一起由副溶血性弧菌引起食源性疾病的實驗室快速診斷

宋華

（成都市疾病預(yù)防控制中心，四川610041）

一起由副溶血性弧菌引起食源性疾病的實驗室快速診斷

宋華

（成都市疾病預(yù)防控制中心，四川610041）

弧菌，副溶血性/分離和提純；食物中毒/診斷；實驗室技術(shù)和方法；病例報告

2014年某日中午成都市某餐廳舉行婚宴，共150余人進(jìn)餐。1人于晚21：00出現(xiàn)上腹疼痛與水樣便腹瀉癥狀。至第2天中午12：00共24人出現(xiàn)相同癥狀。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、臨床資料和實驗室診斷確認(rèn)為由副溶血性弧菌引起的食源性疾病，現(xiàn)報道如下。

1　臨床資料

采集餐廳可疑食物和環(huán)境涂抹樣7份、患者肛拭大便12份。培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)［1］要求制作，采用VITEKAMS微生物系統(tǒng)生化鑒定卡（法國生物-梅里埃公司生產(chǎn)）檢測。具體步驟：（1）肛拭大便進(jìn)行可疑食物增菌18h同時分離培養(yǎng)18 h；（2）挑取可疑菌落接種于He培養(yǎng)基（hektoen enteric agar，He）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（mac conkey，Mac）、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS）、含1.5%蛋白胨營養(yǎng)瓊脂和血平板36℃培養(yǎng)18 h；（3）挑取乳糖陰性、氧化酶陽性、革蘭陰性桿菌陽性轉(zhuǎn)種三糖鐵36℃培養(yǎng)8 h，制成菌懸液，接種于革蘭陰性菌鑒定卡生化鑒定5～10 h報告結(jié)果。12份肛拭大便在He、Mac平板上培養(yǎng)結(jié)果為乳糖陽性、氧化酶陰性、革蘭陰性桿菌陽性，6份肛拭大便在He、Mac平板上培養(yǎng)結(jié)果為乳糖陰性、氧化酶陽性、革蘭陰性桿菌陽性。6份肛拭大便均分離出副溶血性弧菌（其中5份生化編碼為6003000024，鑒定率為86.0%，1份生化編碼為6003000026，鑒定率為96.0%）。7份可疑食物和環(huán)境涂抹樣中從蝦中分離出副溶血性弧菌（生化編碼為6003000024，鑒定率為86.0%），未分離出其他腸道致病菌和致病性球菌。蝦和6份患者肛拭大便均分離出副溶血性弧菌，其中5人與蝦中分離的菌株生化編碼一致，提示本次食源性疾病是由副溶血性弧菌所致。

2　討論

細(xì)菌是引起食源性疾病的最主要原因。世界衛(wèi)生組織報告表明，全球食源性疾病患者達(dá)數(shù)億人，每年約有幾億腹瀉病例，導(dǎo)致約300萬5歲以下兒童死亡，其中約70.0%因為生物源性污染食品所致。在發(fā)展中國家估計每年發(fā)生腹瀉及其相關(guān)疾病者2.7億例，導(dǎo)致240萬5歲以下兒童死亡［1］。我國國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)從1992～2001年對北京、重慶、福建等13個省、自治區(qū)、直轄市覆蓋人口6.43億（占我國人口50.8%）的監(jiān)測結(jié)果表明，10年間上報食源性疾病暴發(fā)事件5 770起，患者162 995例，其中微生物引起的食源性疾病事件和涉及的人數(shù)最多，分別占總數(shù)的38.0%、50.9%，患者數(shù)約為化學(xué)物引起的2倍?？紤]到癥狀輕未就診或漏報等原因，我國實際食源性疾病患者數(shù)應(yīng)為（20～40）萬/年，而隱性感染者可能更多［2］。中國工程院院士陳君石表示，最近一項食源性疾病主動監(jiān)測結(jié)果顯示，我國平均6.5人中就有1人罹患食源性疾病，食源性疾病已成為我國頭號食品安全問題［3］。但由于各種條件限制，細(xì)菌性食源性疾病的實驗室診斷率較低。作者結(jié)合本次食源性疾病的案例，就細(xì)菌性食源性疾病的實驗室診斷各階段操作體會如下。

2.1采樣階段采樣是采取物質(zhì)、材料或產(chǎn)品的一部分，作為其整體的代表性樣品進(jìn)行檢測的一種規(guī)范操作。在諸多技術(shù)環(huán)節(jié)中采樣最具不確定性。沒有有效的采樣，實驗室診斷就無從談起。在實際工作中由于對食物中毒調(diào)查采樣不夠規(guī)范，直接影響了實驗室診斷結(jié)果，對確定中毒病因造成很大的影響［4］。有效性的采樣應(yīng)包括樣品的代表性、采樣的及時性和操作的規(guī)范性。

2.1.1樣品的代表性采集的樣品應(yīng)具有代表性，能反映食源性疾病發(fā)生時的食品衛(wèi)生狀況。樣品采集應(yīng)根據(jù)臨床癥狀和現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，有重點、有目的地進(jìn)行。采樣的對象應(yīng)包括可疑食物、嘔吐物、糞便、血液、容器與環(huán)境涂抹樣等。在食源性疾病的實驗室快速診斷中，患者糞便是不可忽視的，這是因為：（1）細(xì)菌性食源性疾病患者糞便中的菌相分布相對可疑食物簡單，病原菌呈一定優(yōu)勢生長；（2）糞便可直接培養(yǎng)，節(jié)省了增菌時間，通過生化鑒定往往可以比食物更早分離出病原菌；（3）不同細(xì)菌性食源性疾病臨床癥狀往往非常相似，用流行病學(xué)手段往往難以準(zhǔn)確界定病原菌，如果可疑食物多（如宴會等），單從可疑食物入手，實驗室診斷工作量會非常大。本次食源性疾病就早于食物18 h從4份患者肛拭大便中分離出副溶血性弧菌，對后來的可疑食物的病原菌分離具有一定指導(dǎo)意義。此外對采用傳統(tǒng)方法的實驗室，同時還應(yīng)盡量采集患者急性期及恢復(fù)期的雙份血清，觀察其效價是否增高，為確診病原菌提供可靠依據(jù)。

2.1.2采樣的及時性在食源性疾病調(diào)查中樣品采集往往由其可獲性所決定。因此，能否對食源性疾病進(jìn)行準(zhǔn)確的實驗室診斷，很大程度上取決于采樣的及時性。馬鶯華［5］對平湖市1993～2003年細(xì)菌性食源性疾病進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，采樣時間與病原菌檢出率密切相關(guān)。發(fā)病后24 h內(nèi)采集病原菌檢出率為93.1%，發(fā)病后24 h以上采樣檢出率僅為8.3%。接到食源性疾病報告后應(yīng)盡快趕到現(xiàn)場及時采樣，避免患者大劑量注射或服用抗生素及可疑食物和現(xiàn)場被人為破壞。

2.1.3操作的規(guī)范性樣品的采集、包裝、標(biāo)識、運(yùn)送、保留與記錄應(yīng)按照相關(guān)規(guī)范執(zhí)行。采樣過程中對影響檢測結(jié)果的各種因素要嚴(yán)格控制，尤其是對無菌操作、樣品包裝、運(yùn)送條件與時間的控制。如果患者已服用抗生素，應(yīng)了解抗生素的種類、劑量和服用時間，并告之實驗室，以便實驗室對樣品采取對應(yīng)措施。在食源性疾病調(diào)查中，采樣記錄是最重要的證據(jù)之一。因此，采樣記錄應(yīng)清晰明了，并在工作現(xiàn)場予以記錄。記錄的內(nèi)容包括采樣依據(jù)、采樣人的識別、環(huán)境條件（如果相關(guān)）、必要的操作步驟、采樣位置、統(tǒng)計方法、樣品包裝、數(shù)量及狀態(tài)描述等。

2.2實驗室診斷階段

2.2.1培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基的作用是利用細(xì)菌的繁殖特性篩選出可疑菌。因此，培養(yǎng)基的選擇是影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和檢出率高低的重要因素。對食源性疾病的檢測應(yīng)本著“多種思路、多種方法、同時選擇多種細(xì)菌”的原則，注意培養(yǎng)基選擇性的強(qiáng)弱搭配，即要避免致病菌的漏檢，還要避免因盲目接種增大檢驗工作量。作者認(rèn)為，在流行病學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)上接種亞西酸鹽胱氨酸增菌液、革蘭陰性桿菌增菌液、7.5%氯化鈉肉湯、1%葡萄糖肉湯、氯化鈉結(jié)晶紫增菌液、堿胨水即可滿足常規(guī)食源性疾病檢測的需要。對樣品的分離也宜采用弱選擇性平板，這是因為：（1）弱選擇性平板抑菌性弱，可盡量保留直接培養(yǎng)物的菌相分布特征，微生物恢復(fù)與生長較快，其指示系統(tǒng)還可幫助篩選可疑菌，縮短鑒定前的準(zhǔn)備工作。（2）強(qiáng)選擇性平板抑菌性強(qiáng)，往往掩蓋優(yōu)勢菌下的被抑制菌，造成分離不純，常致使生化結(jié)果混亂。本次食源性疾病采用血平板、含1.5%蛋白胨營養(yǎng)瓊脂（增加含蛋白胨量可促進(jìn)細(xì)菌快速生長）、He、Mac和TCBS平板。這些平板具有溶血、蔗糖、乳糖和硫化氫指示系統(tǒng)，對篩選可疑菌十分方便。在分離培養(yǎng)（菌落分布調(diào)查除外）時也未拘泥于國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的時間，一旦平板形成明顯菌落即可進(jìn)行下一步生化鑒定，如弧菌科細(xì)菌往往7～8 h即在平板上形成單個明顯菌落，而不必等待18～24 h。

2.2.2病原菌的鑒定生化反應(yīng)依然是最常用的病原菌鑒定手段。隨著計算機(jī)的應(yīng)用，生化反應(yīng)已廣泛采用生化鑒定系統(tǒng)。與常規(guī)生化的雙歧索引法比較，生化鑒定系統(tǒng)采用數(shù)碼法，通過計算并比較數(shù)據(jù)庫內(nèi)每個細(xì)菌條目對系統(tǒng)中每個生化反應(yīng)出現(xiàn)的頻率總和，可將某一細(xì)菌的全部生化反應(yīng)結(jié)果快速轉(zhuǎn)錄成數(shù)字（編碼）而得出細(xì)菌名稱，具有快速、準(zhǔn)確和節(jié)約時間、空間、人力、物力等優(yōu)點，是微生物快速鑒定的一個發(fā)展方向。本次食源性疾病采用VITEK-AMS自動生化鑒定系統(tǒng)，配套7種鑒定卡。工作模式：純菌+合適鑒定卡=結(jié)果。菌落分純后僅需通過革蘭染色、氧化酶、觸酶等實驗選擇鑒定卡種類，然后進(jìn)行菌液接種、孵育、判斷、結(jié)果打印均由儀器自動完成，實現(xiàn)生化鑒定的快速化。本次實驗室檢查應(yīng)用該系統(tǒng)在10 h內(nèi)完成可疑菌的生化鑒定，其中對第一株副溶血性弧菌的鑒定僅用了5 h。當(dāng)病原菌難以被分離（如發(fā)病早期服用抗生素，樣品中的病原菌受抑制或被殺死）時，有條件的實驗室還可采取其他手段?；诨蚍治龅木酆厦告湻磻?yīng)（pdymerase chain reaction，PCR）、基因探針雜交技術(shù)，基于免疫技術(shù)的免疫熒光、免疫酶、膠體金檢測等對病原菌鑒定的報道亦多見于文獻(xiàn)。特別是病原微生物PCR快速檢測技術(shù)，已應(yīng)用于我國的食源性疾病監(jiān)控體系。

2.2.3同源性分析病原菌的確定應(yīng)有可靠的證據(jù)。并非在某個樣本中分離到某種細(xì)菌就可以定性，在多個樣本中分離到同一細(xì)菌時還要符合“同源性”，證據(jù)才會完整。血清學(xué)試驗是測定抗體水平，診斷細(xì)菌性食源性疾病的經(jīng)典方法，但實驗周期長（1～3周）。在實際工作中，人員容易失訪，采血特別是恢復(fù)期采血容易受到拒絕。本次食源性疾病中1份患者糞便和蝦中分離的副溶血性弧菌在生化上存在一定差異，由于缺少血清學(xué)試驗，使得診斷依據(jù)不完整。隨著技術(shù)的進(jìn)步，以核酸分析為代表的分子生物學(xué)技術(shù)作為細(xì)菌同源性分析的手段已經(jīng)成熟，試驗周期1～3 d，結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠。其中DNA指紋圖譜分型技術(shù)已作為食品安全關(guān)鍵技術(shù)用于我國食源性疾病監(jiān)控體系。將分子生物學(xué)診斷手段與常規(guī)分離鑒定方法有機(jī)結(jié)合，是今后公共衛(wèi)生事件實驗室調(diào)查的一個有力手段［6］。

2.3食源性致病菌監(jiān)測系統(tǒng)要增強(qiáng)對食源性疾病暴發(fā)的反應(yīng)和預(yù)警能力還需建立和完善食源性疾病監(jiān)測和預(yù)警系統(tǒng)，以明確食物鏈中食源性致病菌的相關(guān)食品及其污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。2000年中國疾病預(yù)防控制中心建立了全國食品污染物監(jiān)測體系，構(gòu)建了國家級監(jiān)控網(wǎng)絡(luò)和數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用了微生物危險性評估技術(shù)、DNA指紋圖譜分型技術(shù)、病原微生物PCR快速檢測技術(shù)等，為食源性疾病監(jiān)控提供了一個技術(shù)平臺。今后還應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)和完善該網(wǎng)絡(luò)的建設(shè)，不斷提高食源性致病菌實驗室檢測能力，為食源性疾病的診斷提供技術(shù)支持。

［1］中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB 4789.28-2013食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)：食品微生物學(xué)檢驗：培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求［M］.中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

［2］劉秀梅，陳艷，王曉英，等.1992～2001年食源性疾病暴發(fā)資料分析——國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)［J］.衛(wèi)生研究，2004，3（6）：725-727.

［3］謝曉東，宋偉民.沙門菌屬性食物中毒及其預(yù)防［J］.上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2003，15（1）：7-8.

［4］陳君石.食源性疾病是我國頭號食品安全問題［J］.科學(xué)中國人，2012（10）：71.

［5］馬鶯華.平湖市1993-2003年細(xì)菌性食物中毒原因分析［J］.浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2004，16（7）：38.

［6］陳秀香，李羨亭，王愛新.細(xì)菌性食物中毒調(diào)查采樣對實驗室診斷的重要性［J］.中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生，2011，26（6）：99.

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.12.073

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1009-5519（2016）12-1951-02

（2016-01-18）