維生素C對肉雞缺氧肺動脈平滑肌細胞缺氧誘導因子-1α轉錄水平的影響

曹　林，曾秋鳳，張克英，丁雪梅，白世平，羅玉衡，王建萍，玄　玥，宿卓薇

(四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，教育部動物抗病營養(yǎng)重點實驗室，雅安 625014)

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維生素C對肉雞缺氧肺動脈平滑肌細胞缺氧誘導因子-1α轉錄水平的影響

曹林，曾秋鳳*，張克英，丁雪梅，白世平，羅玉衡，王建萍，玄玥，宿卓薇

(四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，教育部動物抗病營養(yǎng)重點實驗室，雅安 625014)

摘要：旨在體外培養(yǎng)肉雞肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)的基礎上利用氯化鈷(CoCl2)建立細胞缺氧模型，探討維生素C(VC)對缺氧肉雞PASMCs中缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)及其下游靶基因血管內皮生長因子(VEGF)及血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)mRNA轉錄的影響。選用21 d健康AA肉公雞，分離、培養(yǎng)并鑒定PASMCs，利用CoCl2建立細胞缺氧模型，再用7個濃度的VC(0、50、100、200、500、1 000和1 500 μmol·L-1)，5個培養(yǎng)時間(6、12、24、48和72 h)處理，試驗共設35個處理，每個處理6個重復。結果表明，利用組織塊法可成功培養(yǎng)出肉雞PASMCs；與對照組相比，不同濃度CoCl2均可使細胞缺氧基因(HIF-1α、VEGF、VEGFR2)轉錄量顯著增加(P<0.05)，促進細胞增殖，250 μmol·L-1CoCl2處理48 h可成功建立肉雞PASMCs缺氧模型；500或1 000 μmol·L-1VC處理48或72 h可顯著降低缺氧PASMCs中HIF-1α、VEGFR2 mRNA的轉錄(P<0.05)，而1 500 μmol·L-1VC則顯著增加缺氧PASMCs中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA的轉錄(P<0.05)。結果提示，缺氧會導致肉雞肺動脈平滑肌細胞缺氧基因表達量與細胞增殖增加，而VC能降低細胞對缺氧信號的敏感性，使缺氧基因的相對表達量降低。

關鍵詞：肉雞肺動脈平滑肌細胞；二氯化鈷；缺氧；缺氧誘導因子-1α；維生素C

肉雞腹水綜合征(ascites syndrome，AS)又稱肉雞肺動脈高壓綜合征(pulmonary hypertension syndrome，PHS)，是快大型肉雞三大主要營養(yǎng)代謝性病之一，己嚴重威脅到各國肉雞的健康養(yǎng)殖及其福利，年經濟損失超過10億美元。研究發(fā)現(xiàn)缺氧是引發(fā)肉雞AS的一個關鍵啟動因子，缺氧導致肉雞肺動脈血管重構[1]、肺動脈壓升高、右心室肥大、自由基損傷等病理變化[2-3]。缺氧誘導因子-1 (hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是機體感受缺氧信號傳導的一個關鍵轉錄因子，其是由HIF-1α與HIF-1β兩個亞基組成的異二聚體。HIF-1α是HIF-1所特有，受細胞氧濃度的密切調控，決定HIF-1的水平與活性。2006年，曾秋鳳[4]研究證實，HIF-1α基因表達與肉雞AS發(fā)生發(fā)展密切相關。2014年，楊夏(X.Yang)等[5]進一步利用低溫誘導肉雞AS的研究證實，HIF-1α及其下游目的基因血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及血管內皮生長因子受體2(VEGFR2/Flk-1)參與了腹水肉雞的肺動脈血管重構，而飼糧添加VC能夠下調AS肉雞肺HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA 轉錄，降低肺動脈血管重構。但其分子機制目前尚未見研究報道。

肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)增殖導致的肺動脈重構是肉雞AS發(fā)生的關鍵病理環(huán)節(jié)[6]。有研究發(fā)現(xiàn)肉雞肺血管重構與肺細小動脈平滑肌細胞的過度增殖和凋亡減少有關[7]。缺氧是誘發(fā)肉雞肺血管重構與肺細小動脈平滑肌細胞過度增殖的關鍵啟動因子。氯化鈷(CoCl2)作為一種誘導劑，可與HIF-1α中的氧依賴降解區(qū)結合誘發(fā)細胞缺氧，從而用于體外培養(yǎng)細胞缺氧模型的構建[8]。大量研究已利用CoCl2建立缺氧環(huán)境并應用于體外神經細胞[9]、癌細胞、血管內皮及平滑肌細胞的研究[10]及奶牛子宮內膜平滑肌細胞[11]研究。2014年，李彬彬[11]研究發(fā)現(xiàn)，CoCl2的作用時間和作用濃度與HIF-1α mRNA轉錄量呈現(xiàn)正相關。因此，本試驗旨在體外原代培養(yǎng)肉雞PASMCs，利用CoCl2建立細胞缺氧模型，初步探討維生素C對肉雞缺氧PASMCs中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA轉錄的影響，為進一步研究VC調控HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA轉錄的分子機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1主要試驗試劑與儀器

生物安全柜(Thermo1300Series)、倒置顯微鏡(Nikon TS100)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo3111)、照相系統(tǒng)(Nikon DS-Ri1)、ABI 7900型熒光定量PCR儀、DMEM-F12培養(yǎng)基(HyClone)、南美洲胎牛血清(Sigma)、胰蛋白酶(HyClone)、青鏈霉素(HyClone)、D-hanks液(武漢博士德)、TritonX-100(Sigma)、鼠抗α-actin抗體(武漢博士德)、羊抗鼠抗體(武漢博士德)、CoCl2·6H2O(Sigma)、MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(武漢博士德)。

1.2試驗動物

30只21日齡健康AA肉公雞。

1.3肉雞肺動脈平滑肌細胞分離培養(yǎng)與鑒定

1.3.1原代、傳代細胞培養(yǎng)和純化(組織貼塊法)試驗參照2002年董世山等[12]和2009年李錦春等[13]的方法并加以摸索改進。原代培養(yǎng)時，當組織塊貼上培養(yǎng)瓶瓶底4 h后翻轉培養(yǎng)瓶，加入3 mL完全培養(yǎng)液(20%胎牛血清+1%青鏈霉素+79%DMEM-F12)培養(yǎng)。每2～3 d換液一次。

當細胞生長鋪滿瓶底80%時進行細胞傳代培養(yǎng)和純化。加入1 mL·瓶-10.05%胰蛋白酶-0.02% EDTA室溫消化3 min，然后立即加入5 mL完全培養(yǎng)液，終止消化。再用移液槍輕輕吹打細胞培養(yǎng)區(qū)使細胞完全脫離瓶底。然后按照1∶2(每瓶3 mL細胞懸液)接種至新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。一般傳至3代可以得到純凈的PASMCs，最多可傳至6～7代。

1.3.2細胞鑒定

1.3.2.1細胞形態(tài)學鑒定：用倒置顯微鏡，在100倍和200倍下對細胞進行觀察。

1.3.2.2 細胞免疫熒光染色鑒定：試驗參照2009年李錦春等[13]方法進行。添加抗體孵育時，先滴加一抗(鼠抗α-actin抗體，1∶200稀釋)，室溫孵育1～2 h，D-hank’s液洗3次，每次5 min。再滴加二抗(生物素標記羊抗小鼠抗體，1∶100稀釋)，室溫靜置30 min，D-hank’s液洗3次，每次5 min。滴加SABC-Cy3(1∶100稀釋)，濕盒室溫靜置30 min，D-hank’s液洗3次，每次5 min。梯度酒精脫水。熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.4CoCl2缺氧模型的建立

1.4.1CoCl2處理試驗設計6×4因子設計，即6個CoCl2濃度(0、100、200、250、500和1 000 μmol·L-1)，將CoCl2溶于滅菌的超純水中，配成100 mmol·L-1的母液，0.22 μm濾膜過濾，再用培養(yǎng)基(DMEM-F12，1∶1)調節(jié)CoCl2母液為以上濃度；4個時間水平(6、12、24和48 h)，試驗共計24個處理，每個處理6個重復。

1.4.2CoCl2處理樣品收集相應時間點按照Trizol試劑說明書提取細胞總RNA，-80 ℃保存，用于缺氧基因相對表達量檢測。

1.4.3肉雞PASMCs細胞增殖檢測細胞增殖檢測方法參考2012年陶紹能等[14]和王靜等[15]進行。重復對細胞做CoCl2處理后，待測孔在每個時間點加入10 μL 5 mg·mL-1的MTT溶液，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。每孔加入100 μL formanzan溶解液，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，直到在光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)formazan全部溶解，約4 h。利用SpectraMax M2 在570 nm測定吸光度。

1.5VC對肉雞缺氧PASMCs中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA轉錄的影響

1.5.1VC處理試驗設計試驗采用7×5因子設計，7個VC濃度(0、50、100、200、500、1 000和1 500 μmol·L-1)，將VC溶于滅菌的超純水中，配成10 mmol·L-1的母液，0.22 μm過濾，再用培養(yǎng)基(DMEM-F12，1∶1)調節(jié)VC母液為以上濃度，5個培養(yǎng)時間(6、12、24、48和72 h)，試驗共計35個處理，每個處理6個重復。

1.5.2VC處理樣品收集同CoCl2處理試驗。

1.6RT-PCR檢測

利用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒和ABI Prism7900 sequence detection system進行RT-PCR檢測。反應采用10 μL體系，冰上操作，體系包括：5 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ+0.4 μL Forward Primer+ 0.4 μL Reverse Primer+0.2 μL ROX Reference+3 μL dH2O+1μL cDNA。反應條件：95 ℃預變性30 s，再40個循環(huán)(95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s)，最后進行熔解曲線檢測(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s)。引物序列見表1。

表1引物序列

Table 1The sequence of primers

1.7數(shù)據(jù)處理

缺氧基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法[16]計算：ΔCt(目的基因)=Ct(目的基因)-Ct(內參基因)；ΔΔCt=Ct(試驗組)-Ct(對照組)。目的基因的相對表達量=2-ΔΔCt。用GraphPad Prism 5作圖。用SAS 9.0做單因素分析，分析CoCl2和VC對缺氧基因轉錄的影響，以P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2結果

2.1肉雞肺動脈平滑肌細胞的鑒定

2.1.1 形態(tài)學鑒定在倒置相差顯微鏡下觀察，組織塊貼壁5～6 d后，逐漸有細胞從組織塊周圍爬出貼壁伸展，多數(shù)細胞伸展呈長梭形，細胞質豐富。細胞平行排列成單層，或部分區(qū)域多層重疊生長，高低起伏，表現(xiàn)為PASMCs典型的“峰-谷”狀生長特點(圖1)。

2.1.2免疫熒光染色鑒定肉雞PASMCs染色

后，α-SM-actin的免疫熒光顯示，細胞質中有較多與細胞縱軸相平行的絲狀物，呈現(xiàn)紅色熒光，即為平滑肌細胞特有的肌動蛋白(圖2)。肉雞PASMCs的染色陽性率占95%以上。

2.2CoCl2誘導肉雞PASMCs缺氧對HIF-1α mRNA轉錄及細胞增殖的影響

2.2.1HIF-1α mRNA轉錄量不同濃度CoCl2在不同時間處理下肉雞PASMCs的HIF-1α mRNA的轉錄見圖3。時間和CoCl2濃度對HIF-1α mRNA的轉錄的主效應顯著(P<0.05)。CoCl2各濃度處理6 h，其HIF-1α mRNA的轉錄均很低，0、100、200 μmol·L-1CoCl2處理12和24 h，其HIF-1α mRNA的轉錄也較低。用250、500和1 000 μmol·L-1CoCl2處理12、24、48 h后，其HIF-1α mRNA的轉錄均顯著增加(P<0.05)，其中以250 μmol·L-1CoCl2處理48 h最高。

2.2.2細胞增殖不同濃度CoCl2不同處理時間下，肉雞PASMCs的細胞增殖情況如圖4。時間對細胞增殖的主效應極顯著(P<0.01)。隨著CoCl2濃度增大，細胞增殖降低。隨著處理時間增加，細胞增殖增加，48 h最大(P<0.01)。

2.2.3CoCl2處理肉雞PASMCs中VEGF和Flk-1基因的轉錄CoCl2濃度為0、250和1 000 μmol·L-1下處理48 h，細胞VEGF和Flk-1的mRNA相對轉錄量如圖5和6。當CoCl2濃度250和1 000 μmol·L-1下處理48 h時，細胞VEGFmRNA相對轉錄量均有高于CoCl2濃度為0 μmol·L-1處理的趨勢；細胞Flk-1 mRNA轉錄量均高于CoCl2濃度為0 μmol·L-1的處理，但差異不顯著。CoCl2處理時缺氧基因(HIF-1α、VEGF、Flk-1)的相對轉錄量及細胞增殖變化表明，建立肉雞PASMCs缺氧模型的最佳 CoCl2處理條件為250 μmol·L-148 h。

2.3VC對肉雞缺氧PASMCsHIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA轉錄的影響

CoCl2誘導肉雞肺動脈平滑肌細胞缺氧后添加不同濃度VC，不同時間處理下肉雞PASMCsHIF-1α 、VEGF、VEGFR2 mRNA的相對轉錄量交互效應見圖7，主效應見圖8和圖9。

由圖7可看出，隨著VC濃度和處理時間增加，HIF-1α與VEGFR2 mRNA的相對轉錄量下降。與0 μmol·L-1+6 h處理組相比，VEGFR2的全部處理組以及HIF-1α除50、100 μmol·L-1+6 h和0、1 500 μmol·L-1+24 h處理組mRNA的相對轉錄量都極顯著降低 (P<0.01)。但與0 μmol·L-1+6 h處理組相比，VEGFmRNA的相對轉錄量，200、500、1 000 μmol·L-1+6、12 h組和1 500 μmol·L-1+72 h組極顯著升高(P<0.01)，而50 μmol·L-1+24 h組、 0、50、100 μmol·L-1+48 h組、1 000 μmol·L-1+72 h組顯著降低(P<0.05)，0、50、100 μmol·L-1+72 h組降低水平達到極顯著(P<0.01)，與其他處理組差異不顯著。

由圖8可以看出，隨著處理時間的增加HIF-1α mRNA的相對轉錄量降低，在12 h時最低，達到顯著水平(P<0.05)，其次是48和72 h，也顯著低于6和24 h(P<0.05)，其靶基因VEGF、VEGFR2 mRNA的相對轉錄量呈現(xiàn)出一致的變化趨勢，都隨著處理時間的增加而降低，在72 h時達到最低值，但較48 h不顯著，較其他處理時間顯著(P<0.05)。表明，VC最佳的處理時間為48或72 h。

由圖9可以看出，當VC濃度為500或1 000 μmol·L-1，HIF-1α mRNA的相對轉錄量較低，與其他濃度組相比達到顯著差異(P<0.05)，其靶基因VEGFR2 mRNA的相對轉錄量呈現(xiàn)出與HIF-1α較為一致的趨勢。但是VEGFmRNA的相對轉錄量在VC濃度為50 μmol·L-1時略有降低，之后隨著VC濃度的升高總體上升高，在200 μmol·L-1時達到顯著升高的水平 (P<0.05)。與其他VC濃度組相比，1 500 μmol·L-1VC顯著增加了HIF-1α、VEGFR2 mRNA轉錄量(P<0.05)。表明，VC最佳的處理濃度為500 或1 000 μmol·L-1。

3討論

3.1肉雞PASMCs原代細胞的培養(yǎng)

本試驗結果顯示，組織塊貼壁5～6 d后，逐漸有細胞從周圍爬出，呈長梭形，7～10 d后細胞鋪滿80%瓶壁。這與2002年董世山等[12]應用組織貼塊法、貼塊配合差速貼壁法培養(yǎng)不同日齡雞的肺動脈平滑肌細胞發(fā)現(xiàn)結果一致。

本試驗通過細胞免疫熒光法對平滑肌細胞特有的α-actin肌動蛋白染色，發(fā)現(xiàn)細胞質中有較多與細胞縱軸相平行的絲狀物呈現(xiàn)紅色熒光，即為平滑肌細胞特有的肌動蛋白。這與2009年李錦春等[13]利用組織貼塊法培養(yǎng)1～10 d肉雞PASMCs的結果一致。證明本試驗成功培養(yǎng)出21 d肉雞PASMCs。

3.2CoCl2誘導缺氧模型的建立及HIF-1α、VEGF、VEGFR2基因的轉錄

目前，細胞缺氧模型的建立通常有物理缺氧法和化學缺氧法。通過調節(jié)三氣培養(yǎng)箱中氧氣和氮氣的比例(一般為5%CO2+3%O2+92%N2或5%CO2+95%N2)來造成缺氧環(huán)境效果比較理想，但培養(yǎng)箱價格昂貴?；瘜W法主要是通過添加化學試劑(如氰化物或CoCl2)誘導細胞缺氧。氯化鈷通過影響HIF-1α亞基的表達來影響HIF-1的表達，從而建立缺氧環(huán)境并與HIF-1的表達形成濃度依賴性[17，18]。2003年，K.Zhang等[19]研究進一步指出，利用CoCl2模擬細胞缺氧時HIF-1α基因表達上調表明細胞缺氧環(huán)境的成功建立。本試驗發(fā)現(xiàn)通過CoCl2可以明顯提高肉雞PASMCs中HIF-1α基因的轉錄，當用250 μmol·L-1CoCl2處理48 h時，肉雞PASMC的HIF-1α mRNA轉錄量最大，細胞增殖狀態(tài)良好。因此將250 μmol·L-1CoCl2處理48 h作為建立肉雞PASMCs缺氧模型的可靠條件。

研究發(fā)現(xiàn)，肉雞發(fā)生AS時肺動脈血管發(fā)生細胞生長和遷移[1]。VEGFmRNA的相對表達量在平滑肌細胞缺氧后數(shù)小時內明顯提高，在恢復供氧后又降低到正常水平，說明缺氧導致細胞VEGF基因表達量提高，造成細胞增殖與遷移[20]。G.T.Stavri等[21]報道缺氧能顯著上調氧濃度和時間依賴的兔血管平滑肌細胞VEGFmRNA的穩(wěn)態(tài)水平，0%O2處理12～24 h后達到峰值，與對照組相比增加了30倍。1998年，H.Christou等[22]報道指出缺氧肺動脈平滑肌細胞VEGF及其受體VEGFR2的基因表達顯著增加。

同樣，在本研究中CoCl2濃度為250和1 000 μmol·L-1處理48 h后，細胞VEGFR2 mRNA轉錄量均高于CoCl2濃度為0 μmol·L-1的處理。該結果與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)低溫組肉雞肺缺氧相關基因轉錄規(guī)律基本一致[5]，表明缺氧導致肉雞PASMCs中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA的轉錄量增加。

3.3VC對缺氧PASMCs中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA轉錄的影響

VC作為一種強抗氧化劑和脯氨酸羥化酶的輔助因子，對人類或鼠類腫瘤細胞HIF-1α基因及其活性有著較強的調控作用。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，50～500 μmol·L-1VC使缺氧PASMCs中HIF-1α mRNA的相對轉錄量顯著降低，對VEGF、VEGFR2 mRNA轉錄量的影響也呈現(xiàn)出一致的趨勢。這與2003年H.J.Knowles等[23]的研究報道相一致。眾多體外試驗結果表明，HIF-1α的表達及活性受細胞內氧化還原狀態(tài)和脯氨酸羥化酶活性的影響[24]。用50 μmol·L-1H2O2可刺激人肺動脈血管平滑肌細胞HIF-1α蛋白和mRNA表達增加，而用抗氧化劑N-乙酰胱氨酸(5 mmol·L-1)處理，可使HIF-1α蛋白和mRNA表達量分別下降85.8%和94.4%[25]。正常給氧條件下培養(yǎng)PC3 細胞中加入1 mmol·L-1MMOG (dimethyloxalylglycine，一種脯氨酸羥化酶的抑制劑)可上調HIF-1α蛋白的表達。細胞內VC缺乏會使脯氨酸羥化酶活性喪失，HIF-1α蛋白降解受到抑制，從該酶的Km值推測出細胞內VC濃度在140～260 μmol·L-1之間時該酶的活性最佳[26-27]。

VC是否通過抗氧化和提高脯氨酸羥化酶活性來調控肉雞缺氧PASMCs中HIF-1α及其下游靶基因的表達，有待進一步研究。本試驗發(fā)現(xiàn)，隨著VC濃度的提高，VEGF的相對轉錄量總體上呈上升趨勢。這可能是由于VEGF表達受上游轉錄因子，如HIF-1α、癌基因Ras等，以及諸多其他因素，如細胞因子，轉化生長因子(TGF)，內皮生長因子(EGF)、肝素等共同調控[28]，但其具體原因也有待進一步探討。

此外，本試驗還發(fā)現(xiàn)，1 500 μmol·L-1的VC則使HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA的相對轉錄量顯著增加，尤其是HIF-1α和VEGFR2 mRNA的相對轉錄量極顯著地高于其他處理組。這可能是由于過高劑量VC的添加對細胞產生了毒性作用，增加了細胞對缺氧刺激的敏感性[29]，反饋性地促進了缺氧相關基因的表達。

4結論

利用組織塊貼壁法可成功培養(yǎng)21 d肉雞肺動脈平滑肌細胞。250 μmol·L-1CoCl2處理48 h可成功建立肉雞PASMCs缺氧模型；缺氧導致肉雞PASMCs 顯著增殖和HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA的相對轉錄量增加。濃度為500、1 000 μmol·L-1的VC處理48、72 h，可降低缺氧狀態(tài)下肉雞PASMCsHIF-1α、VEGF、VEGFR2基因的轉錄；而高劑量(1 500 μmol·L-1)VC可能會對細胞產生毒性作用，反饋性地上調上述基因的表達。

參考文獻(References)：

[1]NAIN S，WOJNAROWICZ C，LAARVELD B，et al.Vascular remodeling and its role in the pathogenesis of ascites in fast growing commercial broilers[J].ResVetSci，2009，86(3)：479-484.

[2]ENKVETCHAKUL B，BEASLEY J，BOTTJE W.Pulmonary arteriole hypertrophy in broilers with pulmonary hypertension syndrome (ascites)[J].PoultSci，1995，74(10)：1677-1682.

[3]WIDEMAN R F JR，KIRBY Y K，ISMAIL M，et al.Supplemental L-arginine attenuates pulmonary hypertension syndrome (ascites) in broilers[J].PoultSci，1995，74(2)：323-330.

[4]曾秋鳳.肉雞腹水綜合征的營養(yǎng)調控及其機理研究[D].雅安：四川農業(yè)大學，2006.

ZENG Q F.Study on nutritional regulation and mechanism of broiler ascites syndrome[D].Ya’an：Sichuan Agriclutural University，2006.(in Chinese)

[5]YANG X，LUO Y H，ZENG Q F，et al.Effects of low ambient temperatures and dietary vitamin C supplement on growth performance，blood parameters，and antioxidant capacity of 21-day-old broilers[J].PoultSci，2014，93(4)：898-905.

[6]SKLEPKIEWICZ P，SCHERMULY R T，TIAN X，et al.Glycogen synthase kinase 3beta contributes to proliferation of arterial smooth muscle cells in pulmonary hypertension[J].PLoSOne，2011，6(4)：e18883.

[7]TAN X，PAN J Q，LI J C，et al.L-Arginine inhibiting pulmonary vascular remodelling is associated with promotion of apoptosis in pulmonary arterioles smooth muscle cells in broilers[J].ResVetSci，2005，79(3)：203-209.

[8]WANG B，ZOU Y，YUAN Z L，et al.Genistein suppressed upregulation of vascular endothelial growth factor expression by cobalt chloride and hypoxia in rabbit retinal pigment epithelium cells[J].JOculPharmacolTher，2003，19(5)：457-464.

[9]WIKTOROWSKA-OWCZAREK A，NAMIECINSKA M，BALALCERCZYK A，et al.Human micro- and macrovessel-derived endothelial cells：a comparative study on the effects of adrenaline and a selective adenosine A2-type receptor agonist under normoxic and hypoxic conditions[J].PharmacolRep，2007，59(6)：800-806.

[10]YAMAJI R，F(xiàn)UJITA K，NAKANISHI I，et al.Hypoxic up-regulation of triosephosphate isomerase expression in mouse brain capillary endothelial cells[J].ArchBiochemBiophys，2004，423(2)：332-342.

[11]李彬彬.缺氧調控奶牛子宮內膜上皮細胞表達 BoLA-A 和 MIC1 的研究[D].武漢：華中農業(yè)大學，2014.

LI B B.Hypoxia regulates the expressions of BoLA-A and MIC1 in edometrial epithelial cells of dairy cow[D].Wuhan：Huazhong Agriclutural University，2014.(in Chinese)

[12]董世山，喬健，趙立紅，等.雞肺動脈平滑肌細胞培養(yǎng)及免疫組化鑒定[J].中國農業(yè)大學學報，2002，7(3)：99-102.

DONG S S，QIAO J，ZHAO L H，et al.Culture and immunohistochemistry detection of chicken’s pulmonary arterial smooth muscle cells[J].JournalofChinaAgricluturalUniversity，2002，7(3)：99-102.(in Chinese)

[13]李錦春，孫衛(wèi)東，譚勛，等.組織貼塊法培養(yǎng)肉雞肺動脈平滑肌細胞[J].中國獸醫(yī)學報，2009，29(3)：339-342.

LI J C，SUN W D，TAN X，et al.Pulmonary artery smooth muscle cells of broiler cultured with the tissue explants adhere method[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2009，29(3)：339-342.(in Chinese)

[14]陶紹能，周建國，程光華，等.二氯化鈷所致缺氧對 A549 細胞增殖抑制和凋亡的影響[J].皖南醫(yī)學院學報，2012，31(3)：194-197.

TAO S N，ZHOU J G，CHENG G H，et al.Experimental study on apoptosis and proliferation of human lung adenocarcinoma A549 cells under cobalt dichloride induced hypoxia[J].JournalofWannanMedicalCollege，2012，31(3)：194-197.(in Chinese)

[15]王靜，戴愛國.原代大鼠肺動脈平滑肌細胞的提取和鑒定以及缺氧對其增殖的影響[J].中國呼吸與危重監(jiān)護雜志，2012，11(2)：147-152.

WANG J，DAI A G.Extraction and identification of primary rat pulmonary artery smooth muscle cells and effects of hypoxia on the proliferation[J].ChineseJournalofRespiratoryandCriticalCareMedicine，2012，11(2)：147-152.(in Chinese)

[16]LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J].Methods，2001，25(4)：402-408.

[17]SHAO G，GAO C Y，LU G W.Alterations of hypoxia-inducible factor-1 alpha subunit in the hippocampus of mice acutely and repeatedly exposed to hypoxia[J].Neurosignals，2005，14(5)：255-261.

[18]ZHU H，BUNN H F.Oxygen sensing and signaling：impact on the regulation of physiologically important genes[J].RespirPhysiol，1999，115(2)：239-247.

[19]ZHANG K，YUAN Z，BING Y，et al.Effects of active immunization against cholecystokinin 8 on performance，contents of serum hormones，and expressions of CCK gene and CCK receptor gene in pigs[J].Endocrine，2007，32(3)：338-344.

[20]MAZUMDAR J，HICKEY M M，PANT D K，et al.HIF-2α deletion promotes Kras-driven lung tumor development[J].ProcNatlAcadSciUSA，2010，107(32)：14182-14187.

[21]STAVRI G T，HONG Y，ZACHARY I C，et al.Hypoxia and platelet-derived growth factor-BB synergistically upregulate the expression of vascular endothelial growth factor in vascular smooth muscle cells[J].FEBSLett，1995，358(3)：311-315.

[22]CHRISTOU H，YOSHIDA A，ARTHUR V，et al.Increased vascular endothelial growth factor production in the lungs of rats with hypoxia-induced pulmonary hypertension[J].AmJRespirCellMolBiol，1998，18(6)：768-776.

[23]KNOWLES H J，RAVAL R R，HARRIS A L，et al.Effect of ascorbate on the activity of hypoxia-inducible factor in cancer cells[J].CancerRes，2003，63(8)：1764-1768.

[24]SEMENZA G L.Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1[J].AnnuRevCellDevBiol，1999，15：551-578.

[26]JONES D T，TROWBRIDGE I S，HARRIS A L.Effects of transferrin receptor blockade on cancer cell proliferation and hypoxia-inducible factor function and their differential regulation by ascorbate[J].CancerRes，2006，66(5)：2749-2756.

[27]OZER A，BRUICK R K.Non-heme dioxygenases：cellular sensors and regulators jelly rolled into one?[J].NatChemBiol，2007，3(3)：144-153.

[28]羅穎.VEGF，F(xiàn)lk-1 在低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖中的作用[D].西安：第四軍醫(yī)大學，2006.

LUO Y.The effect and mechanism of VEGF and Flk-1 to the proliferation of hypoxia induced pulmonary artery smooth muscle cells[D].Xi’an：The Fourth Military Medical University，2006.(in Chinese)

[29]馬愛國，劉四朝.不同劑量維生素 C 對 DNA 氧化損傷影響的研究[J].營養(yǎng)學報，2001，23(1)：12-15.

MA A G，LIU S C.Effect of different levels of ascorbic acid on DNA damage[J].ActaNutrimentaSinica，2001，23(1)：12-15.(in Chinese)

(編輯白永平)

Effects of Vitamin C on the Transcription of Hypoxia Inducible Factor-1α of Broiler Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells under Hypoxia

CAO Lin，ZENG Qiu-feng*，ZHANG Ke-ying，DING Xue-mei，BAI Shi-ping，LUO Yu-heng，WANG Jian-ping，XUAN Yue，SU Zhuo-wei

(KeyLaboratoryofAnimalNutritionforDiseaseResistanceintheMinistryofEducation，InstituteofAnimalNutrition，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China)

Key words:broiler pulmonary artery smooth muscle cells；CoCl2；hypoxia；HIF-1α；VC

Abstract:This study was conducted to investigate the effects of Vitamin C (VC) on hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α)，vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor 2 (VEGFR2) mRNA transcription of broiler pulmonary artery smooth muscle cells(PASMCs)under hypoxia induced by CoCl2.PASMCs from healthy AA broilers at 21 days of age were isolated，cultured and identified.A cell model of hypoxia was established by using CoCl2.On this basis，PASMCs were treated by 7 different concentrations of VC (0，50，100，200，500，1 000 and 1 500 μmol·L-1) and 5 processing time (6，12，24，48 and 72 h)，total 35 treatments with six replicates.The results indicated that the PASMCs of broilers were successfully separated and culturedinvitro.As for hypoxia model of PASMCs，the relative transcription ofHIF-1α，VEGF，VEGFR2 and cell proliferation capacity significantly increased when PASMCs were after 48 h treatment by CoCl2with 250 μmol·L-1(P<0.05).The relative transcription ofHIF-1α，VEGFR2 in hypoxia PASMCs were significantly decreased by VC with 500 or 1 000 μmol·L-1after 48 or 72 h (P<0.05).Whereas 1 500 μmol·L-1VC significantly increased the relative transcription ofHIF-1α，VEGF，VEGFR2 in hypoxia PASMCs (P<0.05).These results suggested that anoxia could up-regulate the relative expression of hypoxia related genes and induce abnormally proliferation of PASMCs.While VC could reduce the sensitivity to oxygen signals of hypoxia PASMCs，and further down-regulate the relative expression of hypoxia related genes.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.024

收稿日期：2015-07-02

基金項目：國家自然科學青年基金(31101733)；四川農業(yè)大學211雙支計劃

作者簡介：曹林(1990-)，男，四川綿陽人，碩士生，主要從事家禽營養(yǎng)與飼料研究，E-mail：1315522048@qq.com *通信作者：曾秋鳳，研究員，博士，主要從事家禽營養(yǎng)與飼料研究，E-mail：zqf@sicau.edu.cn

中圖分類號：S852.2

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0388-09