人工重組促紅細(xì)胞生成素預(yù)防大鼠股骨頭壞死的形態(tài)學(xué)研究

蔣魯勇，余霄，顏勇卿，龐清江

人工重組促紅細(xì)胞生成素預(yù)防大鼠股骨頭壞死的形態(tài)學(xué)研究

蔣魯勇，余霄，顏勇卿，龐清江

目的通過骨的形態(tài)學(xué)變化來探討人工重組促紅細(xì)胞生成素（rHuEPO）對大鼠股骨頭缺血壞死（ONFH）的預(yù)防作用。方法將36只Wristar大鼠隨機(jī)分為3組。激素組：每周3次在大鼠后腿肌注地塞米松1mg/kg，連續(xù)用藥4周；對照組：每周3次在大鼠后腿肌注等量0.9％氯化鈉注射液，連續(xù)用藥4周；促紅素組：每周3次在大鼠后腿肌注地塞米松1mg/kg，連續(xù)用藥4周；并且每天腹腔內(nèi)注射rHuEPO500U·kg―1·d―1，連續(xù)用藥4周。制模后取股骨頭標(biāo)本，切片并HE染色，用光學(xué)顯微鏡觀察股骨頭形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果HE染色發(fā)現(xiàn)激素組較對照組骨小梁明顯稀疏、變窄，形態(tài)不規(guī)則，骨小梁分割程度下降，部分可見骨細(xì)胞胞核皺縮、溶解、消失。而促紅素組較激素組病變明顯減輕，骨小梁形態(tài)較為規(guī)則，小梁連接程度明顯優(yōu)于激素組，部分骨小梁較粗，斷裂明顯減少，骨小梁分割程度較高。結(jié)論rHuEPO可以有效地減緩激素性O(shè)NFH過程中骨形態(tài)學(xué)的變化，預(yù)防骨組織結(jié)構(gòu)破壞，從而起到延緩或預(yù)防ONFH的作用。

股骨頭壞死；人工重組促紅細(xì)胞生成素

股骨頭缺血壞死（ONFH）是由多種原因引起股骨頭血供破壞而導(dǎo)致軟骨下骨變性壞死，從而造成股骨頭塌陷，若不及時干預(yù)，70％的患者將發(fā)生股骨頭塌陷，最終需行髖關(guān)節(jié)置換［1］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對ONFH的病因和發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了深入研究，主要有血管內(nèi)凝血學(xué)說、脂類代謝紊亂學(xué)說、二次碰撞學(xué)說及骨內(nèi)壓增高學(xué)說等［2-3］，但確切病生理學(xué)機(jī)制現(xiàn)仍不完全明了。

促紅細(xì)胞生成素（EPO）是第一個被發(fā)現(xiàn)并具備臨床應(yīng)用價值的造血生長因子。當(dāng)初只認(rèn)識到其是由腎小管旁細(xì)胞分泌，功能是刺激紅細(xì)胞的生長，并由此而得名。目前發(fā)現(xiàn)除了主要產(chǎn)生于腎臟外，它還產(chǎn)生于肝臟、神經(jīng)組織、女性生殖系統(tǒng)、胎盤和睪丸等組織，并廣泛存在于人體的各個系統(tǒng)內(nèi)。利用基因重組技術(shù)能夠人工合成重組人促紅細(xì)胞生成素（rHuEPO），其分子量較天然EPO小，理化性質(zhì)和生物學(xué)活性與天然EPO無差異。大量研究表明，EPO不但能夠有效促進(jìn)紅細(xì)胞生成，同時還有保護(hù)細(xì)胞的作用，特別是能夠阻止內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞凋亡，并有促進(jìn)血管生成的作用［4］。本研究旨在通過動物實驗探討rHuEPO對激素沖擊大鼠缺血性股骨頭壞死的預(yù)防作用，報道如下。

1　資料與方法

1.1大鼠ONFH模型的建立取健康成年Wristar大鼠36只，雌雄各半，每只體質(zhì)量約為250 g。所有大鼠均在同一環(huán)境和條件下飼養(yǎng)，采用普通顆粒飼料進(jìn)行飼養(yǎng)，采取自然光照，溫度控制在（20±2）℃，濕度50％左右。飼養(yǎng)1周后逐個稱重，將36只Wristar大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：激素組、對照組和促紅素組，各12只，雌雄各半。所有在試驗中的動物及操作均符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

3組動物模型的具體建立方法如下：（1）激素組：每周3次在大鼠后腿肌注地塞米松1 mg/kg，連續(xù)用藥4周；（2）對照組：每周3次在大鼠后腿肌注等量0.9％氯化鈉注射液，連續(xù)用藥4周；（3）促紅素組：每周3次在大鼠后腿肌注地塞米松1 mg/kg，連續(xù)用藥4周；并且每天腹腔內(nèi)注射rHuEPO 500 U·kg―1·d―1，連續(xù)用藥4周。

1.2動物觀察每天觀察實驗動物的生命狀態(tài)、體質(zhì)量、排泄情況及有無體表感染等，每只動物準(zhǔn)確稱體質(zhì)量。為增加動物的活動量，實行每天定時自由活動2 h。

1.3HE染色4周后3組動物均麻醉后處死，切取雙側(cè)股骨頭標(biāo)本用于HE染色。取材時觀察股骨頭表面是否光滑完整，形態(tài)是否正常。將所取標(biāo)本用體積分?jǐn)?shù)10％中性甲醛溶液（0.1 mol/L，pH=7.4）4℃固定4 d，然后PBS溶液沖洗，放在緩沖液大約體積分?jǐn)?shù)10％ EDTA-Tris里面，37.4℃脫鈣，仔細(xì)注意骨表面的顏色，并且采用物理法準(zhǔn)確測量脫鈣程度。完全脫鈣后進(jìn)行取材，乙醇逐級脫水，二甲苯透明處理2 h，用石蠟進(jìn)行包埋，切片后行HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察骨組織、骨髓組織及骨小梁結(jié)構(gòu)變化。

2　結(jié)果

2.1動物的一般情況3組大鼠狀態(tài)良好。用藥4周后激素組和促紅素組大鼠大部分后肢和背部毛發(fā)脫落、稀疏；對照組大鼠毛發(fā)無明顯改變。整個實驗期間，無動物死亡，激素組有部分動物活動減少，食欲可；其余兩組未見明顯異常。

2.2HE染色結(jié)果的觀察對照組（封四彩圖1）：骨小梁呈圓形或橢圓形拱形結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)完整，骨小梁連接性高，無破骨細(xì)胞和骨小梁變窄、斷裂等情況出現(xiàn)。激素組（封四彩圖2）：雄性中5只大鼠可見骨小梁明顯稀疏、變窄，甚至斷裂，連接率降低，部分拱形結(jié)構(gòu)消失，形態(tài)不規(guī)則，骨小梁分割程度下降并伴有較多破骨細(xì)胞出現(xiàn)；雌性中有4只大鼠可見上述病變。其他大鼠均有不同程度的骨小梁變窄、連接率降低等情況發(fā)生。促紅素組（封四彩圖3）：較激素組，雄性和雌性病變明顯減輕，骨小梁形態(tài)較為規(guī)則，小梁連接程度明顯優(yōu)于激素組，部分骨小梁變粗，斷裂明顯減少，缺損處出現(xiàn)連接和修復(fù)，部分結(jié)構(gòu)接近對照組，骨小梁分割程度較高且可見較多成骨細(xì)胞。

3　討論

激素是引起ONFH最常見的病因之一，研究表明大劑量使用激素是導(dǎo)致ONFH的一個獨(dú)立性危險因素。Inue等［5］報道了287例腎移植患者口服強(qiáng)的松龍≥25.0 mg/d，其中18例明確發(fā)生ONFH，發(fā)生率為6.3％。在使用激素治療嚴(yán)重急性呼吸窘迫綜合征的患者中也發(fā)現(xiàn)，使用強(qiáng)的松龍等效累積劑量不足3 g的患者發(fā)生ONFH的風(fēng)險是0.6％；而超過3 g者風(fēng)險提高到13％［6］。激素的長期大劑量應(yīng)用可導(dǎo)致基因突變，從而使血液處于高凝低纖溶狀態(tài)。高凝低纖溶會介導(dǎo)股骨頭靜脈內(nèi)血栓的形成，致使靜脈壓增高、血流淤滯、引起動脈血流受損，進(jìn)一步造成骨細(xì)胞的缺血、缺氧及壞死，破壞骨組織結(jié)構(gòu)和功能，最終引起ONFH。雖然激素導(dǎo)致ONFH的機(jī)制目前尚無明確定論，但其增加ONFH風(fēng)險的這一事實已被廣大學(xué)者所認(rèn)可。

EPO是一種單鏈酸性糖蛋白，能夠促進(jìn)網(wǎng)織紅細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分化，刺激血管生成以及細(xì)胞再生，具有抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、減輕心腎組織損傷和改善局部微循環(huán)等作用。隨著對EPO及其受體研究的日益深入，EPO已經(jīng)越來越多的被臨床所應(yīng)用。如利用其促進(jìn)紅細(xì)胞生成的功能，治療多種貧血和腫瘤；利用EPO的抗炎、抗細(xì)胞凋亡等多種功能，治療骨骼肌與心肌的缺血再灌注損傷；利用其對急性心肌梗死和心力衰竭的保護(hù)作用而應(yīng)用于心血管疾病的臨床治療。最新的研究還發(fā)現(xiàn)，在骨骼肌損傷后，EPO具有促進(jìn)損傷骨骼肌恢復(fù)的功能。它通過促使骨骼肌細(xì)胞更快更好地恢復(fù)和促進(jìn)微循環(huán)的建立，從而在骨骼肌損傷后的修復(fù)過程中發(fā)揮了極其重要的作用［7］。此外，EPO及其受體EPO-R還廣泛表達(dá)于中樞與外周的神經(jīng)系統(tǒng)，并在神經(jīng)損傷后的修復(fù)中發(fā)揮著重要作用［8］。由于EPO具有促血管生成、抑制細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)損傷的骨骼肌和外周神經(jīng)修復(fù)的多種功能，有理由推斷，EPO在骨重建的過程中也必將發(fā)揮著十分重要的作用。本實驗就是根據(jù)股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制和EPO改善微循環(huán)、抗細(xì)胞凋亡等作用來探討rHuEPO對股骨頭壞死的預(yù)防作用。

本研究結(jié)果顯示，根據(jù)激素組的HE染色結(jié)果，12只大鼠中9只大鼠骨小梁明顯稀疏、變窄甚至斷裂，連接率降低，形態(tài)不規(guī)則，空骨陷窩增多，部分拱形結(jié)構(gòu)消失，骨小梁分割程度明顯下降并伴有破骨細(xì)胞出現(xiàn)，部分可見骨細(xì)胞胞核皺縮、溶解及消失；剩余3只亦有不同程度的骨小梁變窄和連接率降低。說明激素的使用嚴(yán)重影響到大鼠股骨頭骨小梁的數(shù)量及質(zhì)量，骨組織受到破壞，引起股骨頭壞死，提示本次實驗造模成功。促紅素組動物組織病理學(xué)顯示：較激素組病變明顯減輕，骨小梁形態(tài)較為規(guī)則，小梁連接程度明顯優(yōu)于激素組，缺損處出現(xiàn)連接和修復(fù)，可見較多成骨細(xì)胞。這說明rHuEPO可以通過改善微循環(huán)、抗細(xì)胞凋亡等作用減少骨細(xì)胞凋亡，阻止股骨頭塌陷，進(jìn)而起到預(yù)防股骨頭壞死發(fā)生的作用。

綜上所述，rHuEPO同時具備促血管生成的作用和抑制細(xì)胞凋亡的作用，能夠保持股骨頭形態(tài)，對于ONFH預(yù)防的短期效果明顯，但是長期效果還需進(jìn)一步進(jìn)行研究，而且其預(yù)防作用的機(jī)制還需進(jìn)一步深入探討。

［1］趙海燕，夏亞一，康鵬德，等.股骨頭壞死病因與發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國矯形外科雜志，2009，17（8）：604-607.

［2］Zhou Z，Zheng L，Liu J.Association of ABCB1 polymorphisms in patients with glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head：Evidence for a metaanalysis［J］.Gene，2015，569（1）：34-40.

［3］史躍，尹文洲，陳啟忠，等.自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞動脈灌注聯(lián)合局部注射治療股骨頭壞死［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（6）：1065-1069.

［4］PankratovaS，KiryushkoD，SonnK，etal. Neuroprotectivepropertiesof a novel，nonhaematopoietic agonist of the erythropoietinreceptor［J］.Brain，2010，133（8）：2281-94.

［5］Inue S，Horii M，Asano T，et al.Risk faetors for nontraumatic osteonecrosis of the femoral head after renal transplantation ［J］.J Orthop Sci，2003，8（6）：751-756.

［6］Grifith JF，Antonio GE，Kumta SM，et al. Osteonecrosis of hip and knee in patients withsevereacuterepiratorysyndrometreated withsteroids［J］.Radiology，2005，235（1）：168-175.

［7］楊元生，陳墾，石星亮，等.促紅細(xì)胞生成素的臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.中華全科醫(yī)學(xué)，2009，7（9）：992-994.

［8］HolsteinJH，Orth M，Scheuer C，et al.Erythropoietin stimulates bone formation，cell proliferation，and angiogenesis in a femoral segmental defect model in mice ［J］.Bone，2011，49（5）：1037-1045.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.08.059

R681.8

A

1671-0800（2016）08-1089-03

2016-05-12

（本文編輯：鐘美春）

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LY12H06002）；寧波市自然科學(xué)基金資助項目（2013A610255）

315030寧波，寧波市第二醫(yī)院

龐清江，Email：pqjey@sina.com