基質(zhì)金屬蛋白酶-9及金屬蛋白酶組織抑制劑-1在孕鼠胎盤形成中期的表達(dá)模式

魏孟梅， 吳曙光， 趙海*

(1. 貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽550002； 2. 貴陽中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，貴陽550002)

基質(zhì)金屬蛋白酶-9及金屬蛋白酶組織抑制劑-1在孕鼠胎盤形成中期的表達(dá)模式

魏孟梅1， 吳曙光2， 趙海2*

(1. 貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽550002； 2. 貴陽中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，貴陽550002)

目的 探討基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)及金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)在孕鼠胎盤形成中期的表達(dá)模式。方法 HE染色觀察孕鼠第9天至第14天(D9～D14)胎盤形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，同時(shí)免疫組織化學(xué)法檢測相應(yīng)天數(shù)胎盤中MMP-9和TIMP-1的表達(dá)情況。結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示孕鼠D11時(shí)胎盤的3層結(jié)構(gòu)開始形成，包括蛻膜區(qū)(Dec)、海綿滋養(yǎng)細(xì)胞層(Sp)和迷路區(qū)(Lab)；隨著妊娠天數(shù)的增加，Dec區(qū)域逐漸縮小，Sp和Lab區(qū)域增大；免疫組化表明，MMP-9和TIMP-1均表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞核中，MMP-9強(qiáng)表達(dá)于D9和D10胎盤的外胎盤錐中，D10～D13的Dec、Sp和D11～D13的滋養(yǎng)巨細(xì)胞中。MMP-9在D11的Lab，D12的Dec和Lab，D13的Dec、Sp、Lab區(qū)域中的陽性細(xì)胞的積分光密度值與D14胎盤中對應(yīng)值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TIMP-1在D9～D12的Dec區(qū)域中的陽性細(xì)胞的積分光密度值與D14胎盤中對應(yīng)值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MMP-9/TIMP-1在D9、D11的Dec及D12的Lab區(qū)域中的比值與D14胎盤中對應(yīng)值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在D10、D12的Dec和D13的Lab區(qū)域中的比值與D14胎盤中對應(yīng)值比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 MMP-9和TIMP-1在孕鼠胎盤中的協(xié)同表達(dá)可能參與調(diào)節(jié)胎盤的形成。

金屬蛋白酶； 金屬蛋白酶組織抑制劑； 胎盤； 外胎盤錐

哺乳動(dòng)物囊胚植入需經(jīng)過定位、黏附、穿透3個(gè)精密過程(馬芳，2004)。小鼠囊胚中靠近內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass)的滋養(yǎng)層細(xì)胞向子宮內(nèi)膜侵襲分化為具有侵襲能力的外胎盤錐(ecto-placental cone，Epc)，隨后入侵子宮內(nèi)膜，逐步發(fā)育形成由蛻膜區(qū)(decidua basalis，Dec)、海綿滋養(yǎng)細(xì)胞層(spongiotrophoblast，Sp)和迷路區(qū)(labyrinth，Lab)構(gòu)成的胎盤(Hu & Cross，2010；Laguetal.，2010)。近年的研究表明，表皮生長因子(epidermal augmentum factor)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及其抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)、硫酸軟骨素蛋白聚糖4(CSPG4)和微小RNA(miRNA)等重要激素與整合素、細(xì)胞因子、生長因子、酶類等參與子宮內(nèi)膜重建、囊胚種植及滋養(yǎng)層浸潤等過程(張博等，2005；張省等，2014)。

MMPs是一類活性依賴于鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶，是降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix)的主要成分，TIMPs是一組抑制MMPs活性的低分子量蛋白，目前已確定有4個(gè)成員(TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3，TIMP-4)。研究表明MMPs/TIMPs比值增高可促進(jìn)甲狀腺癌、膀胱癌、胃腸道癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、惡性表型和侵襲轉(zhuǎn)移表型腫瘤的增殖、遷移和侵襲(華特波等，2011；張彪，陳仙，2011；端傳友，2012；黃榕權(quán)等，2014；李霞斌等，2014)。最近也發(fā)現(xiàn)MMPs/TIMPs在宮頸癌、卵巢上皮性腫瘤、葡萄胎、胎膜早破等產(chǎn)科疾病中也有相應(yīng)的表達(dá)(陳春瑩等，2012；趙娟等，2012；常雅麗等，2014)。正常情況下，MMPs和TIMPs相互作用，處于協(xié)調(diào)的平衡關(guān)系，這個(gè)平衡關(guān)系一旦被打破，各種疾病就會出現(xiàn)(余薇，周鵬程，2012)。Morgan(2010)發(fā)現(xiàn)人類滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的MMP-9有很強(qiáng)的入侵能力。MMP-9/TIMP-1，3在分泌期子宮內(nèi)膜的高表達(dá)可以增加子宮內(nèi)膜的容受性，有利于胚胎著床(孫光娟，周惠芳，2013)。由此可見，在胎盤的形成過程中，MMP-9在滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲調(diào)控中的作用尤為重要，然而有關(guān)MMP-9/TIMP-1在胎盤形成中期表達(dá)及分子機(jī)制研究的文獻(xiàn)較少，因此本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化進(jìn)一步觀察MMP-9和TIMP-1蛋白在孕鼠胎盤形成中期的表達(dá)情況，初步探索MMP-9和TIMP-1在胎盤形成進(jìn)程中的表達(dá)模式，為研究孕鼠胎盤形成的分子機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

清潔級KM雌鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20.0～25.0 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2012-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK(渝)2012-0001]。雄鼠與動(dòng)情期雌鼠1∶2合籠，次日09∶00觀察到陰栓者記為妊娠第1天(D1)，收集D9～D14的胎盤組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后，制作石蠟切片(5 μm)。

山羊源性MMP-9(sc-6840)多克隆抗體和兔源性TIMP-1(sc-5538)多克隆抗體均購自Santa cruz公司；SP kit兔源試劑盒(SP9001)、SP kit山羊源試劑盒(PV-9003)、辣根酶標(biāo)記抗山羊IgG(ZB2306)及DAB顯色試劑盒(ZLI-9017)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；伊紅染液(D019-1)和蘇木素染液(D005-2)均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠胎盤的收集 取孕鼠D9～D14植入位點(diǎn)，采用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，4%多聚甲醛固定24 h后，經(jīng)梯度酒精脫水、常規(guī)石蠟包埋和切片。隨后用伊紅染液和蘇木素染液常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察胎盤的組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 免疫組化 免疫組化按北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的SP免疫組化染色試劑盒說明書進(jìn)行。孕鼠D9～D14植入位點(diǎn)石蠟切片(5 μm)，切片進(jìn)行脫蠟，復(fù)水，枸櫞酸溶液抗原修復(fù)，山羊血清封閉，加入山羊源性MMP-9(1∶400稀釋)和兔源性TIMP-1(1∶300稀釋)的多克隆抗體，4 ℃孵育過夜(16～18 h)，次日分別加入兔抗山羊和山羊抗兔的二抗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液(S-A/HRP)，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片，顯微鏡下觀察MMP-9和TIMP-1在孕鼠D9～D14胎盤中的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 孕鼠D9～D14植入位點(diǎn)HE染色情況

HE染色結(jié)果顯示，D9和D10時(shí)胎盤的3層結(jié)構(gòu)尚未形成，此時(shí)Dec區(qū)域比較大，Epc似錐形，形態(tài)明顯，絨毛膜板和Epc緊密相連；D11時(shí)胎盤的3層結(jié)構(gòu)開始形成，包括Dec、Sp和Lab，Dec區(qū)域仍較大，Sp和Lab區(qū)域很?。籇11～D14，胎盤整體面積逐漸增大，Dec區(qū)域逐漸縮小，Sp和Lab區(qū)域逐漸增大；D13時(shí)胎盤的完整形態(tài)結(jié)構(gòu)基本形成，且和D14的形態(tài)結(jié)構(gòu)基本一致(圖1)。

2.2 MMP-9在孕鼠D9～D14胎盤中的表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示MMP-9在孕鼠D9～D14胎盤中都有相應(yīng)的表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞核中，強(qiáng)表達(dá)于D9和D10的Epc，D10～D13的Dec和Sp中，在D11～D13的滋養(yǎng)巨細(xì)胞(trophoblast giant cell, TGC)和D13的Lab區(qū)域中也有較強(qiáng)的表達(dá)，MMP-9弱表達(dá)于D14胎盤的3層結(jié)構(gòu)中(圖2)。Image Pro Plus圖像分析顯示，MMP-9蛋白在孕鼠D11胎盤的Lab、D12的Dec和Lab、D13的Dec、Sp、Lab區(qū)域中陽性細(xì)胞的IOD值均顯著高于D14的Dec、Sp、Lab區(qū)域的IOD值(P<0.05)，D10和D11的Dec區(qū)域陽性細(xì)胞的IOD值均極顯著高于D14的Dec區(qū)域的IOD值(P<0.01)(表1)。

圖1 孕鼠D9～D14植入位點(diǎn)的HE染色情況(40×)Fig.1 HE staining of implantation sites from day 9 to 14 of pregnant mice (40×)

ut. 子宮基膜, Dec. 蛻膜區(qū), Epc. 外胎盤錐, Cp. 絨毛膜板, Emb. 胚胎, Am. 羊膜, Sp. 海綿滋養(yǎng)細(xì)胞層, Lab. 迷路區(qū)。

ut. uterine basal membrane, Dec.decidua basalis, Epc. ectoplacental cone, Cp. chorionic plate, Emb. embryo, Am. amnion, Sp. spongiotrophoblast, Lab. labyrinth.

圖 2 MMP-9在孕鼠D9～D14胎盤組織中的表達(dá)情況(400×)Fig.2 The expression of metalloproteinase-9 in placenta from day 9 to 14 of pregnant mice (400×)

Dec.蛻膜區(qū), Epc. 外胎盤錐, TGC. 滋養(yǎng)巨細(xì)胞, Sp. 海綿滋養(yǎng)細(xì)胞層, Lab. 迷路區(qū)。

Dec. decidua basalis, Epc. ectoplacental cone, TGC. trophoblast giant cell, Sp. spongiotrophoblast, Lab. labyrinth.

表1 MMP-9在孕鼠D9～D14胎盤組織中陽性細(xì)胞的積分光密度值變化±s)Table 1 The changes of integrated optical density of MMP-9 in placenta from day 9 to 14 of pregnant mice ±s)

注： Dec. 蛻膜區(qū)， Epc. 外胎盤錐， Sp. 海綿滋養(yǎng)細(xì)胞層， Lab. 迷路區(qū)； 與D14比較，*P<0.05，**P<0.01; 下表同。

Notes: Dec. decidua basalis, Epc. ectoplacental cone, Sp. spongiotrophoblast, Lab. labyrinth; compared with day 14 of pregnancy,*P<0.05,**P<0.01; the same below.

2.3 TIMP-1在孕鼠D9～D14胎盤中的表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示，TIMP-1主要表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞核中，在孕鼠D9和D10胎盤的Epc，D13和D14的Dec中有少量的表達(dá)，其他時(shí)間在胎盤的Dec、Sp、Lab及TGC中幾乎均沒有表達(dá)(圖3)。Image Pro Plus圖像分析顯示，TIMP-1在孕鼠D9～D12胎盤的Dec區(qū)域中陽性細(xì)胞的IOD值均顯著低于D14的Dec區(qū)域IOD值(P<0.05)，D13胎盤的Dec與D14胎盤的Dec區(qū)域中TIMP-1陽性細(xì)胞的IOD值比較無差異(表2)。

2.4 MMP-9/TIMP-1在孕鼠D9～D14胎盤中的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MMP-9/TIMP-1比值高表達(dá)于D9～D12胎盤中的Dec及D12、D13的Lab區(qū)域中，與D14胎盤中各區(qū)域MMP-9/TIMP-1比值相比，D9、D11胎盤中的Dec及D12的Lab區(qū)域中比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，D10、D12胎盤中的Dec

和D13的Lab區(qū)域中比值差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表3)。

3 討論

胎盤不僅是母胎氣體營養(yǎng)物質(zhì)交換和胎兒代謝物排泄的場所，同時(shí)也是一個(gè)重要的內(nèi)分泌器官。有研究表明各種轉(zhuǎn)錄因子、激素、生長因子和細(xì)胞因子等通過旁分泌和自分泌方式參與了滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、分化、侵襲及母體血管重建等胎盤的形成過程(Maltepeetal.，2010；Kentetal.，2012；Luoetal.，2013)。 滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵入行為與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移具有相似的生物行為學(xué)特性，MMPs及TIMPs與正常妊娠及異常妊娠的關(guān)系越來越受到重視(趙紅彩等，2010)。近年來研究表明，MMPs/TIMPs的比值在絨癌、妊高征、多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥等產(chǎn)科疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用(李燕，張慶文，2013；武軍等，2013；胡亞濤等，2014)。MMP-2、MMP-8、MMP-11、MMP-16、MMP-19的高表達(dá)和TIMP-1、PAI-1表達(dá)下調(diào)可參與絨癌侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)(蘇曉華，龐戰(zhàn)軍，2015)。孕早期絨毛組織中IL-6和MMP-2的正常表達(dá)對維持早期胚胎發(fā)育起到一定作用(崔世紅等，2014)，MMP-9能促進(jìn)肺癌、胃癌、側(cè)裂區(qū)腦膠質(zhì)瘤、膀胱癌、涎腺腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等過程(李晨等，2013；高放等，2014；姚益群等，2014；張賀軍，朱軍，2014；代婧，雷志敏，2015；張誠，劉艷輝，2015)。胎膜早破與MMP-9/TIMP-1比值和MMP-9/TIMP-2比值的調(diào)控密切相關(guān)(郭琦等，2014)。MMPs和TIMPs家族參與了囊胚植入、胎盤形成的過程，但具體的分子機(jī)制目前還在不斷的探索研究中。

圖 3 TIMP-1在孕鼠D9～D14胎盤組織中的表達(dá)情況(400×)

Fig.3 The expression of TIMP-1 in placentas from day 9 to 14 of pregnant mice (400×)

Dec.蛻膜區(qū), Epc. 外胎盤錐, TGC. 滋養(yǎng)巨細(xì)胞, Sp. 海綿滋養(yǎng)細(xì)胞層, Lab. 迷路區(qū)。

Dec. decidua basalis, Epc. ectoplacental cone, TGC. trophoblast giant cells, Sp. spongiotrophoblast, Lab. labyrinth.

表2 TIMP-1在孕鼠D9～D14胎盤組織中陽性細(xì)胞的積分光密度值變化±s)Table 2 The changes of integrated optical density of TIMP-1 in placenta from day 9 to 14 of pregnant mice ±s)

表3 MMP-9/TIMP-1在孕鼠D9～D14胎盤組織中的變化Table 3 The changes of MMP-9/TIMP-1 in placenta from day 9 to 14 of pregnant mice ±s)

研究發(fā)現(xiàn)正常早孕絨毛組織中MMP-9蛋白表達(dá)水平同樣隨妊娠周數(shù)增加而逐漸升高，并在孕8～10周達(dá)到最高峰，而后逐漸降低，MMP-9 mRNA強(qiáng)表達(dá)于孕早、中期，TIMP-1 mRNA強(qiáng)表達(dá)于孕晚期，MMP-9及TIMP-1協(xié)同表達(dá)可能在滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲、受精卵著床、血管重建過程中發(fā)揮一定的作用(楊中玫等，2013)。研究表明MMP-2、MMP-9和TIMP-1、TIMP-2在妊娠胚胎植入、滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲、胎盤形成和各種腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用是非常關(guān)鍵的(Chen & Li，2011)。本實(shí)驗(yàn)通過對孕鼠D9～D14胎盤形態(tài)學(xué)變化的觀察及MMP-9、TIMP-1蛋白在相應(yīng)天數(shù)中表達(dá)的檢測，結(jié)果顯示孕鼠D9和D10時(shí)Dec較大，Epc形態(tài)明顯，D11時(shí)胎盤的形態(tài)結(jié)構(gòu)開始形成，隨著妊娠天數(shù)的增加，Dec區(qū)域縮小，Sp和Lab區(qū)域逐漸增大，D13時(shí)胎盤形態(tài)基本完全形成,MMP-9強(qiáng)表達(dá)于D9和D10胎盤的Epc、D10～D13的Dec、Sp及D11～D13的TGC，弱表達(dá)于D14的胎盤中,TIMP-1弱表達(dá)于D9和D10的Epc，D13和D14的Dec。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)MMP-9/TIMP-1比值高表達(dá)于D9～D12胎盤中的Dec及D12、D13的Lab區(qū)域中，低表達(dá)于D14的胎盤中，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示與D14胎盤中各區(qū)域MMP-9/TIMP-1比值進(jìn)行比較，D9、D11胎盤中的Dec及D12的Lab區(qū)域中比值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，D10、D12胎盤中的Dec和D13的Lab區(qū)域中MMP-9/TIMP-1比值差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在MMP-9強(qiáng)表達(dá)的區(qū)域中TIMP-1只有在D9和D10胎盤的Epc區(qū)域中微弱表達(dá)，當(dāng)MMP-9弱表達(dá)時(shí)，TIMP-1有較強(qiáng)的表達(dá)，由此我們可以推測在孕鼠胎盤的形成中期，MMP-9和TIMP-1可能共同參與了對胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力的調(diào)節(jié)，在胎盤尚未完全形成之前，MMP-9的高表達(dá)和TIMP-1的弱表達(dá)可能參與促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和胎盤形成，當(dāng)胎盤3層結(jié)構(gòu)基本形成之后，TIMP-1的高表達(dá)可以明顯抑制MMP-9的功能，從而阻止胎盤形成的異常，在孕鼠胎盤形成的過程中，MMP-9/TIMP-1動(dòng)態(tài)表達(dá)能夠有效調(diào)控胚胎植入和胎盤形成，兩者處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡過程。TIMP-1拮抗MMP-9對細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用，避免滋養(yǎng)層細(xì)胞對子宮內(nèi)膜的過度侵襲，二者的動(dòng)態(tài)平衡有利于囊胚植入，使妊娠順利進(jìn)行。

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The Expression Pattern of Matrix Metalloproteinase-9 and Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 in Placentation of Pregnant Mice

WEI Mengmei1, WU Shuguang2, ZHAO Hai2*

(1. The Pharmacy College, Guiyang College of Traditional Chinese, Guiyang 550002, China;2. Institute of Laboratory Animal, Guiyang College of Traditional Chinese, Guiyang 550002, China)

Objective To study the expression pattern of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) in placentation of pregnant mice. Methods HE staining was used to check the morphological structure of placentas during pregnancy (day 9～day 14). Besides, the expression levels of MMP-9 and TIMP-1 in placentation were detected by using immunohistochemistry. Results The morphological structure of placenta began to form on day 11, which was constituted of decidua basalis (Dec), spongiotrophoblast (Sp), and labyrinth (Lab) of pregnant mice; the area of Dec was decreased, whereas the area of Sp and Lab were increased with the increasing of pregnancy days; the expression of MMP-9 and TIMP-1 were mainly distributed in cytoplasm and cell nucleus, which was strong expressed in ecto-placental cone of placenta on day 9 and day 10, the Dec, Sp from day 10 to 13 and trophoblast giant cells from day 11 to 13. The integrated optical density (IOD) of MMP-9 in Lab of day 11, in Dec and Lab of day 12, and in placenta of day 13 were significantly higher than that of day 14 (P<0.05); IOD of TIMP-1 in Dec during day 9 to 12 was significantly lower than that of day 14 (P<0.05); the ratio of MMP-9/TIMP-1 in Dec on days 9 and 11 and in Lab on day 12 were significantly higher than that of day 14 (P<0.05); the ratio of MMP-9/TIMP-1 in Dec on days 10 and 12 and in Lab on day 13 were also very significantly higher than that of day 14 (P<0.01). Conclusion MMP-9 and TIMP-1 may play an important role in regulating the formation of the placenta by collaborative expression.

matrix metalloproteinases; tissue inhibitor of metalloproteinases; placenta; ectoplacental cone

2016-04-03 接受日期：2016-07-05

魏孟梅， 碩士研究生， 從事藥物毒理研究， E-mail：1432016508@qq.com

*通信作者Corresponding author， 碩士， 助理實(shí)驗(yàn)師， 從事胎盤形成研究， E-mail：344947218@qq.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160072

Q954

A

1000-7083(2016)05-0703-06