namvar A,Thomas D F,Hall J C,Warriner K.Mater.Sci.Eng.C,2009,29:761-765.

[4]Chou X H.InnerMonguliaPetrochem.Ind.(丑曉紅.內(nèi)蒙古石油化工),2012,(2):9-10.

[5]Yang C M,Yi J L,Tang X J,Zhou G Z,Zeng Y.React.Funct.Polym.,2006,66:1336-1341.

[6]Yang F,Zhang Y G,Tian C.J.Univ.Sci.Technol.Chin.,2011,41(11):1028-1034.

[7]Kang T,Yoo S M,Yoon I,Lee S Y,Bongsoo Kim B.NanoLett.,2010,10:1189-1193.

[8]Dave N,Liu J.ACSNano,2011,5(2):1304-1312.

[9]Mao Q,Geng T L,Wang S H.Spectrosc.SpectralAnal.,2014,6:1577-1581.

[10]Liu X Q,Aizen R,Freeman R,Yehezkeli O,Willner I.ACSNano,2012,6(4):3553-3563.

[11]Li F X,Cai X L,Zheng C F,Wang X,Gao F,Wang Q X.J.Instrum.Anal.(李拂曉,蔡細麗,鄭成鳳,王霞,高飛,汪慶祥.分析測試學(xué)報),2013,32(4):414-419.

[12]Chow K F,Mavré F,Crooks R M.J.Am.Chem.Soc.,2008,130(24):7544-7545.

[13]Li F,Xu J.Chin.J.Comput.(李菲,許進.計算機學(xué)報),2013,36(9):1826-1834.

[14]Lin Y Z,Chang P L.ACSAppl.Mater.Interface,2013,5(22):12045-12051.

[15]Tang W,Wang H,Wang H H,Li Z P.Chin.J.Anal.Chem.(湯薇,王輝,王洪紅,李正平.分析化學(xué)),2014,42(4):489-494.

[16]Zou R J,Jiang X Y,Xu Y J,Song X J,Gong X H,Liu H H,Tian X H,Liu Y,An H H,Zhang X Z.J.Instrum.Anal.(鄒榮婕,姜向陽,徐英江,宋向軍,宮向紅,劉慧慧,田秀慧,劉云,安紅紅,張秀珍.分析測試學(xué)報),2014,33(7):780-785.

[17]Xu F G,Ren J C.Chin.J.Anal.Chem.(許發(fā)功,任吉存.分析化學(xué)),2009,37(10):F094.

[18]Barhoumi A,Halas N J.J.Phys.Chem.Lett.,2011,2:3118-3123.

[19]Yang J,Zhai S J,Hou W S,Zheng X L,Liu X S,Zhang L G,Hou C J.J.Funct.Mater.Devices(楊軍,翟盛杰,侯文生,鄭小林,劉向紹,張麗果,侯長軍.功能材料與器件學(xué)報),2008,14(2):530-533.

[20]Yuan X N,Qiu W W,Li F X,Xie L Q,Xu P Y,Gao F,Wang Q X,Gao F.J.Instrum.Anal.(苑小寧,邱瑋瑋,李拂曉,謝麗清,徐飄揚,高鳳,汪慶祥,高飛.分析測試學(xué)報),2015,34(5):512-518.

皮蛋新“國標”實施鉛含量不得大于0.5 mg/kg

皮蛋因其豐富獨特的口感受到很多人的喜歡，但是其生產(chǎn)過程中是否含鉛讓人心有顧忌。不過自2015年12月1日起，皮蛋也有了新的國家標準。由質(zhì)檢總局、國家標準化管理委員會發(fā)布的新規(guī)規(guī)定，皮蛋的鉛含量不得大于0.5 mg/kg。

據(jù)了解，我國首次發(fā)布針對皮蛋的國標是在1988年，編號為GB/T 9694-1988，這項標準目前已經(jīng)廢止，取而代之的是新國標GB/T 9694-2014，新國標于2014年12月發(fā)布， 2015年12月1日起實施。新國標中指出，“本標準與GB/T 9694-1988《皮蛋》相比，改寫了'鉛、銅、砷、鋅'指標為'污染物指標總砷、鉛、總汞和鎘應(yīng)符合GB2762的規(guī)定'，并刪去銅和鋅的指標要求。”同時，新“國標”中刪去了對于傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的溏心皮蛋其鉛含量應(yīng)該小于等于3 mg/kg。

近年來，在各地食品質(zhì)量抽查中，不合格皮蛋總是榜上有名。據(jù)了解，皮蛋類產(chǎn)品的不合格項主要為鉛含量和食品標簽(未標注凈含量)。

(信息來源：中國經(jīng)濟網(wǎng))

Study on Preparation,Characterization and Application of a Novel Poly Neutral Red Film Modified Carbon Paste ElectrodeGU Ling1*，SHI Ai-hua1,WU Cai-yan1,ZHANG Yan-ru1,ZHANG Miao2

(1.Key Laboratory of Auxiliary Chemistry & Technology for Chemical Industry Ministry of Education,Shaanxi University

of Science & Technology,Xi’an710021,China；2.Shaanxi Huaxing Electronic Group

Co.Ltd.,Xianyang712099,China)

Abstract：A novel poly neutral red film modified carbon paste electrode(PNR/CPE) was prepared by chemical initiation-electrochemical polymerization.The electrochemical properties of the modified electrode were characterized by cyclic voltammetry(CV) and electrochemical impedance spectroscopy(EIS),the surface morphology of the ploy neutral red film was observed by scanning electron microscopy (SEM).Meanwhile,the membrane structure of PNR was tested and analyzed by ultraviolet visible absorption(UV-Vis) and infrared absorption spectrometry(IR).The result showed that the neutral red was modified successfully on the surface of carbon paste electrode,and the surface of PNR/CPE had a specific three-dimensional structure,in which the electroccatalytic performance was improved with the increase of the electroactive sites of the surface.Under the optimal experimental conditions,the modified electrode was applied in the detection of herring sperm DNA(hsDNA).The result indicated that a pair of obvious redox peak appeared on the PNR/CPE,the peak currents and concentrations of hsDNA had a good linear relationship in the range of 1.0×10-6-8.0×10-5mol/L with a detection limit of 1.0×10-7mol/L.

Key words：ploy neutral red;chemical initiation;carbon paste electrode;characterization;herring sperm DNA(hsDNA)

中圖分類號：O657.1;Q523

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)01-0085-06

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.01.014

通訊作者：*顧玲，副教授，研究方向：電化學(xué)分析，Tel：15091802996，E-mail:gul@sust.edu.cn

收稿日期：2015-05-05；修回日期：2015-07-01