日本三角渦蟲成體干細(xì)胞的異質(zhì)性研究進(jìn)展

宇文延青， 茍士正， 陳廣文

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007)

日本三角渦蟲成體干細(xì)胞的異質(zhì)性研究進(jìn)展

宇文延青， 茍士正， 陳廣文*

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007)

Neoblasts是日本三角渦蟲Dugesiajaponica成體體內(nèi)唯一具有增殖和分化能力的多能干細(xì)胞，是其損傷修復(fù)和再生的細(xì)胞基礎(chǔ)。Neoblasts的組成是均質(zhì)還是異質(zhì)，長期以來一直存在爭議。近年來研究表明，neoblasts具有異質(zhì)性，由不同的細(xì)胞亞群組成。本文從形態(tài)、射線抗性、細(xì)胞周期及分子標(biāo)志等4個方面綜述了neoblasts異質(zhì)性研究的最新進(jìn)展，為將來探討neoblasts不同亞群功能、相互關(guān)系及各亞群在渦蟲再生過程中的作用提供借鑒。

日本三角渦蟲；成體干細(xì)胞；異質(zhì)性

日本三角渦蟲Dugesiajaponica隸屬于扁形動物門Platyhelminth渦蟲綱Turbellaria三腸目Tricladida，具有極強的再生能力，因而成為研究動物再生機制的模式動物之一(Sluysetal.，2009)。Neoblasts是渦蟲體內(nèi)唯一具有增殖和分化能力的細(xì)胞，是其組織更新、損傷修復(fù)和再生的基礎(chǔ)(Slack，2011；Rossietal.，2014b；Scimoneetal.，2014；Mangeletal.，2016)。然而關(guān)于neoblasts的組成一直以來爭論不休，即渦蟲體內(nèi)的neoblasts是均質(zhì)的還是像高等動物一樣有一定程度的分化。Neoblasts最初是指蚯蚓體內(nèi)未分化的胚胎樣小細(xì)胞，1897年Randolph將其引入渦蟲研究(Rink，2013)，特指渦蟲體內(nèi)具有較大核質(zhì)比、對X-射線敏感的一群小細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡下，渦蟲實質(zhì)組織中各種細(xì)胞界限不清晰，細(xì)胞類型難以分辨。透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)下，neoblasts呈圓形，直徑5～10 μm；細(xì)胞核較大，位于細(xì)胞中央，核內(nèi)含少量異染色質(zhì)；細(xì)胞質(zhì)較少，內(nèi)含大量游離核糖體和少量細(xì)胞器，富含擬染色體(chromatoid bodies)(Matsumotoetal. ，2006；Rink，2013)。因為neoblasts形態(tài)差異不大，而且是多能或全能干細(xì)胞，因此最初認(rèn)為neoblasts是均質(zhì)的，然而近些年的研究表明neoblasts呈明顯異質(zhì)性，即neoblasts是由不同亞群組成的，其異質(zhì)性主要表現(xiàn)在以下幾個方面。

1 形態(tài)異質(zhì)性

Baguna等(1990)通過研究渦蟲的生長發(fā)育和退行性變化，推測neoblasts可能由3群細(xì)胞組成，即小細(xì)胞群(未定型、具有增殖能力)、較大細(xì)胞群(未分化、具有有限增殖能力)和第三群(完全無增殖能力，約占neoblasts總數(shù)的50%)。Schurmann等(1998)通過對離心純化的neoblasts進(jìn)行觀察，根據(jù)形態(tài)學(xué)差異將其分為4類：Ⅰ型(圓形，核位于中央，數(shù)量較多)、Ⅱ型(梨狀，具有顯著的單極性)、Ⅲ型(雙極狀)和Ⅳ型(細(xì)胞核位于細(xì)胞一側(cè)，胞漿內(nèi)具泡狀結(jié)構(gòu))。細(xì)胞培養(yǎng)顯示，neoblasts細(xì)胞存活率達(dá)90%以上，且在1周內(nèi)具有分裂能力。該研究表明neoblasts在形態(tài)上具有異質(zhì)性，但這種形態(tài)學(xué)上的差異是否因離心造成并不清楚。Reddien等(2005)和Hayashi等(2006)分別以地中海渦蟲Schmidteamediterranea和日本三角渦蟲為材料，用Hoechst 33342(標(biāo)記核)、calcein AM(標(biāo)記胞質(zhì))和PI(標(biāo)記死細(xì)胞)3種熒光染料對分散的渦蟲細(xì)胞標(biāo)記后，進(jìn)行熒光標(biāo)記流式分選(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)，通過實驗組與輻射致死組比較，將渦蟲細(xì)胞分為3群，即X1、X2和XIS(或X-ray insensitive，Xin)。X1細(xì)胞呈圓形，胞質(zhì)少，直徑約10 μm，嗜Hoechst 33342，對X-射線敏感；X2細(xì)胞呈圓形，直徑較X1小，約 6 μm，嗜calcein AM；XIS(Xin)為X-射線不敏感細(xì)胞。上述研究證實了Baguna等(1990)關(guān)于neoblasts由小細(xì)胞群(X2)和較大細(xì)胞群(X1)組成的推測，但是否存在“第三群”還有待進(jìn)一步研究。Higuchi等(2007)用TEM技術(shù)分別對從X1、X2和XIS選出的100個細(xì)胞進(jìn)行觀察后，將渦蟲的細(xì)胞歸為3類：干細(xì)胞(stem cells)、分化期細(xì)胞(differentiating cell或regenerative cells)和已分化細(xì)胞(differentiated cells)。干細(xì)胞具有典型的未分化細(xì)胞特征，胞漿內(nèi)具有擬染色體；分化期細(xì)胞含輕度發(fā)育的多層粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(multiple rough endoplasmic reticulum，RER)和類似干細(xì)胞的胞質(zhì)特征(如胞漿內(nèi)含擬染色體)；已分化細(xì)胞有發(fā)達(dá)的RER和細(xì)胞特異細(xì)胞器。還有一些細(xì)胞，其特征介于干細(xì)胞和分化期細(xì)胞之間，被命名為未歸類細(xì)胞(unclassified cells)。X1主要包括干細(xì)胞和分化期細(xì)胞，處于細(xì)胞周期的S/G2/M期。分化期細(xì)胞可能是定向neoblasts或neoblasts的子代細(xì)胞。X2由neoblasts(19%)、分化期細(xì)胞(2%)、已分化細(xì)胞(56%)和未歸類細(xì)胞(23%)組成。已分化細(xì)胞包括腺細(xì)胞、桿狀細(xì)胞和肌肉細(xì)胞等。如果將未歸類細(xì)胞作為neoblasts，則neoblasts占X2細(xì)胞總數(shù)的50%左右。值得注意的是，在X2內(nèi)還有一群個體較小、含少量擬染色體和高度異染核的細(xì)胞群，處于G0/G1期，其功能還不明確。Higuchi等(2007)和Eisenhoffer等(2008)根據(jù)neoblasts核內(nèi)常染色質(zhì)和異染色質(zhì)的含量，將其分為A型(常染色質(zhì)含量高，胞漿富含擬染色體)和B型(異染色質(zhì)含量高，胞漿含少量擬染色體)。X1群主要由A型neoblasts組成，占X1細(xì)胞總數(shù)的89%，A型neoblasts可能是已定型的子代干細(xì)胞；B型neoblasts占X2細(xì)胞總數(shù)的32%，可能是處于緩慢細(xì)胞周期中或定型過程中的neoblasts。由此可見，neoblasts是由具有一定形態(tài)差異的細(xì)胞群組成，這些形態(tài)差異的neoblasts可能是處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞，執(zhí)行著不同功能，其細(xì)胞干性還需要進(jìn)一步研究。

2 X-射線抗性異質(zhì)性

Salvetti等(2009)用不同非致死劑量X-射線輻射渦蟲后，發(fā)現(xiàn)盡管渦蟲體內(nèi)的neoblasts數(shù)量因輻射明顯下降，但渦蟲體內(nèi)仍有抗性細(xì)胞重新增殖，neoblasts數(shù)量得以恢復(fù)。研究還發(fā)現(xiàn)，在受輻射渦蟲的腹面近神經(jīng)系統(tǒng)部位有強烈的增殖活性，該處增殖形成的細(xì)胞向背部實質(zhì)組織遷移并與背部抗性細(xì)胞匯合，最后重建完整的neoblasts細(xì)胞群。該研究表明，在neoblasts中可能存在對X-射線有抗性的細(xì)胞亞群。FACS分析顯示：X-射線(5 Gy)輻射3 d后，X1和X2細(xì)胞數(shù)量均減少，后又逐漸上升，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是在X1中存在一個抗5 Gy輻射的亞群，它可以增殖形成X1和X2細(xì)胞；或在X2中亦存在一個輻射抗性亞群。射線抗性細(xì)胞可能是已經(jīng)定型或處于分化期的細(xì)胞，它們可能具有重新獲得細(xì)胞干性的能力。單細(xì)胞移植實驗表明，cNeoblast(clonic neoblasts)主要形成于渦蟲的腹面，而非致死劑量X-射線輻射后存活的neoblasts也主要位于腹面，因此cNeoblasts有可能是位于渦蟲腹面的一個neoblasts亞群，也可能是由于技術(shù)原因?qū)е虏煌恢胣eoblasts對輻射敏感性產(chǎn)生了差異，但從渦蟲任何片段都能再生形成一個完整的個體看，cNeoblasts理應(yīng)是廣泛分布且數(shù)量較大的細(xì)胞群(Wagneretal. ，2011)。輻射抗性是否由于細(xì)胞處于G0期所致，neoblasts是否存在G0期細(xì)胞仍需進(jìn)一步研究。

3 細(xì)胞周期異質(zhì)性

采用細(xì)胞周期蛋白B基因(cyclinB基因)對X1和X2所處的細(xì)胞周期進(jìn)行檢測，結(jié)果表明X1內(nèi)cyclinB陽性細(xì)胞達(dá)96%，而X2內(nèi)為0，這表明X1細(xì)胞為處于分裂期的細(xì)胞。進(jìn)一步研究顯示，在X1中，約19.65%的細(xì)胞處于S期，74.70%處于G2/M期；X2和XIS主要由處于非更新期細(xì)胞(處于G0/G1期)組成，分別占75.20%和81.63%(Reddienetal.，2005)。因此，neoblasts是由處于細(xì)胞周期不同階段的細(xì)胞群組成，這些細(xì)胞群來源于同一祖先還是不同的祖先，它們的去向如何仍需深入研究。

4 分子標(biāo)記異質(zhì)性

Smedwi-1和DjpiwiA分別是地中海渦蟲和日本三角渦蟲neoblasts群的特異性標(biāo)志基因，即二者所有neoblasts都呈Smedwi-1或DjpiwiA陽性，它們的編碼蛋白屬Argonaute蛋白家族的亞類。piwi基因最早發(fā)現(xiàn)于動物的生殖細(xì)胞中，編碼PIWI蛋白，該蛋白能特異地與piRNA(PIWI-interacting RNA)相互作用，在表觀遺傳學(xué)水平和轉(zhuǎn)錄后水平沉默基因組自私性遺傳元件(如轉(zhuǎn)座子等)，參與生殖干細(xì)胞自我維持及分化、命運決定、減數(shù)分裂和精子形成等生物過程。與其他動物不同的是，渦蟲中至少存在3種以上的piwi基因同源物，其分布也不僅限于生殖細(xì)胞系(Reddienetal.，2005；Guoetal.，2006；Rossietal.，2006；Yoshida-Kashikawaetal.，2007；Wagneretal.，2011；Nakagawaetal.，2012)。在日本三角渦蟲中，有4種piwi基因同源物——DjpiwiA/B/C/D。DjpiwiB基因僅在排列于身體背中線上的小細(xì)胞中表達(dá)，DjpiwiB陽性細(xì)胞不直接參與再生過程，其所在部位對身體重塑非常重要，因此它們可能在渦蟲身體重塑中起重要作用(Rossietal.，2006；Salvettietal.，2009)。用原位雜交(insituhybridizations)和實時定量熒光PCR(qPCR)技術(shù)檢測Smedwi-1/2基因在X1和X2中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，二者主要表達(dá)于X1細(xì)胞群，在X2中的表達(dá)量低，因此X1和X2在分子特征上是不同質(zhì)的(Reddienetal.，2005；Eisenhofferetal.，2008)。Hayashi等(2010)用單細(xì)胞qPCR對X1、X2和XIS的分子特征進(jìn)行研究，結(jié)果表明：S期特異基因(Djmcm2、Djmcm3和Djpcna)、piwi基因同源物(DjpiwiA/B/C/D)、擬染色體組分(DjvlgA和Djcbc-1)和生殖干細(xì)胞特異性基因nos在X1、X2和XIS中的表達(dá)均存在差異，如在X1中，有18.5%細(xì)胞呈Djmcm2陽性，44.4%呈Djmcm3陽性，45.5%呈Djpcna陽性；51%的Djmcm2陽性細(xì)胞共表達(dá)Djpcna基因，約50%的Djmcm3陽性細(xì)胞共表達(dá)Djpcna基因，Djmcm2陽性細(xì)胞中有36.4%共表達(dá)Djmcm3基因；僅有3.9%的細(xì)胞共表達(dá)所有3種基因。Moritz等(2012)用提取的neoblasts細(xì)胞膜蛋白免疫小鼠制備單克隆抗體，對neoblasts的表面標(biāo)志進(jìn)行研究，結(jié)果表明：在X1中至少存在6-9.2(8-22.2)+/NB.32.1g+/Agat1+/Myhc+(約占X1的2/3)和6-9.2(8-22.2)-/NB.32.1g-/Agat1-/Myhc-(約占X1的1/3)2個細(xì)胞亞群，這2個亞群可能是命運未決定且有自我更新能力的細(xì)胞。van Wolfswinkel等(2014)通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析將neoblasts分為2個主要亞群，即ζ亞群和δ亞群。ζ亞群主要產(chǎn)生有絲分裂期后的細(xì)胞系，如上皮細(xì)胞等(Zhuetal.，2015)；δ亞群對損傷產(chǎn)生應(yīng)答，具有多能細(xì)胞特征，能產(chǎn)生如腎管細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、視覺細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞及ζ亞群。Rossi等(2014a)對neoblasts中反式剪切前導(dǎo)序列SL3(spliced leader 3)研究發(fā)現(xiàn)：在X1中，Smedwi-1+/SL1+細(xì)胞明顯多于Smedwi-1+/SL3-細(xì)胞，表明SL3陽性細(xì)胞是neoblasts的一個亞群。Scimone等(2014)對損傷渦蟲neoblasts轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究，結(jié)果表明，再生過程中，渦蟲體內(nèi)存在形成再生組織所需的含組織特異性轉(zhuǎn)錄因子的neoblasts，再生芽基由高度異質(zhì)的neoblasts譜系形成。值得注意的是，在渦蟲腦神經(jīng)元中也發(fā)現(xiàn)DjpiwiB、DjpiwiC、DjvlgA和Djcbc-1等基因表達(dá)，而上述基因均為neoblasts標(biāo)志基因。在X1中也存在少量DjMHC-A(肌細(xì)胞標(biāo)志基因)陽性細(xì)胞，同時這些細(xì)胞均為DjpiwiA陽性，具有neoblasts分子特征。在X2中有81.8%的DjMHC-A陽性細(xì)胞也表達(dá)neoblasts標(biāo)志基因；sp6-9+/eya+(特異表達(dá)于視杯)與smedwi-1、h2b(histoneh2b)共表達(dá)于視杯前體細(xì)胞(Hayashietal.，2010；Scimoneetal.，2010)。上述研究表明neoblasts中可能包含已分化定向的干細(xì)胞。Zhu等(2015)通過轉(zhuǎn)錄組分析篩選出32個祖代上皮細(xì)胞標(biāo)志，這些標(biāo)志將祖代上皮細(xì)胞分為早、晚2個亞群——prog-1/2亞群(早期)和AGAT-1亞群(晚期)。早期亞群在輻射后48 h內(nèi)消失，而晚期亞群在48 h至7 d消失。細(xì)胞質(zhì)中具擬染色體是neoblasts最顯著的特征(Coward，1974；Hori，1982)之一。日本學(xué)者Kashima等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，在日本三角渦蟲中，DjCBC-1特異性擬染色體與Y12特異性擬染色體在結(jié)構(gòu)上具有顯著的不同。后者與DjpiwiC相似，具有抗轉(zhuǎn)座活性，neoblasts在擬染色體組成上的異質(zhì)性還有待進(jìn)一步研究?？傊?，neoblasts是由具有不同分子特征的亞群組成，不同亞群在neoblasts中比例不同，而且具有不同的分化能力和分化方向，并可能存在干性差異。

5 結(jié)語與展望

Noeblasts是成體日本三角渦蟲細(xì)胞循環(huán)、損傷組織修復(fù)及器官再生的細(xì)胞基礎(chǔ)，是渦蟲生物學(xué)研究的熱點之一。盡管單細(xì)胞移植實驗證明了neoblasts的多能性(Wagneretal.，2011)，但關(guān)于neoblasts的組成之爭并沒有徹底解決。近年隨著生物技術(shù)的發(fā)展，生物學(xué)家利用組織學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)對neoblasts的組成進(jìn)行了研究，認(rèn)為neoblasts是異質(zhì)的，由不同細(xì)胞亞群組成，但目前并不知道neoblasts究竟包含哪些亞群，這些亞群具有怎樣的標(biāo)志及功能，更不清楚這些亞群之間的關(guān)系。因此，進(jìn)一步系統(tǒng)地研究和鑒別這些亞群，通過基因敲除等技術(shù)對其功能進(jìn)行研究，將有助于解析渦蟲再生和損傷修復(fù)機制，并將為其他動物乃至人類的干細(xì)胞生物學(xué)研究提供借鑒。

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The Heterogeneity of Neoblasts in the PlanarianDugesiajaponica

YUWENYanqing，GOUShizheng，CHENGuangwen*

(School of Life and Sciences， Henan Normal University， Xinxiang， Henan Province 453007， China)

Neoblasts are considered as the sole somatic stem cells in the planarianDugesiajaponicawith the capacity to proliferate and give rise to all cell types during regeneration， and they are the cellular basis for wound repair and regeneration. Previous researches demonstrated that neoblasts were composed by different subpopulations， which meant that they were heterogeneous. We reviewed the heterogeneity of neoblasts in aspects of mophology， radio-resistance， cell cycle and molecular markers， which was important for further studying the relationships between neoblast subpopulations， their effects on planarian regeneration and understanding the survival strategy of planarians.

Dugesiajaponica; neoblasts; heterogeneity

2016-04-01 接受日期：2016-05-31

國家自然科學(xué)基金項目(31471965); 河南省教育廳河南省高等學(xué)校重點科研項目(15A180017); 河南省人力資源和社會保障廳河南省博士后科研項目(2012059); 河南師范大學(xué)國家級科研項目培育基金項目(2012PL06); 河南省基礎(chǔ)與前沿研究計劃項目(162300410148)

宇文延青(1970—)， 男， 副教授， 主要從事動物資源保護(hù)與利用方面的研究， E-mail：ywyanqing@163.com

*通信作者Corresponding author， 男， 博士， 教授， 主要從事中國淡水渦蟲分類學(xué)研究， E-mail：chengw0183@sina.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160070

Q959.151； Q952

A

1000-7083(2016)05-0797-04