前列腺癌早期診斷相關(guān)標(biāo)志物的研究進展

頓耀軍，徐　濤

(北京大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科，北京　100044)

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·綜述·

前列腺癌早期診斷相關(guān)標(biāo)志物的研究進展

頓耀軍，徐濤

(北京大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科，北京100044)

摘要：前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的腫瘤之一，我國近年來發(fā)病率也逐漸增加。前列腺特異性抗原(PSA)的廣泛應(yīng)用，由于提高了前列腺癌的早期診斷率而降低了患者死亡率，但由于其特異性低，造成了大量的過度診斷與治療。而以PSA為基礎(chǔ)而衍生的一些指標(biāo)包括[-2]proPSA、前列腺健康指數(shù)(PHI)、4Kscore?提高了前列腺癌早期診斷的特異性。此外，尿中的標(biāo)志物如前列腺癌抗原3(PCA3)、TMPRSS2-ERG融合基因等對指導(dǎo)前列腺癌的早期診斷也發(fā)揮了重要作用。其中，PHI和尿PCA3檢測已被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于臨床。

關(guān)鍵詞：前列腺癌；標(biāo)志物；前列腺特異性抗原；前列腺健康指數(shù)；4Kscore?；前列腺癌抗原3(PCA3)

前列腺癌是當(dāng)前威脅全世界男性健康的主要惡性腫瘤之一，在歐美國家，其發(fā)病率已連續(xù)多年居男性惡性腫瘤發(fā)病率首位，死亡率居第二位[1]。我國前列腺癌發(fā)病率雖低于歐美國家，但隨著我國人口老齡化和飲食結(jié)構(gòu)的改變，近年來也呈逐年上升趨勢。目前前列腺癌的早期診斷主要依賴于前列腺特異性抗原(prostate specific antigen, PSA)和經(jīng)直腸超聲檢查。PSA的廣泛應(yīng)用無疑會提高前列腺癌的早期診斷，但PSA特異性較低，從而導(dǎo)致前列腺穿刺活檢結(jié)果陰性率較高，也使得重復(fù)穿刺數(shù)增加。尤其是PSA水平介于3～10 ng/mL的人群，其前列腺穿刺活檢的陰性率接近60%～75%[2]。且目前關(guān)于PSA篩查能否降低前列腺癌患者死亡率，還存在著較大的爭議。因此，為了減少不必要的前列腺穿刺活檢，并對前列腺癌進行更精準(zhǔn)的早期診斷，有必要探尋敏感度更高、特異性更好的前列腺癌相關(guān)標(biāo)志物。本文將對前列腺癌早期診斷相關(guān)標(biāo)志物的研究進展進行論述。

1血清標(biāo)志物

前列腺癌早期診斷的血清標(biāo)志物主要包括PSA和以PSA為基礎(chǔ)的一些衍生指標(biāo)。

1.1PSAPSA相對分子質(zhì)量為34 ku，為含237個氨基酸殘基的單鏈糖蛋白，由前列腺上皮細胞分泌產(chǎn)生，具有絲氨酸蛋白酶活性，在前列腺組織中以高濃度形式存在，主要起到液化精液的作用，具有很高的組織特異性[3]。PSA是第一個被美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration, FDA)批準(zhǔn)的用于早期診斷腫瘤的標(biāo)志物，目前已廣泛用于前列腺癌的篩查、早期診斷及腫瘤監(jiān)測。

此外，PSAD(PSA密度)、PSAV(PSA變化速率)、fPSA/tPSA(游離PSA與總PSA的比值)也在前列腺癌的早期診斷中發(fā)揮了一定的作用，提高了前列腺癌診斷的敏感性與特異性。正常前列腺組織每增加1 g，可增加PSA 0.13 ng/mL，而腫瘤組織每增加1 g，可增加PSA 315 ng/mL，而前列腺癌患者的PSA變化速率也顯著快于良性前列腺疾病患者，因此計算PSAD和PSAV有助于鑒別前列腺癌和良性前列腺增生性疾病。中國泌尿外科疾病診斷治療指南2014版指出，當(dāng)PSAD>0.15或PSAV>0.75 ng/(mL·年)時，應(yīng)懷疑前列腺癌的可能。此外，當(dāng)PSA處于“灰區(qū)”(4～10 ng/mL)時，fPSA/tPSA對于前列腺癌的早期診斷、指導(dǎo)前列腺穿刺活檢也具有重要意義，可大大提高前列腺癌診斷的特異性。研究表明如患者PSA處于“灰區(qū)”時，fPSA/tPSA<0.1，則該患者發(fā)生前列腺癌的可能性高達 56%；相反，fPSA/tPSA>0.25，發(fā)生前列腺癌的可能性只有8%；fPSA/tPSA>0.16時前列腺穿刺陽性率為1.6%；如果fPSA/tPSA<0.16 時前列腺穿刺陽性率為 17.4%[4]。因此國內(nèi)推薦fPSA/tPSA>0.16 為正常參考值(或臨界值)。

1.2[-2]proPSA(p2PSA)與前列腺健康指數(shù)(prostate health index，PHI) 最近發(fā)現(xiàn)，fPSA有多種亞型，包括PSA前體(proPSA)。PSA首先被翻譯為無活性的pre-pro PSA，攜帶有一段17個氨基酸的前導(dǎo)序列；在PSA分泌過程中，pre-pro PSA發(fā)生裂解，除去該前導(dǎo)序列后形成完整的由244個氨基酸組成的PSA酶原或稱為proPSA。proPSA由N端7個氨基酸的pro前導(dǎo)肽和237個氨基酸的成熟PSA組成，proPSA在人激肽釋放酶2(hK2)的作用下，在7位精氨酸和8位異亮氨酸之間發(fā)生裂解形成有活性的成熟PSA[5]。研究發(fā)現(xiàn)，由于pro前導(dǎo)肽的不同剪接可產(chǎn)生多種proPSA亞型，目前已在血清和前列腺組織中鑒定出的亞型包括：[-1]，[-2]，[-4]，[-5]和[-7]proPSA；而其中[-2]proPSA(p2PSA)是最穩(wěn)定的亞型[6]。

p2PSA在外周前列腺癌組織中顯著升高，且對于前列腺癌患者，血清p2PSA也會出現(xiàn)特異性升高[6]。SOKOLL等[7]曾選取123名患者(51%前列腺癌患者，49%非前列腺癌患者)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p2PSA和p2PSA/tPSA(p2PSA與總PSA的比值)與前列腺癌的相關(guān)性更好： p2PSA/tPSA的AUC(area under curve，曲線下面積，本文中均指受試者工作曲線的曲線下面積)為0.69，p2PSA的AUC為0.63，而fPSA/tPSA的AUC為0.61，PSA的AUC只有0.52；且當(dāng)PSA位于2～10 ng/mL時，p2PSA的AUC可高達0.73，而fPSA/tPSA的AUC只有0.53。

越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)p2PSA與其他指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用時，可以更好地預(yù)測前列腺癌。貝克曼庫爾特公司便發(fā)展了一個新的指標(biāo)：前列腺健康指數(shù)(PHI)，其計算公式如下：

PHI已被FDA批準(zhǔn)用于前列腺癌的早期診斷及危險程度的分級，目前關(guān)于PHI與前列腺癌關(guān)系的研究，已多達15個[8]。CATALONA等[9]曾開展了一項多中心的前瞻性篩查試驗，該研究一共入選了892名患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)tPSA介于2～10 ng/mL時，tPSA診斷前列腺癌的AUC為0.53，fPSA的AUC為0.65，而PHI的AUC為0.70；且PHI升高的患者患前列腺癌的風(fēng)險是PHI正?；颊叩?.7倍。

1.34Kscore?4Kscore?是由美國冷泉港實驗室研發(fā)出的一項新的以PSA為基礎(chǔ)的檢測指標(biāo)，它涉及到4種激肽釋放酶蛋白：fPSA、iPSA(intact PSA，是fPSA的亞型之一)、tPSA和人激肽釋放酶2(hK2)，該指標(biāo)還將患者的年齡、直腸指診結(jié)果等信息考慮在內(nèi)[10]。VEDDER等[11]發(fā)現(xiàn)PSA介于3～10 ng/mL時，4Kscore?診斷前列腺癌的敏感性高于尿PCA3評分，二者的AUC分別為0.78和0.62；另一項研究也提示4Kscore?與PHI在預(yù)測前列腺癌上有相似的AUC，分別為0.69和0.70[12]。此外，4Kscore?對于預(yù)測穿刺時Gleason評分≥7的前列腺癌，也有較高的特異性[10]。

1.4其他標(biāo)志物最近，尚有一些新的標(biāo)志物也被初步證實可有助于前列腺癌的早期診斷，包括：survivin[13]、前列腺癌致癌基因啟動子的甲基化(GSTP1，RASSF1A，RARβ2等)[14]、miRNA以及循環(huán)腫瘤細胞等。

2尿液標(biāo)志物

與血清標(biāo)志物相比，尿液標(biāo)志物有更多優(yōu)勢，尿液與前列腺直接接觸，減少了來自其他器官的蛋白質(zhì)污染，且尿檢屬于非侵入性操作，患者依從性更高。

2.1前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3, PCA3)PCA3基因最早于1999年由BUSSEMAKERS等[15]通過基因展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)，最初命名為DD3(differential display code 3)，該基因定位于人9號染色體q21-22，在前列腺上皮細胞內(nèi)表達一種非編碼mRNA，無法翻譯成蛋白質(zhì)，該mRNA序列全長約25 kb，包含4個外顯子和3個內(nèi)含子[16]，其生物學(xué)功能尚不明確。PCA3在超過95%的前列腺癌組織中呈高表達[17]，而正常前列腺及良性前列腺增生組織中PCA3表達水平較低，在非前列腺組織(良性和惡性)中則幾乎檢測不到PCA3表達，PCA3是目前最具特異性的前列腺癌標(biāo)志物[18]。而且PCA3水平也不受年齡、前列腺體積以及其他前列腺疾病如前列腺炎的影響[17]。

前列腺癌組織可產(chǎn)生PCA3并將其釋放入尿液，因此可通過檢測尿液PCA3水平來預(yù)測前列腺癌。目前應(yīng)用較多的是Progensa?PCA3檢測，比舊式的rtPCR技術(shù)更快速、經(jīng)濟。該檢測可定量提供尿中PCA3與PSA水平的比值，因尿液中PSA水平與血液PSA水平無關(guān)，且在前列腺癌患者中保持穩(wěn)定，通過PCA3/PSA可起到校準(zhǔn)的作用。而PCA3評分則是PCA3與PSA的比值再乘以1 000[17]。

前列腺穿刺活檢依舊是目前確診前列腺癌的金標(biāo)準(zhǔn)，尿液PCA3檢測可通過預(yù)測前列腺穿刺活檢的結(jié)果來達到早期診斷的目的。來源于REDUCE研究的數(shù)據(jù)證實，尿液PCA3是比血清PSA更好的標(biāo)志物，第2年的尿液PCA3水平是第4年前列腺穿刺活檢結(jié)果的重要預(yù)測因子(AUC 0.63，P=0.000 2)[19]。2006年GROSKOPF等[20]最早報道了一項研究，該研究納入了前列腺穿刺活檢人群和無前列腺癌危險因素的健康人群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前列腺穿刺活檢陽性者，其平均PCA3評分明顯高于前列腺穿刺活檢陰性者及健康人群(P<0.01)，尿液PCA3檢測對于預(yù)測前列腺癌的敏感度為69%、特異度為79%；而血清PSA對于預(yù)測前列腺癌的特異度僅為60%。DERAS等[21]的研究也發(fā)現(xiàn)，尿液PCA3評分<5時，前列腺穿刺活檢陽性率為14%；而當(dāng)PCA3評分>100時，活檢陽性率為69%，表明PCA3評分與前列腺穿刺活檢陽性率呈正相關(guān)；且當(dāng)PSA介于4～10 ng/mL時，以PCA3評分等于35作為臨界值，其診斷前列腺癌的敏感性為53%，特異性為71%。

2.2TMPRSS2-ERG融合基因許多前列腺癌患者的精液中可以檢測到雄激素調(diào)節(jié)基因與致癌基因融合的特異性改變[22]，尤其是TMPRSS2(The transmembrane protease serine 2)基因與致癌基因ETS家族的融合。TMPRSS2是一種雄激素調(diào)節(jié)基因，屬于絲氨酸蛋白酶家族；而ETS基因則是一種轉(zhuǎn)錄因子家族(主要是ERG和ETV1)，參與了細胞增殖、分化、血管生成、凋亡等多種過程。在所有基因融合中，以TMPRSS2-ERG融合基因最為常見，可在50%的前列腺癌切除標(biāo)本中被檢測到[22]。在尿液中亦可檢測到TMPRSS2-ERG融合基因，因此可將其作為前列腺癌早期診斷的特異性分子標(biāo)志物。

TOMLINS等[23]開展了一項多中心的研究，共收集了1 312份尿液樣本，檢測尿液中TMPRSS2-ERG融合基因和PCA3水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將上述兩種檢測與PCPT模型聯(lián)合應(yīng)用時，可將前列腺癌診斷的AUC從0.64提高到0.79(P<0.001)。HESSEL等[24]收集了108名前列腺癌患者肛門指診后的尿液，檢測尿液中ETS-TMPRSS2基因，聯(lián)合應(yīng)用PCA3評分，發(fā)現(xiàn)單獨應(yīng)用兩者時，診斷前列腺癌的敏感性分別為37%、62%，而聯(lián)合應(yīng)用時診斷敏感性可提高到73%。LEYTEN等[25]也進一步證實，當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用尿液TMPRSS2-ERG融合基因檢測時，可大大提高PCA3評分對前列腺癌診斷和預(yù)后的預(yù)測價值。此外，NGUYEN等[26]發(fā)現(xiàn)，在健康青年男性及接受前列腺癌根治術(shù)后患者的尿液中無TMPRSS2-ERG融合基因的存在，這也表明了TMPRSS2-ERG融合基因?qū)τ谇傲邢侔┰\斷的特異性。TOMLINS等[23]認(rèn)為聯(lián)合檢測ERG-TMPRSS2融合基因與PCA3水平將成為PSA之后決定前列腺穿刺活檢的又一重要參考標(biāo)準(zhǔn)，但應(yīng)用于臨床尚需進一步的研究。另外需要指出的是，MAGI-GALLUZZI等[27]發(fā)現(xiàn)ERG-TMPRSS2融合基因在不同人種前列腺癌組織中的陽性率不同(波動于15.9%～50.0%)，這可能降低TMPRSS2-ERG融合基因檢測在臨床應(yīng)用時的敏感性。

2.3α-甲酰基輔酶A消旋酶(Alpha-methylacyl CoA racemase, AMACR)AMACR位于染色體5p13.3，在2000年被首次報道，其主要作用是參與支鏈脂肪酸β氧化和脂肪酸從R-異構(gòu)體到S-異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化。LUO等[28]發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌組織中，AMACR mRNA的水平是正常組織的9倍之多，組織微陣列分析也提示前列腺癌和癌前病變(高級別上皮內(nèi)瘤變)的AMACR免疫組化評分明顯高于常前列腺組織。目前AMACR也多用于前列腺穿刺組織的免疫組化檢測，其在穿刺前列腺組織中診斷前列腺癌的敏感性為56%～76%，特異性為100%[29]。

由于AMACR主要存在于線粒體中，血液中通常不易檢測到AMACR；而前列腺所分泌的液體可進入尿道，因此AMACR可在尿液中被檢測到。ZIELIE等[30]利用實時熒光定量PCR檢測前列腺按摩后尿液中AMACR mRNA，發(fā)現(xiàn)其在區(qū)別有無臨床意義的前列腺癌中具有重要意義。OUYANG等[31]通過對比研究43例前列腺癌患者與49例正?；颊咔傲邢侔茨竽蛞簶?biāo)本，聯(lián)合檢測尿液中AMACR與PCA3水平，對前列腺癌診斷的靈敏度為81%、特異度為84%。

3小結(jié)

現(xiàn)階段，前列腺癌的早期診斷主要還是依賴PSA篩查，但許多其他前列腺良性疾病也可導(dǎo)致PSA升高；且PSA的應(yīng)用雖然一定程度上降低了前列腺癌相關(guān)死亡率，但由于其特異性低，也造成了大量的過度診斷、過度治療。因此，眾多學(xué)者對前列腺癌早期診斷的標(biāo)志物做了大量的研究工作，并取得了可喜的成果，包括PHI、4Kscore?和尿PCA3評分等指標(biāo)已被證實可提高前列腺癌早期診斷的敏感性與特異性，并逐步獲得臨床推廣。相信隨著研究的進一步深入，未來將會有新的更高特異性和敏感性的前列腺癌標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，將在前列腺癌的早期診斷、危險程度分級乃至監(jiān)測治療、預(yù)測復(fù)發(fā)中也發(fā)揮重要的作用。

參考文獻：

[1] SIEGEL R, NAISHADHAM D, JEMAL A. Cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin,2012,62(1):10-29.

[2] REED A B, PAREKH D J. Biomarkers for prostate cancer detection[J]. Expert Rev Anticancer Ther,2010,10(1):103-114.

[3] 王福利，符生苗，鄧立群，等. 前列腺癌血清診斷標(biāo)志物研究進展[J]. 海南醫(yī)學(xué),2010(22):12-15.

[4] 李鳴，那彥群. 不同水平前列腺特異抗原的前列腺癌診斷率[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志,2008,88(1):16-18.

[5] PEYROMAURE M, FULLA Y, DEBRE B, et al. Pro PSA : a “pro cancer” form of PSA?[J]. Med Hypotheses,2005,64(1):92-95.

[6] MIKOLAJCZYK S D, MILLAR L S, WANG T J, et al. A precursor form of prostate-specific antigen is more highly elevated in prostate cancer compared with benign transition zone prostate tissue[J]. Cancer Res,2000,60(3):756-759.

[7] SOKOLL L J, WANG Y, FENG Z, et al. [-2]proenzyme prostate specific antigen for prostate cancer detection: a national cancer institute early detection research network validation study[J]. J Urol,2008,180(2):539-543, 543.

[8] ABRATE A, LUGHEZZANI G, GADDA G M, et al. Clinical use of [-2]proPSA (p2PSA) and its derivatives (%p2PSA and Prostate Health Index) for the detection of prostate cancer: a review of the literature[J]. Korean J Urol,2014,55(7):436-445.

[9] CATALONA W J, PARTIN A W, SANDA M G, et al. A multicenter study of [-2]pro-prostate specific antigen combined with prostate specific antigen and free prostate specific antigen for prostate cancer detection in the 2.0 to 10.0 ng/mL prostate specific antigen range[J]. J Urol,2011,185(5):1650-1655.

[10] BLUTE M J, ABEL E J, DOWNS T M, et al. Addressing the need for repeat prostate biopsy: new technology and approaches[J]. Nat Rev Urol,2015,12(8):435-444.

[11] VEDDER M M, DE BEKKER-GROB E W, LILJA H G, et al. The added value of percentage of free to total prostate-specific antigen, PCA3, and a kallikrein panel to the ERSPC risk calculator for prostate cancer in prescreened men[J]. Eur Urol,2014,66(6):1109-1115.

[12] NORDSTROM T, VICKERS A, ASSEL M, et al. Comparison between the four-kallikrein panel and prostate health index for predicting prostate cancer[J]. Eur Urol,2015,68(1):139-146.

[13] KHAN S, JUTZY J M, VALENZUELA M M, et al. Plasma-derived exosomal survivin, a plausible biomarker for early detection of prostate cancer[J]. PLoS One,2012,7(10):e46737.

[14] AHMED H. Promoter methylation in prostate cancer and its application for the early detection of prostate cancer using serum and urine samples[J]. Biomark Cancer,2010,2010(2):17-33.

[15] BUSSEMAKERS M J, VAN BOKHOVEN A, VERHAEGH G W, et al. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer[J]. Cancer Res,1999,59(23):5975-5979.

[16] 朱國棟，楊志尚，吳大鵬，等. 前列腺癌標(biāo)志物PCA3的研究進展[J]. 現(xiàn)代泌尿外科雜志,2014(10):698-702.

[17] HESSELS D, SCHALKEN J A. The use of PCA3 in the diagnosis of prostate cancer[J]. Nat Rev Urol,2009,6(5):255-261.

[18] MARKS L S, BOSTWICK D G. Prostate cancer specificity of PCA3 gene testing: examples from clinical practice[J]. Rev Urol,2008,10(3):175-181.

[19] VICKERS A J, THOMPSON I M, KLEIN E, et al. A commentary on PSA velocity and doubling time for clinical decisions in prostate cancer[J]. Urology,2014,83(3):592-596.

[20] GROSKOPF J, AUBIN S M, DERAS I L, et al. APTIMA PCA3 molecular urine test: development of a method to aid in the diagnosis of prostate cancer[J]. Clin Chem,2006,52(6):1089-1095.

[21] DERAS I L, AUBIN S M, BLASE A, et al. PCA3: a molecular urine assay for predicting prostate biopsy outcome[J]. J Urol,2008,179(4):1587-1592.

[22] TOMLINS S A, RHODES D R, PERNER S, et al. Recurrent fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes in prostate cancer[J]. Science,2005,310(5748):644-648.

[23] TOMLINS S A, AUBIN S M, SIDDIQUI J, et al. Urine TMPRSS2:ERG fusion transcript stratifies prostate cancer risk in men with elevated serum PSA[J]. Sci Transl Med,2011,3(94):72r-94r.

[24] HESSELS D, SMIT F P, VERHAEGH G W, et al. Detection of TMPRSS2-ERG fusion transcripts and prostate cancer antigen 3 in urinary sediments may improve diagnosis of prostate cancer[J]. Clin Cancer Res,2007,13(17):5103-5108.

[25] LEYTEN G H, HESSELS D, JANNINK S A, et al. Prospective multicentre evaluation of PCA3 and TMPRSS2-ERG gene fusions as diagnostic and prognostic urinary biomarkers for prostate cancer[J]. Eur Urol,2014,65(3):534-542.

[26] NGUYEN P N, VIOLETTE P, CHAN S, et al. A panel of TMPRSS2:ERG fusion transcript markers for urine-based prostate cancer detection with high specificity and sensitivity[J]. Eur Urol,2011,59(3):407-414.

[27] MAGI-GALLUZZI C, TSUSUKI T, ELSON P, et al. TMPRSS2-ERG gene fusion prevalence and class are significantly different in prostate cancer of Caucasian, African-American and Japanese patients[J]. Prostate,2011,71(5):489-497.

[28] LUO J, ZHA S, GAGE W R, et al. Alpha-methylacyl-CoA racemase: a new molecular marker for prostate cancer[J]. Cancer Res,2002,62(8):2220-2226.

[29] WRIGHT J L, LANGE P H. Newer potential biomarkers in prostate cancer[J]. Rev Urol,2007,9(4):207-213.

[30] ZIELIE P J, MOBLEY J A, EBB R G, et al. A novel diagnostic test for prostate cancer emerges from the determination of alpha-methylacyl-coenzyme a racemase in prostatic secretions[J]. J Urol,2004,172(3):1130-1133.

[31] OUYANG B, BRACKEN B, BURKE B, et al. A duplex quantitative polymerase chain reaction assay based on quantification of alpha-methylacyl-CoA racemase transcripts and prostate cancer antigen 3 in urine sediments improved diagnostic accuracy for prostate cancer[J]. J Urol,2009,181(6):2508-2513, 2513-2514.

(編輯王瑋)

收稿日期：2015-10-04修回日期：2015-12-01

通訊作者：徐濤，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師.E-mail：xutao@medmail.com.cn

作者簡介:頓耀軍(1992-)，男(漢族)，博士研究生，醫(yī)師.E-mail：yaojundun@163.com

中圖分類號:R737

文獻標(biāo)志碼:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.05.019