山芝麻中化學(xué)成分與抗腫瘤活性研究

金孝勤，龐素秋

(中國(guó)人民解放軍第180醫(yī)院，福建 泉州　362000)

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山芝麻中化學(xué)成分與抗腫瘤活性研究

金孝勤，龐素秋

(中國(guó)人民解放軍第180醫(yī)院，福建 泉州362000)

摘要：目的研究山芝麻中的化學(xué)成分及其抗腫瘤活性。 方法采用硅膠柱層析、制備薄層層析等色譜方法，對(duì)山芝麻乙醇提取物分離純化，用波譜和薄層方法進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)鑒定。鑒定出的化合物，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法觀(guān)察化合物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29)和卵巢癌細(xì)胞(OVCA429)的抑制增殖作用。結(jié)果分離出的9種化合物分別是葫蘆素B(cucurbitacin B)(Ⅰ)，葫蘆素E(cucurbitacin E)(Ⅱ)，迷迭香酸(rosmarinic acid)(Ⅲ)，十二硫醇(Dodecanethiol)(Ⅳ)，β-谷甾醇(β-sitosterol)(Ⅴ)，烏蘇酸(Ursolic acid)(Ⅵ)，細(xì)辛脂素(Asarinin)(Ⅶ)，麥角甾醇(Ergosterol)(Ⅷ)，2，6-二甲氧基對(duì)醌(2,6-dimethoxy-p-quinone)(Ⅸ)。以荷瘤小鼠 S180為模型，觀(guān)察其體內(nèi)抗腫瘤作用。山芝麻的乙醇提取物在高劑量組抑瘤率為54.73%，表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性。經(jīng)過(guò)MTT分析，化合物Ⅶ的IC50值顯示對(duì)HT-29細(xì)胞顯著抗增殖作用，對(duì)OVCA429細(xì)胞表現(xiàn)出微弱的抑制活性?；衔铫鯇?duì)HT-29細(xì)胞和OVCA429細(xì)胞都只有輕中度抑制作用。此外，化合Ⅲ和Ⅳ只對(duì)OVCA429細(xì)胞表現(xiàn)為輕度抑制活性，其它化合物沒(méi)有顯示針對(duì)這兩種人癌細(xì)胞系的抗增殖作用(IC50>100 μmol·L-1)。結(jié)論山芝麻具有多種化學(xué)成分，部分具有較好的抗腫瘤活性，值得更加深入的研究。

關(guān)鍵詞：山芝麻；化學(xué)成分；抗腫瘤活性

山芝麻(HelicteresangustifoliaLinn.)為梧桐科植物，別名崗油麻(《生草藥性備要》)、崗脂麻(《嶺南采藥錄》)、山油麻(《廣州植物志》)、田油麻、仙桃草(《福建民間草藥》)，野芝麻、狗屎樹(shù)(《廣西中獸醫(yī)藥植》)、假芝麻(《廣西藥植圖志》)、山麻(《閩南民間草藥》)、假油麻、山芝麻頭(《嶺南草藥志》)、白頭公、油麻甲(江西《草藥手冊(cè)》)、野麻甲、假麻甲(《廣東中草藥》)[1]。山芝麻廣泛種植于中國(guó)南部，其干燥根入藥，被傳統(tǒng)中藥學(xué)視為滋補(bǔ)上品。山芝麻中富含亞油酸、維生素A、維生素B1、維生素E和鈣、鎂等礦物質(zhì)[2]。山芝麻有滋補(bǔ)養(yǎng)血、調(diào)經(jīng)補(bǔ)腎、護(hù)肝、潤(rùn)腸、軟化皮膚，利尿、緩瀉等功用，用于輔助治療慢性便秘、耳鳴、齒齦炎、貧血，脫發(fā)、口角潰瘍和偏頭痛、視力減退、頭昏眼花等疾病，對(duì)于改善老年人常見(jiàn)的疾患大有幫助[3]。

山芝麻中已發(fā)現(xiàn)的抗癌活性成分主要是木脂素類(lèi)。Miyahara等用山芝麻中提取分離到的木脂素類(lèi)化合物作用于人類(lèi)淋巴樣白血病Molt 4B細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可使Molt 4B細(xì)胞產(chǎn)生寡核小體片段碎片，并呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性。實(shí)驗(yàn)表明山芝麻中的木脂素類(lèi)可抑制Molt 4B細(xì)胞的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞的程序性死亡。但上述只是體外實(shí)驗(yàn)，山芝麻木脂素在生物體內(nèi)的抗癌效果如何，尚待進(jìn)一步深入研究[4-5]。

本研究從山芝麻中分離、純化出9種化合物，分別是葫蘆素B(cucurbitacin B)(Ⅰ)、葫蘆素E(cucurbitacin E)(Ⅱ)、迷迭香酸(rosmarinic acid)(Ⅲ)、十二硫醇(Dodecanethiol)(Ⅳ)、β-谷甾醇(β-sitosterol)(Ⅴ)、烏蘇酸(Ursolic acid)(Ⅵ)、細(xì)辛脂素(Asarinin)(Ⅶ)、麥角甾醇(Ergosterol)(Ⅷ)、2，6-二甲氧基對(duì)醌(2,6-dimethoxy-p-quinone)(Ⅸ)，并采用MTT法檢測(cè)所分離化合物對(duì)HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞和OVCA429卵巢癌細(xì)胞的抗增殖活性。

1提取分離

1.1儀器與試劑Jasco P-1020旋光計(jì)；JascoV-550型可見(jiàn)/紫外分光光度計(jì)；Perkin-Elmer-983型紅外分光光度計(jì)(KBr壓片法)；VGZAB2F型質(zhì)譜儀；AM-400型核磁共振儀；硅膠(200～300目)(青島海洋化工廠(chǎng))，葡聚糖凝膠LH-20(法瑪西亞生物技術(shù)AB公司)。所有溶劑都是分析純(天津市大茂化工廠(chǎng)，天津，中國(guó))。山芝麻，購(gòu)于泉州市醫(yī)藥公司，經(jīng)鑒定為梧桐科山芝麻的干燥根。

1.2實(shí)驗(yàn)操作取干燥山芝麻5 kg,粉碎，室溫下以95%乙醇浸提24 h，回收乙醇得流浸膏，浸膏濃縮后以水溶解，分別用環(huán)己烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯部分(30 g)用硅膠柱，二氯甲烷-甲醇體系梯度洗脫(100∶1→2∶1)得到A,B,C,D四個(gè)部分。A部分用硅膠柱，二氯甲烷-甲醇(20∶1～5∶1)梯度洗脫得化合物Ⅰ(10 mg)、Ⅱ(7 mg)和Ⅲ(19 mg)。B部分用硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯(10∶1～8∶1)梯度洗脫得化合物Ⅳ(20 mg)、Ⅴ(6 mg)、Ⅷ(17 mg)和Ⅸ(8 mg)。C部分用硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯(5∶1～3∶7)梯度洗脫得Ⅵ(11 mg)和Ⅶ(15 mg)。

1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果化合物Ⅰ為白色粉末，易溶于氯仿。結(jié)合氫譜與碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6-7]報(bào)道確定該化合物為葫蘆素B(cucurbitacin B)，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1　葫蘆素B結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅱ?yàn)榘咨勰?，易溶于氯仿。參照氫譜及碳譜的數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6-8]報(bào)道確定該化合物為葫蘆素E(cucurbitacin E)，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2。

圖2　葫蘆素E結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅲ為白色無(wú)定形粉末，三氯化鐵-鐵氰化鉀為陽(yáng)性，香莢蘭醛顯粉紅色。光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致，故鑒定為迷迭香酸(rosmarinic acid),結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖3。

圖3　迷迭香酸結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅳ：淡黃色膠狀結(jié)晶。溶于乙酸乙酯、氯仿，微溶于甲醇，難溶水。薄層展開(kāi)在紫外光下無(wú)熒光，5%濃硫酸顯紫紅色單斑。結(jié)合氫譜數(shù)據(jù)和碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]記載，確定該化合物為十二硫醇(Dodecanethiol)，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖4。

圖4十二硫醇結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅴ為無(wú)色針狀結(jié)晶。易溶于氯仿難溶于水。Liebermann-Burchard反應(yīng)陽(yáng)性，10%濃硫酸顯紫紅色。與β-谷甾醇對(duì)照品TLC展開(kāi)，在三種不同的展開(kāi)系統(tǒng)中比較Rf值完全一致(石油醚∶乙酸乙酯=5∶1，Rf=0.4；石油醚∶丙酮=8∶1，Rf=0.51；氯仿∶乙酸乙酯=10∶1， Rf=0.45)。故確認(rèn)該化合物為β-谷甾醇(β-sitosterol),結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖5。

圖5　β-谷甾醇結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅵ為黃綠色粉末狀?？扇苡诼确拢⑷苡谝宜嵋阴?、丙酮、甲醇，不溶于石油醚、水。薄層在紫外光下無(wú)熒光，5%濃硫酸顯紫紅色單斑。Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽(yáng)性。其氫譜數(shù)據(jù)和碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]記載一致，確定該化合物為烏蘇酸(Ursolic acid)，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖6。

圖6　烏蘇酸結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅶ為無(wú)色塊狀結(jié)晶?？扇苡诼确?、丙酮、甲醇,不溶于水。薄層在紫外光下無(wú)熒光，5%濃硫酸顯紫紅色單斑。結(jié)合光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道，化合物Ⅶ鑒定為細(xì)辛脂素(Asarinin)，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖7。

圖7　細(xì)辛脂素結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅷ為無(wú)色針狀晶體，Liebermann-Burchard反應(yīng)呈墨綠色。經(jīng)比較光譜數(shù)據(jù)[13]與麥角甾-5-烯-3β醇的光譜值一致。將該化合物與標(biāo)準(zhǔn)的麥角甾醇進(jìn)行薄層層析對(duì)照，兩者的Rf值一致，故鑒定該化合物為麥角甾醇(Ergosterol)。結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖8。

圖8　麥角甾醇結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅸ為紅色晶體。與文獻(xiàn)[11]比較，該化合物與2，6-二甲氧基對(duì)醌的物理性質(zhì)及碳譜和氫譜數(shù)據(jù)一致，由此鑒定該化合物為2，6-二甲氧基對(duì)醌。結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖9。

圖9　2，6-二甲氧基對(duì)醌結(jié)構(gòu)式

2藥理實(shí)驗(yàn)

2.1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.1.1荷瘤小鼠造模取腹腔接種S180生長(zhǎng)良好的KM鼠，抽取其腹水，用無(wú)菌生理鹽水按1∶3比例稀釋成瘤細(xì)胞懸液，計(jì)活細(xì)胞率在95%以上。再用生理鹽水調(diào)整瘤細(xì)胞密度為每毫升1×107個(gè)。共取60只平均體質(zhì)量在(20.37±0.68)g的KM鼠進(jìn)行種瘤，每只小鼠右前肢腋下皮下接種0.2 mL，整步操作盡量在1 h內(nèi)完成。

2.1.2給藥方法接種次日， 隨機(jī)分成5組，每組12只，體重?zé)o明顯差異。模型對(duì)照組灌胃每天定時(shí)給予等體積的蒸餾水；陽(yáng)性對(duì)照組每天定時(shí)腹腔注射用環(huán)磷酰胺0.02 g·kg-1；山芝麻乙醇提取物按低、中、高劑量(0.1、0.25、0.5 g·kg-1)組分別灌胃，每日1次，連續(xù)8 d。最后一次給藥的24 h后稱(chēng)重，頸椎脫臼處死小鼠。剪開(kāi)腫瘤部位，完整剝離瘤塊、胸腺和脾臟，用濾紙吸凈血和液體，稱(chēng)取質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。計(jì)算公式如下：

(公式1)

(公式2)

(公式3)

2.1.3結(jié)果計(jì)算得出結(jié)果如表1，低劑量組與中劑量組與環(huán)磷酰胺組之間的抑瘤率有顯著差異，而高劑量組則無(wú)明顯差異。由體質(zhì)量、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)變化分析發(fā)現(xiàn)，隨著劑量增加，體質(zhì)量、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)均增加，而腫瘤質(zhì)量在三個(gè)劑量組均呈現(xiàn)降低。

表1　 體內(nèi)抗腫瘤相關(guān)指標(biāo)的對(duì)比分析

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05,**P≤0.01。

2.2體外實(shí)驗(yàn)化合物的抗增殖效應(yīng)通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)采用人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和卵巢癌細(xì)胞OVCA429(購(gòu)于美國(guó)ATCC)。HT-29和OVCA 429細(xì)胞在含有10%胎牛血清(Hyclone)和抗生素(100 IU·mL-1的青霉素和100 g·L-1硫酸鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone)中，于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞調(diào)成適宜濃度的細(xì)胞懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2.1細(xì)胞活力的測(cè)定4×104·mL-1HT-29細(xì)胞懸液和OVCA429細(xì)胞懸液分別接種在96孔板中，每孔加細(xì)胞懸液100 μL，5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞完全貼壁后取出，棄去上清，加入藥物。對(duì)照組：加入與加藥組同量的DMSO和無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基、加藥組：藥物用DMSO溶解后，分別以無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋?zhuān)K濃度為6.25,12.5,25和50 μmol·L-1。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，96孔板在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入新配制的10 μL MTT(10 g·L-1)。37℃孵育4 h后吸掉培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，震蕩5 min，酶標(biāo)儀測(cè)490 nm處測(cè)吸光度值。

表2　　體外實(shí)驗(yàn)各提取化合物的IC50值對(duì)比

2.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果在MTT分析中，多柔比星作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)HT-29細(xì)胞的IC50為(0.62±0.13)μmol·L-1，對(duì)OVA429細(xì)胞的IC50值(1.03±0.21)μmol·L-1?；衔铫鞯腎C50值顯示對(duì)HT-29細(xì)胞有顯著抗增殖作用，為(0.78±0.65)μmol·L-1，但對(duì)OVCA429細(xì)胞表現(xiàn)出微弱的抑制活性，IC50值僅為(89.36±5.60)μmol·L-1?；衔铫踔挥休p中度抑制，對(duì)HT-29細(xì)胞和OVCA429細(xì)胞的IC50值分別為(19.65±3.88)和(79.07±1.78)μmol·L-1。此外，化合物Ⅳ和Ⅲ對(duì)OVCA429細(xì)胞表現(xiàn)為輕度抑制活性，IC50值分別為(26.87±2.94)μmol·L-1和(43.97±2.63)μmol·L-1。其它化合物沒(méi)有顯示針對(duì)這兩種人癌細(xì)胞系的抗增殖作用(IC50>100 μmol·L-1)。見(jiàn)表2。

3討論

山芝麻為民間傳統(tǒng)草藥，其用途廣，資源豐富?，F(xiàn)代研究表明，山芝麻具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)肝臟，抗丙型肝炎病毒，聲帶息肉，非特異性結(jié)腸炎，抗炎和鎮(zhèn)痛等作用，是一味較好的治療保健中藥，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。

雖然山芝麻醫(yī)藥市場(chǎng)的需求量很大，但其化學(xué)成分研究尚處于初步階段，未建立有關(guān)活性成分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，化學(xué)成分的活性及毒性副作用還不清楚。鑒于此，我們應(yīng)該擴(kuò)大其化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用的研究，提升藥品質(zhì)量、安全性評(píng)價(jià)，充分發(fā)揮其藥用價(jià)值，從而開(kāi)發(fā)民族醫(yī)藥資源，促進(jìn)民族醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展。

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Studies on chemical constituents and their anti-tumor activities

in roots ofHelicteresangustifolia

JIN Xiao-qin，PANG Su-qiu

(The180thHospitalofPLA,Quanzhou,Fujian362000,China)

Abstract：ObjectiveTo study the chemical constituents and the anti-tumor activity in roots ofHelicteresangustifolia(HA). MethodsSilica gel column chromatography, preparative thin layer chromatography and other chromatographic methods were used to isolate the compounds from HA spectral and thin layer methods were used to identify the compound structures.Effects of these compounds on the proliferations of HT-29 cells and OVCA-429 cells were tested by MTT method.180 mice tumor model was established to observe anti-tumor activity in vivo of HA extracts.ResultsCucurbitacin B (I), cucurbitacin E (II), rosmarinic acid (III), dodecanethio(IV), β-sitosterol(V), ursolic acid (VI), asarinin (VII), ergosterol (VIII) and 2,6-dimethoxy-p-quinone (IX) were isolated from HA.Compound VII showed a significant inhibitory activity on HT-29 cells and a weak inhibitory activity on OVCA429 cells. Compound V showed little inhibitory activity on HT-29 cells and OVCA429. In addition, the compounds IV and III only showed mild inhibitory activity on OVCA429 cells. ConclusionSome of the compounds in HA have significant anti-tumor activity, which is worthy of further study.

Key words：Helicteresangustifolia;chemical constituents;anti-tumor activity

收稿日期：(2015-07-24，修回日期：2015-10-09)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.009