常山堿鹽急性毒性及其與青蒿素類藥物聯(lián)合用藥增效減毒作用

李思迪，李 春，代寶強(qiáng)，張廣平，盛益華，李建榮，葉祖光

（中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700）

常山堿鹽急性毒性及其與青蒿素類藥物聯(lián)合用藥增效減毒作用

李思迪，李 春，代寶強(qiáng)，張廣平，盛益華，李建榮，葉祖光

（中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700）

目的探索常山堿鹽（DAS）和青蒿素類藥物聯(lián)合用藥以達(dá)到增效減毒的可能性。方法 用小鼠對DAS進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，觀察小鼠的腹瀉率、死亡率、半數(shù)致死劑量（LD50）、LD90、半數(shù)腹瀉劑量（DD50）和DD90，明確DAS安全劑量；采用ip接種瘧原蟲制備的鼠瘧感染小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)抗瘧實(shí)驗(yàn)（ig給藥，每天1次，連續(xù)4 d），比較單用DAS或青蒿素類藥物、以及DAS聯(lián)合青蒿素、雙氫青蒿素（Dih）、蒿甲醚、青蒿琥酯時(shí)的抗瘧效價(jià)。動(dòng)態(tài)采集尾靜脈血，涂片并吉姆薩染色法染色，顯微鏡下觀察瘧疾小鼠瘧原蟲的轉(zhuǎn)陰以及復(fù)燃情況，計(jì)算轉(zhuǎn)陰率和抗復(fù)燃率，并計(jì)算半數(shù)有效劑量（ED50）和ED90等。結(jié)果 在急性毒性實(shí)驗(yàn)中，DAS的安全劑量為0.5 mg·kg-1。鼠瘧的體內(nèi)抗瘧實(shí)驗(yàn)中，單用DAS 0.25和0.5 mg·kg-1對瘧疾小鼠瘧原蟲的轉(zhuǎn)陰和抗復(fù)燃作用較差。與單用DAS 0.5 mg·kg-1或單用青蒿素、Dih、蒿甲醚和青蒿琥酯相比較，DAS與青蒿素（274，392和560 mg·kg-1）、Dih（52，80和123 mg·kg-1）、蒿甲醚（10，20，40和80 mg·kg-1）和青蒿琥酯（32.5，65.0和130.0 mg·kg-1）聯(lián)合應(yīng)用時(shí)瘧疾小鼠瘧原蟲的轉(zhuǎn)陰率和抗復(fù)燃率均明顯提高（P<0.05，P< 0.01）。DAS 0.5 mg·kg-1和上述青蒿素類藥物聯(lián)用，與青蒿素類藥物單用比較，效價(jià)分別提高了0.8，0.2，1.0和0.6倍，同時(shí)聯(lián)合用藥組（包括達(dá)到與單用DAS同樣療效的聯(lián)用劑量組）均未發(fā)現(xiàn)小鼠腹瀉或死亡。結(jié)論 DAS安全窗較窄，通過與青蒿素及其衍生物聯(lián)合用藥，可達(dá)到增效減毒抗瘧的目的。

常山堿鹽；青蒿素；衍生物；瘧疾；增效減毒

瘧疾是熱帶、亞熱帶主要的寄生蟲傳染病之一，是發(fā)展中國家嚴(yán)重的衛(wèi)生問題和阻礙社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展進(jìn)步的關(guān)鍵社會問題［1］。全世界每年瘧疾的發(fā)病人數(shù)為1億 ～3億，每年約80萬人口死于瘧疾［2］。在世界各地大多數(shù)瘧疾流行地區(qū)，多重耐藥蟲株的不斷出現(xiàn)極大地阻礙了目前抗瘧藥對瘧疾的預(yù)防和治療作用［3］。尤其令人擔(dān)憂的是，人惡性瘧不僅對一線用藥氯喹等喹啉類抗瘧藥產(chǎn)生了耐藥性，對目前常用的青蒿素類抗瘧藥產(chǎn)生耐藥性的病例也有報(bào)道［4］。因此，有必要盡早進(jìn)行新型結(jié)構(gòu)的新一代抗瘧藥物的研發(fā)。

常山是虎耳草科植物黃常山（Dichroa febrifuga）的干燥根。中醫(yī)認(rèn)為，常山性苦、辛、寒，歸肝、脾、心經(jīng)，常用于寒熱往來、間日瘧、三日瘧、新舊瘧疾和老痰積飲等證［5］。常山的抗瘧活性成分主要是喹唑酮類生物堿，包括常山堿甲、乙和丙3種［6］。近年來研究表明，常山主要用于治療瘧疾、雞球蟲病和藍(lán)氏賈第鞭毛蟲病等，還具有抗鉤端螺旋體、抗阿米巴原蟲、抗病毒、抗腫瘤、抗心律失常、催吐、降壓及興奮子宮平滑肌等作用［7］。常山是中醫(yī)重要的抗瘧藥物之一，據(jù)古文獻(xiàn)記載，在明清以前，常山經(jīng)常作為主藥應(yīng)用于大多數(shù)中藥抗瘧方劑中。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，其活性比奎寧高100倍［8］，但其毒副作用較大，且常山致胃腸道毒性機(jī)制研究目前極度匱乏，極大地限制了常山藥物的發(fā)展［9-10］。正因?yàn)槠涠靖弊饔幂^大，所以中藥常山在《中華人民共和國藥典》（2005年版一部）中被列為有毒藥材。本課題即采用中醫(yī)藥減毒的思路，采用二藥配伍的方法以減輕其毒副作用，通過常山堿鹽（Dichroaalkali salt，DAS）與青蒿素及其衍生物聯(lián)合用藥，減少其用量而達(dá)到減毒目的。此外，從青蒿素類抗瘧藥角度，世界衛(wèi)生組織織（WHO）推行青蒿素聯(lián)合用藥療法（artemisinin combination therapy，ACT）的宗旨就是延緩瘧原蟲對青蒿素類抗瘧藥的耐藥性的產(chǎn)生。本研究探索青蒿素類抗瘧藥和DAS聯(lián)合用藥的可能性。通過對DAS與青蒿素及其衍生物聯(lián)合用藥進(jìn)行較系統(tǒng)的藥理學(xué)和毒理學(xué)研究，明確二藥配伍后是否具有減毒作用以及抗瘧效價(jià)是否具有增效作用；換言之，采用DAS與青蒿素類藥物聯(lián)合用藥的方式，一方面降低DAS發(fā)揮藥效作用的劑量從而減輕其毒副作用的發(fā)生，另一方面解決青蒿素類藥物復(fù)燃率高且單獨(dú)用藥易產(chǎn)生的耐藥性風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品、試劑和主要儀器

昆明雄性小鼠，體質(zhì)量18 ～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2015-0001，飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所SPF動(dòng)物房，分籠常規(guī)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，光照時(shí)間為自然日照時(shí)長，適應(yīng)環(huán)境7 d后開始實(shí)驗(yàn)。青蒿素、青蒿琥酯、雙氫青蒿素（Droartemising，Dih）、蒿甲醚和DAS：由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所化學(xué)室提供，純度>99%；吉姆薩染液（批號：20140618），南京建成生物工程研究所；甲醇：分析純（批號：T20140224），國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑有限公司；吐溫80（批號：120101M），上海申宇醫(yī)藥化工有限公司；蒸餾水：由本實(shí)驗(yàn)室提供。LYMPUSBX51顯微鏡，日本Olympus公司；AE-200電子天平，日本島津公司。

1.2 常山堿鹽急性毒性實(shí)驗(yàn)

小鼠分為6個(gè)組，分別為正常對照組、DAS 0.25，0.5，1.0，2.0和4.0 mg·kg-1組，每組10只。把小鼠置于墊有濾紙的鼠籠內(nèi)，每籠1只，每日觀察并記錄小鼠的毛色、精神、腹瀉、糞便顏色，連續(xù)觀察1 h，計(jì)算半數(shù)腹瀉劑量（DD50）和DD90［11］。每天記錄小鼠死亡情況，并記錄死亡時(shí)間，連續(xù)觀察4周，計(jì)算半數(shù)致死劑量（LD50）和LD90［11］。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，迅速摘取胃、小腸和大腸等組織，肉眼觀察各器官組織的形態(tài)變化。各實(shí)驗(yàn)每組10只小鼠，ig給藥體積按20 mL·kg-1計(jì)算，正常對照組給予等體積蒸餾水。

1.3 鼠瘧伯氏鼠瘧蟲（Plasmodium berghei）感染小鼠模型制備及抗瘧活性測定

經(jīng)眼眶靜脈叢采集感染鼠瘧原蟲小鼠血液，用生理鹽水配制成每毫升含5000萬個(gè)感染鼠瘧原蟲紅細(xì)胞的接種溶液；每只小鼠ip接種0.2 mL，制備鼠瘧感染小鼠模型［12］。

小鼠體內(nèi)抗瘧實(shí)驗(yàn)分為鼠瘧感染小鼠模型組、藥物單用組（DAS 0.5 mg·kg-1；青蒿素134，192，274，392和560 mg·kg-15組，Dih 22.0，33.8，52.0，80.0和123.0 mg·kg-15組；蒿甲醚5，10，20，40和80mg·kg-15組；青蒿琥酯32.5，65.0和130.0mg·kg-13組）以及聯(lián)合用藥組（DAS 0.5 mg·kg-1+上述各青蒿素類藥物各劑量），每組10只。采用Peter 4 d給藥方法進(jìn)行抗瘧活性測定［13］。具體操作程序簡述如下：接種當(dāng)日按體質(zhì)量隨機(jī)分組并ig給藥1次，每天1次，連續(xù)4 d，模型組給予等體積蒸餾水，各實(shí)驗(yàn)組ig給藥體積按20 mL·kg-1計(jì)算，末次給藥后24 h尾部取血、涂片、吉姆薩染色，鏡下觀察各劑量組瘧原蟲的轉(zhuǎn)陰以及復(fù)燃情況，計(jì)算轉(zhuǎn)陰率〔轉(zhuǎn)陰率（%）=轉(zhuǎn)陰小鼠數(shù)/小鼠總數(shù)×100%〕、抗復(fù)燃率〔抗復(fù)燃率（%）=（轉(zhuǎn)陰小鼠數(shù)-復(fù)燃小鼠數(shù)）/小鼠總數(shù)×100%〕、半數(shù)有效劑量（ED50）和ED90［11］，抗復(fù)燃實(shí)驗(yàn)涂片觀察時(shí)間8周，并記錄小鼠的毛色、精神狀況、死亡等一般情況。效價(jià)指數(shù)=ED90（青蒿素類藥物）/ED90（DAS 0.5 mg·kg-1+青蒿素類藥物）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示。應(yīng)用SPSS 19.0軟件采用方差分析，先行方差齊性檢驗(yàn)，用各組間均數(shù)的兩兩比較法LSD進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊性要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊性的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。直線回歸法計(jì)算DAS LD50，LD90，DD50和DD90；以及實(shí)驗(yàn)藥物ED50、ED90。相關(guān)性分析采用Pearson和Spearman相關(guān)性分析法，當(dāng)兩個(gè)變量均為連續(xù)變量時(shí)，采用Pearson相關(guān)性分析，當(dāng)變量為非正態(tài)分布時(shí)，采用Spearman相關(guān)性分析。DAS與青蒿素及其衍生物聯(lián)合應(yīng)用，與DAS或青蒿素類藥物單用的組間轉(zhuǎn)陰率、抗復(fù)燃率比較分析，采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 常山堿鹽對小鼠的急性毒性

表1結(jié)果顯示，與正常對照組（DAS 0.0 mg·kg-1）比較，DAS 0.25和0.5 mg·kg-1組小鼠給藥第1 ～4天體質(zhì)量無明顯變化；DAS 1.0和2.0 mg·kg-1組小鼠在給藥第2 ～4天體質(zhì)量明顯下降（P<0.05，P< 0.01）；DAS 4.0 mg·kg-1組小鼠在給藥第1 ～2天體質(zhì)量明顯下降（P<0.01），且給藥第3和4天小鼠大量死亡，死亡率分別為80%和100%；表明DAS毒性隨劑量的增大而增加（r=0.991，P<0.01）。

Tab.1 Effect ofDichroaalkali salt（DAS）on body mass of Kunming mice

表2結(jié)果顯示，DSA 0.25，0.5和1.0 mg·kg-1組未見小鼠死亡；DAS 2.0和4.0 mg·kg-1組90%和100%小鼠出現(xiàn)明顯腹瀉，翻毛嚴(yán)重，精神萎靡，畏冷，籠內(nèi)小鼠蜷縮在一起；DAS 1.0 mg·kg-1組10%小鼠出現(xiàn)腹瀉。LD50為1.649 mg·kg-1，LD90為1.967 mg·kg-1；DD50為1.508 mg·kg-1，DD90為1.992 mg·kg-1。隨著小鼠腹瀉率的增加，死亡率也上升（r=0.997，P<0.01），說明DAS使小鼠發(fā)生腹瀉的毒性作用是其導(dǎo)致死亡的一個(gè)重要原因。

Tab.2 Effect of DAS on diarrhea rate and mortality of Kunming mice

肉眼觀察各劑量組小鼠胃、腸組織的大體形態(tài)變化。在胃、腸組織黏膜方面，DAS 0.25和0.5 mg·kg-1組小鼠未見明顯的水腫、充血和缺損等；DAS 1.0mg·kg-1組少數(shù)小鼠出現(xiàn)輕度水腫和充血，未見有黏膜缺損；DAS 2.0與4.0 mg·kg-1組小鼠出現(xiàn)較明顯的水腫、充血，嚴(yán)重的出現(xiàn)黏膜缺損、出血灶（數(shù)據(jù)略）。由此提示，DAS可造成小鼠胃腸出現(xiàn)器官組織的形態(tài)變化，提示其存在胃腸道毒性。

2.2 常山堿鹽與青蒿素及其衍生物單用或聯(lián)合應(yīng)用對鼠瘧抗瘧效價(jià)的比較

由表3所示，隨著DAS劑量的增加瘧原蟲轉(zhuǎn)陰率逐漸增加（r=0.944，P<0.05），其中DAS 2.0 mg·kg-1時(shí)瘧原蟲的轉(zhuǎn)陰率達(dá)到100%，但在安全劑量0.5 mg·kg-1轉(zhuǎn)陰率僅30%，表明DAS單用時(shí)安全窗較窄。DAS各劑量均無明顯抗復(fù)燃作用。

Tab.3 Effect of DAS on negative conversion ratio and anti-revival ratio of Kunming mice infected with plasmodium berghei

表4結(jié)果顯示，與DAS或青蒿素單用相比較，DAS與青蒿素274，392和560 mg·kg-1聯(lián)用組小鼠瘧原蟲的轉(zhuǎn)陰率和抗復(fù)燃率均明顯提高（P< 0.05，P<0.01）；且隨青蒿素劑量增加抗復(fù)燃作用逐漸增強(qiáng)（r=0.938，P<0.05）。給藥期間各組均未發(fā)現(xiàn)小鼠腹瀉或死亡。

表5結(jié)果顯示，與DAS或Dih單用相比較，DAS 0.5 mg·kg-1與Dih 52.0，80.0和123.0 mg·kg-1聯(lián)用組瘧原蟲轉(zhuǎn)陰率和抗復(fù)燃率明顯提高（P<0.05，P<0.01），且隨雙氫青蒿素劑量增加抗復(fù)燃作用逐漸增強(qiáng)（r=0.932，P<0.05）。給藥期間各組均未發(fā)現(xiàn)小鼠腹瀉或死亡。

Tab.4 Effect of DAS and artemisinin on negative conversion ratio and anti-revival ratio of Kunming mice infected withP.berghei

Tab.5 Effect of DAS and dihydroartemisinin（Dih）on negative conversion ratio and anti-revival ratio of Kunming mice infected withP.berghei

表6結(jié)果顯示，與DAS單用相比較，DAS 0.5 mg·kg-1與蒿甲醚10，20，40和80 mg·kg-1聯(lián)用組瘧原蟲轉(zhuǎn)陰率和抗復(fù)燃率均明顯提高（P<0.05，P<0.01）。隨蒿甲醚劑量增加，抗復(fù)燃作用逐漸增強(qiáng)（r=0.805，P<0.05）。給藥期間未發(fā)現(xiàn)小鼠腹瀉或死亡。

Tab.6 Effect of DAS and artemether on negative con?version ratio and anti-revival ratio of Kunming mice infected withP.berghei

表7結(jié)果顯示，與DAS或青蒿琥酯單用相比較，DAS 0.5 mg·kg-1與青蒿琥酯32.5，65.0和130.0 mg·kg-1聯(lián)合用藥組瘧原蟲轉(zhuǎn)陰率和抗復(fù)燃率明顯提高（P<0.05，P<0.01），提示DAS與青蒿琥酯聯(lián)用可有效地提高抗瘧活性，并提高抗復(fù)燃率。給藥期間各組均未發(fā)現(xiàn)小鼠腹瀉或死亡。

Tab.7 Effect of DAS and artesunate on negative con?version ratio and anti-revival ratio of Kunming mice infected withP.berghei

表8結(jié)果顯示，DAS與青蒿素類藥物聯(lián)用，使青蒿素類藥物的ED50和ED90明顯降低，提示聯(lián)用的抗瘧效價(jià)高于單用青蒿素類抗瘧藥（如青蒿素與DAS配伍前和后ED90分別為783.3和439.7 mg·kg-1，效價(jià)指數(shù)提高1.8倍）。給藥期間各組均未發(fā)現(xiàn)小鼠腹瀉或死亡。

Tab.8 Comparison of antimalarial titer between DAS and artemisinin with its derivatives

3 討論

本研究和已有的報(bào)道均證實(shí)過量常山堿可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物惡心、嘔吐、腹瀉及胃腸黏膜充血和出血［5］。據(jù)報(bào)道化學(xué)藥物口服引起胃腸道毒性可通過腸腔直接作用于腸道黏膜，或通過血液循環(huán)作用于腸嗜鉻細(xì)胞并使腸嗜鉻細(xì)胞釋放神經(jīng)遞質(zhì)，作用于腹腔迷走傳入神經(jīng)末梢的相關(guān)受體［14］。然而目前國內(nèi)外對常山堿胃腸道副作用的毒理學(xué)機(jī)制研究尚未見相關(guān)的研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，DAS 0.25和0.5 mg·kg-1時(shí)小鼠未出現(xiàn)腹瀉、死亡，但在劑量為1.0 ～2.0 mg·kg-1時(shí)，即出現(xiàn)明顯毒副作用甚至死亡，并且給予DAS的小鼠死亡率隨腹瀉率上升而上升，提示DAS使小鼠發(fā)生腹瀉的毒性作用可能是DAS導(dǎo)致小鼠死亡的一個(gè)重要原因。DAS劑量為0.5 mg·kg-1時(shí)，雖其對昆明小鼠的毒性較小或未出現(xiàn)毒性，但該劑量的DAS抗瘧活性卻較弱，DAS 0.5 mg·kg-1轉(zhuǎn)陰率平均僅為25%（10%，20%，20%，50%）。DAS 2.0 mg·kg-1時(shí)，瘧疾小鼠瘧原蟲的轉(zhuǎn)陰率雖達(dá)到100%，但最終的死亡率（給藥后2周內(nèi)）卻達(dá)到了90%?？梢姡珼AS安全窗比較小，從抗瘧的有效性和安全性角度評價(jià)，DAS的成藥性較差。因此，DAS單用難以成為一個(gè)安全有效的抗瘧藥物。本研究針對DAS安全窗窄的問題，將其配伍青蒿素類抗瘧藥，從而提高DAS的抗瘧活性。

近幾年,有關(guān)青蒿素耐藥性的報(bào)道一直不斷，最近在東南亞地區(qū)已發(fā)現(xiàn)了抗青蒿素類藥物的耐藥性瘧疾感染的人群［15］。早在1990年，就曾建議在治療瘧疾過程中必須將青蒿素同其他的抗瘧藥聯(lián)合使用，用來延緩和防止瘧疾對青蒿素的耐藥性。本研究通過DAS與青蒿素類抗瘧藥的聯(lián)用，不僅可以提高低劑量DAS的抗瘧效價(jià)，且還可解決青蒿素類藥物復(fù)燃率高且單用易產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究采用鼠瘧原蟲株接種小鼠成功復(fù)制鼠瘧感染小鼠模型，將DAS分別聯(lián)合應(yīng)用青蒿素、Dih、蒿甲醚和青蒿琥酯等抗瘧藥。結(jié)果表明，DAS聯(lián)用的抗瘧效價(jià)較之其各自單用的抗瘧轉(zhuǎn)陰率和抗復(fù)燃率均有明顯提高。在聯(lián)用中選用了較低劑量的DAS（0.5 mg·kg-1），通過和青蒿素類配伍用藥，不僅能增強(qiáng)DAS抗瘧活性，且還提高了抗復(fù)燃率。另外，由于采用了較低劑量的DAS，所以也減少了其腹瀉等胃腸道毒副作用的發(fā)生，基本上克服了DAS因胃腸道毒副作用而成藥性差的缺陷。

總之，DAS與青蒿素類藥物聯(lián)用，一方面降低DAS用量，從而減輕其毒副作用的發(fā)生；另一方面可解決青蒿素類藥物復(fù)燃率高且單用易產(chǎn)生耐藥性風(fēng)險(xiǎn)的缺陷。DAS有可能成為一種抗瘧藥應(yīng)用于臨床。本研究為青蒿素類藥物與DAS的聯(lián)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Cao J，Zhou SS，Zhou HY，Yu XB，Tang LH，Gao Q.Malaria from control to elimination in China：transition of goal，strategy and interventions［J］.Chin J Schi Contl（中國血吸蟲病防治雜志），2013，25（5）：439-443.

［2］Fu Y，Ding Y，Guo B，Liu TP，Zheng H，Tan ZP，et al.Effect of diverse donor mice used on the development of experimental cerebral malaria［J］.J Trop Med（熱帶醫(yī)學(xué)雜志），2012，12（1）：26-29.

［3］Luo D，Liu WG，Yang YM.Reaserch progress in antimalarial mechanism and drug-resistant mecha?nism of artemisinin and its derivatives［J］.Med Innov China（中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新），2014，11（9）：131-134.

［4］Zhao SM， Wang MY.Artemisinin resistance inplasmodium falciparum：global status and basic research［J］.Chin J Parasitol Parasit Dis（中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志），2014，32（5）：380-384.

［5］Xia LY.Traditional Chinese Materia Medica Toxi-cology（現(xiàn)代中藥毒理學(xué)）［M］.Tianjin：Tianjin Science and Technology Translation and Publishing Corp，2005：712-713.

［6］Zhang Y，Li C，Lei GL.Study of chemical consti?tutes inDichroa［J］.Chin J Exp Tradit Med Form（中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志），2010，16（5）：40-42.

［7］Lei HD，Liang JP，Guo ZY，Wang XH，Hua LY. Study on the acute toxicity ofDichroa febrifugaextractive［J］.Chin Anim Husb Vet Med（中國畜牧獸醫(yī)），2011，38（6）：236-238.

［8］Li Y，Liu MC，Jin LH，Hu DY，Yang S.Advances in chemicalcomponents and bioactivities ofDichroa febrifugaLour.［J］.Guangzhou Chem Ind（廣州化工），2011，39（9）：7-9.

［9］Medical teams for schistosoma and ancylostomiasis in Meishan.Clinical study for intervention of vomiting induced byDichroain treating malaria［J］.J Chengdu College Tradit Chin Med（成都中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)），1958，1（1）：56-58.

［10］Zhou YL，Zhang DJ.Clinical study ofDichroaand their volatile materials in treating malaria［J］.JChengdu College Tradit Chin Med（成都中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)），1959，2（1）：59-63.

［11］Xiong HM，Wei BQ，Wei RJ，Yang NH，Qi MY，Jin J，et al.Calculation of median lethal dose（LD50）forYersinia pestisby SPSS package［J］.Chin J Zoonoses（中國人獸共患病學(xué)報(bào)），2013，29（11）：1127-1130.

［12］Peters W.Drug resistance inPlasmodium bergheiVinckeetLips，1948.Ⅰ.Chloroquine resistance［J］.Exp Parasitol，1965，17（1）：80-89.

［13］Xu SY，Bian RL，Chen X.Methodology of Pharma?cological Experiments（藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)）［M］.2nd ed.Beijing：People′s Medical Publishing House，1991：1317.

［14］Ma J. Countermeasures on mechanisms of nausea and vomiting induced by chemotherapy［J］.Acta Acad Med Xuzhou（徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)），2010，30（9）：627-630.

［15］Zhang N.Analysis on the artemisinin resistance containment［J］.Chin J Drug Eval（中國藥物評價(jià)），2012，29（4）：300-304.

Acute toxicity of Dichroa alkali salt and efficacy enhancement and toxicity alleviation in combination with artemisinin and its derivatives

LI Si-di，LI Chun，DAI Bao-qiang，ZHANG Guang-ping，SHENG Yi-hua，LI Jian-rong，YE Zu-guang
（Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）

OBJECTIVE To explore the possibility thatDichroaalkali salt（DAS）can enhance effi?cacy and reduce toxicity when combined with artemisinin and its derivatives.METHODS Kunming mice were used in acute toxicity test of DAS.Diarrhea rate，mortality，50%lethal dose（LD50），LD90，50% diarrhea dose（DD50）and DD90were determined，and the safe dose of DAS was defined.An animal model of malaria was established by inoculating strains of the parasite in an antimalarialin vivoexperiment. The model mice were ig given drugs，once a day，for 4 d.The titer was compared between alone use and combined use of DAS with artemisinin and its derivatives.Blood of the caudal vein was dynamically collected for blood smear.Gemsa dying assay was used to observe whether the change of the parasite and its revival under a microscope in each group.Finally，negative conversion ratio，anti-revival ratio，50%effective dose（ED50）and ED90were calculated.RESULTS The safe dose of DAS was 0.5 mg·kg-1in acute toxicity test.While a low dose of DAS（0.25 and 0.5 mg·kg-1）was alone used，negative conversion ratio was relatively low and anti-revival effect was not obvious.In vivoexperiments of anti-mouse malaria indicated that compared with alone use of DAS 0.5 mg·kg-1or artemisinin with its derivatives〔artemisinin，dihydroartemisinin（Dih），artemether and artesunate〕，negative conversion ratio and anti-revival ratio were increased significantly（P<0.01，P<0.05）when DAS 0.5 mg·kg-1andartemisinin（134，192，274，392 and 560 mg·kg-1），Dih（52，80 and 123 mg·kg-1），artemether（10，20，40 and 80 mg·kg-1）and artesunate（32.5，65.0 and 130.0 mg·kg-1）were used in combination.When DAS 0.5 mg·kg-1and artemisinin with its four derivatives were in combination used，the titer was increased 1.8，1.2，2.0 and 1.6 times compared with alone use of artemisinin and its derivatives，respectively.In addition，diarrhea or death didn′t occur in combined groups.CONCLUSION DAS has a narrow safe dose window.DAS in combination with artemisinin and its derivatives can possibly reduce toxicity while enhancing efficacy.

Dichroaalkali salt；artemisinin；derivatives；malaria；efficacy enhancing and toxicity reducing

YE Zu-guang，E-mail：yezuguang@sina.com，Tel：（010）84252805

R285.1

A

1000-3002-（2016）08-0808-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.08.003

Foundation item：The project supported by National Science and Technology Major Project of China（2014ZX09304-307）；and National Science and Technology Major Project of China（2015ZX09501004）

2016-07-22接受日期：2016-08-19）

（本文編輯：賀云霞 齊春會）

國家科技重大專項(xiàng)（2014ZX09304-307）；國家科技重大專項(xiàng)（2015ZX09501004）

李思迪，助理研究員，醫(yī)學(xué)博士，主要從事藥理學(xué)和毒理學(xué)研究；葉祖光，研究員，主要從事中藥藥理學(xué)和毒理學(xué)研究。

葉祖光，E-mail：yezuguang@sina.com，Tel：（010）84252805