青蒿素類抗瘧藥的作用機(jī)制及耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

羅丹+劉偉光+楊亞明

【摘要】 青蒿素作為重要的抗瘧藥物，因其抗瘧作用效率高、速度快、毒性低并且與大部分其他類別的抗瘧藥無交叉抗性等優(yōu)點(diǎn)，成為目前全球抗瘧的主要藥物，雖然在泰柬邊境地區(qū)已出現(xiàn)了青蒿素耐藥性，但就目前全球各地使用青蒿素及其衍生物為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法（ACT）療效來看仍能達(dá)到90%以上，因此必須對(duì)剛剛出現(xiàn)的青蒿素耐藥性現(xiàn)象迅速采取遏制行動(dòng)。本文主要通過描述青蒿素的抗瘧機(jī)制，討論其耐藥性機(jī)制，以及對(duì)青蒿素的發(fā)展前景作一綜述。

【關(guān)鍵詞】 青蒿素； 抗瘧藥； 作用機(jī)制； 耐藥性機(jī)制

瘧疾（Malaria）是經(jīng)按蚊叮咬感染瘧原蟲（plasmodium，spp）所引起的蟲媒傳染病，不同的瘧原蟲可分別引起間日瘧、三日瘧、惡性瘧及卵圓瘧。惡性瘧原蟲是東南亞和非洲流行瘧疾的主要病原體，是造成患者死亡的主要?dú)⑹?，本病主要表現(xiàn)為周期性規(guī)律發(fā)作，全身發(fā)冷、發(fā)熱、多汗，長(zhǎng)期多次發(fā)作后，可引起貧血和脾腫大等危害人體健康。由于在熱帶及亞熱帶地區(qū)常年溫?zé)岢睗?，一年四季都可以發(fā)病，并且容易流行，因此有效的防治瘧疾十分重要，不僅可以保護(hù)人民身體健康和生命安全，還可以為全球根除瘧疾奠定基礎(chǔ)。

青蒿素（artemisinin）是我國(guó)科研人員1972年首次從一種菊科植物黃花蒿（Artemisia annua L.）葉中提取分離得到的有過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯藥物。由于青蒿素結(jié)構(gòu)特殊，具有抗瘧作用效率高、速度快、毒性低并且與大部分其他類別的抗瘧藥無交叉抗性等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為世界衛(wèi)生組織推薦的新的抗瘧疾藥物，是抗瘧藥史上的又一重大突破，并且為抗瘧藥的研究與發(fā)展奠定了新的基礎(chǔ)。WHO已經(jīng)將青蒿素類藥物的7 d療程給藥方案作為治療惡性瘧疾和體內(nèi)敏感測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方案[1-2]。本文根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)全球近年來有關(guān)于青蒿素類藥物及其衍生物的抗瘧作用的機(jī)制、耐藥性的產(chǎn)生及該藥的發(fā)展前景作一綜述。

1 抗瘧作用的機(jī)制

1.1 自由基的抗瘧作用 青蒿素類藥物屬于含有過氧橋的倍半萜內(nèi)酯類新型抗瘧藥，對(duì)各種瘧原蟲有效。各國(guó)學(xué)者通過對(duì)青蒿素類藥物作用機(jī)制的廣泛深入研究，發(fā)現(xiàn)如果改變了青蒿素過氧基團(tuán)這一結(jié)構(gòu)，其抗瘧的作用消失，因此普遍認(rèn)為過氧基團(tuán)這一結(jié)構(gòu)是該類化合物抗瘧作用的重要組成部分[3-5]。且迄今研究也認(rèn)為，自由基與青蒿素類藥物抗瘧活性之間也有著重要的關(guān)系，亞鐵血紅素或其他生物大分子絡(luò)合的亞鐵，在藥物活化過程中起到了關(guān)鍵作用，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)青蒿素類化合物抗瘧作用屬于氧化性機(jī)制，可以分為兩個(gè)過程，即青蒿素經(jīng)活化后產(chǎn)生自由基，繼而氧化性自由基與瘧原蟲蛋白絡(luò)合形成共價(jià)鍵，使瘧原蟲蛋白失去功能，從而導(dǎo)致蟲體的死亡[6-10]。因?yàn)檫€原分解過氧橋形成自由基時(shí)需要金屬離子的幫助，因此現(xiàn)普遍認(rèn)為亞鐵離子（Fe2+）與自由基產(chǎn)生有關(guān)，體內(nèi)Fe2+的來源一是亞鐵血紅素，二是游離Fe2+[11-12]。首先過氧橋被催化斷裂后產(chǎn)生氧自由基，后由產(chǎn)生的氧自由基經(jīng)過分子重排轉(zhuǎn)化為以青蒿素碳原子為中心的自由基和活性氧，雖然這兩種自由基都對(duì)瘧原蟲的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能具有損傷作用，但由于青蒿素轉(zhuǎn)化為碳自由基后活性更強(qiáng)，碳自由基發(fā)揮其烷基化的作用，使瘧蛋白烷基化，因此現(xiàn)認(rèn)為青蒿素通過碳自由基起活性作用的可能性更大[13-15]。

1.2 青蒿素對(duì)紅內(nèi)期瘧原蟲有直接殺滅作用 體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+不存在時(shí)，青蒿素類藥物同樣具有選擇性的高效抗瘧疾作用。Pandey等[16]在抑制Fe2+的活性的條件下對(duì)青蒿素類藥物的抗瘧活性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fe2+不存在時(shí)青蒿素類藥物的抗瘧作用效果沒有發(fā)生明顯變化，故認(rèn)為青蒿素類藥物殺滅紅內(nèi)期瘧原蟲的作用機(jī)制可能并不需要Fe2+。青蒿素選擇性殺滅處于紅內(nèi)期的瘧原蟲主要原理是影響其超微結(jié)構(gòu)，青蒿素的作用位點(diǎn)位于瘧原蟲的膜系結(jié)構(gòu)，起到影響表膜-線粒體的功能，阻斷宿主紅細(xì)胞為其提供的營(yíng)養(yǎng)，從而達(dá)到抗瘧的目的。青蒿素對(duì)瘧原蟲配子體具有殺滅作用，青蒿素類藥物能夠快速殺滅瘧原蟲早期配子體，抑制各時(shí)期配子體，并對(duì)未成熟配子體起到中斷其發(fā)育過程的作用。該類藥物對(duì)配子體的殺滅有利于控制瘧疾流行[17]。

1.3 抑制PfATP6酶的抗瘧作用 惡性瘧原蟲鈣ATP蛋白6（Plasmodium falciparumcalcium ATPase 6，PfATP6）是青蒿素及其衍生物作用靶點(diǎn)之一，許多學(xué)者認(rèn)為青蒿素可能通過作用于瘧原蟲的PfATP6酶而發(fā)揮抗瘧作用。PfATP6是惡性瘧原蟲基因組中唯一一類肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶（sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase，SERCA），它通過消耗ATP來調(diào)節(jié)瘧原蟲胞漿內(nèi)鈣離子濃度，保持鈣濃度的內(nèi)穩(wěn)狀態(tài)[18]。青蒿素及其衍生物對(duì)PfATP6具有強(qiáng)大且特異的抑制效果，通過抑制PfATP6，從而引發(fā)瘧原蟲胞漿內(nèi)Ca2+水平升高，細(xì)胞也隨之凋亡，從而起到抗瘧作用[19-20]。徐進(jìn)等[21]模擬出PfATP6酶的空間結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步證明青蒿素與PfATP酶結(jié)合在空間結(jié)構(gòu)上是可能的。Eckstein-Ludwig等[22]也通過熒光實(shí)驗(yàn)證明，青蒿素在不影響其他正常細(xì)胞Ca2+排出的情況下，通過阻斷瘧原蟲所在細(xì)胞PfATP6酶的活動(dòng)，引起細(xì)胞死亡，從而達(dá)到治療瘧疾的目的。

2 耐藥性產(chǎn)生機(jī)制

青蒿素及其衍生物作為高效速效的抗瘧藥，被大量、廣泛、連續(xù)應(yīng)用于臨床，致使惡性瘧原蟲對(duì)青蒿素的抗藥性正在快速產(chǎn)生，由于青蒿素類藥物有效血藥濃度的時(shí)間較短，當(dāng)用藥不規(guī)范，如療程（一般7 d）不足時(shí)，殺滅瘧原蟲不徹底，造成較高的治療瘧疾復(fù)發(fā)率[23-24]。長(zhǎng)期處于較低藥物壓力下，循環(huán)往復(fù)，最終可導(dǎo)致青蒿素耐藥性產(chǎn)生。這在實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)研究中都得到了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)室培育的約氏瘧原蟲和體外選育的惡性瘧原蟲對(duì)青蒿素及其衍生物產(chǎn)生抗性較為緩慢且不穩(wěn)定，以及對(duì)其抗性指數(shù)不高，如果去除藥物壓力，耐藥株就會(huì)恢復(fù)敏感性[25]。因此可以認(rèn)為瘧原蟲對(duì)青蒿素及其衍生物產(chǎn)生耐藥性是在藥物壓力下相應(yīng)基因表達(dá)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致作用靶點(diǎn)蛋白表達(dá)量改變的結(jié)果。endprint

通過遺傳學(xué)研究證實(shí)，電子傳遞鏈具有激活青蒿素的作用，青蒿素抗性的產(chǎn)生是通過電子傳遞鏈之間相互作用導(dǎo)致電勢(shì)下降從而抑制了線粒體的功能，并且產(chǎn)生的自由基進(jìn)一步破壞了線粒體，編碼線粒體NADH脫氫酶NDE1或NDI1的缺失會(huì)導(dǎo)致對(duì)青蒿素類產(chǎn)生抗性，反之過度表達(dá)則可以增加敏感性，因此電子傳遞的變化或環(huán)境因素的影響也可改變宿主對(duì)青蒿素的敏感性[26]。

翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP）可能是青蒿素類藥物抗瘧作用的靶點(diǎn)之一[9]。Walker等[27]在約氏瘧原蟲耐青蒿素蟲株中，未發(fā)現(xiàn)敏感株與抗性株TCTP基因序列有差異，但是抗性株TCTP蛋白表達(dá)量高于敏感株2.5倍。因此由于TCTP過度表達(dá)而產(chǎn)生的耐藥性可能與青蒿素類藥物的作用機(jī)制有關(guān)[28]。

Krishna等[29]從惡性瘧患者體內(nèi)分離出的蟲株對(duì)蒿甲醚的IC50值有所升高。通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)PfATP6的第769位的絲氨酸突變?yōu)樘於０罚⊿769N），通過PfATP6基因序列的置換突變出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。

大量研究顯示，瘧原蟲的某些遺傳突變對(duì)青蒿素及其衍生物的體外敏感性也有影響。如惡性瘧原蟲多藥抗性基因（Plasmodium falciparum multi-drug resistance gene sequence，簡(jiǎn)稱pfmdr1）、惡性瘧原蟲氯喹抗性性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Plasmodium falciparum chloroquine resistant transporter，簡(jiǎn)稱pfcrt）的基因序列與耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)，因此pfmdr1基因發(fā)生突變以及pfcrt基因的拷貝數(shù)增加都可能會(huì)導(dǎo)致膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的改變，從而使藥物外排增多，使其無法實(shí)施有效的抗瘧作用而產(chǎn)生耐藥性[30-31]。

Witkowski等[32]2010年提出了一個(gè)全新的理論假說：惡性瘧原蟲對(duì)青蒿素及其衍生物藥物壓力的反應(yīng)是在環(huán)狀體期形成細(xì)胞周期靜止/阻滯現(xiàn)象：經(jīng)過青蒿素培育的耐受株F32-ART能夠在初始藥物濃度7 000倍的藥壓下逃生，且未發(fā)現(xiàn)有上述基因突變或者高表達(dá)。這也正好解釋臨床治療中青蒿素療程不足時(shí)易高復(fù)燃的現(xiàn)象。

3 結(jié)語

青蒿素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用解決了過去傳統(tǒng)抗瘧藥物產(chǎn)生耐藥性的問題，但作為一種現(xiàn)在普遍使用的抗虐藥物，也面臨著產(chǎn)生耐藥性的危險(xiǎn)，在泰柬邊境地區(qū)已出現(xiàn)了青蒿素耐藥性的現(xiàn)象，并且體外藥物敏感性監(jiān)測(cè)檢測(cè)時(shí)也發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲野外分離株的敏感性有降低的現(xiàn)象[33-34]。而且在中國(guó)的云南、海南等瘧疾高發(fā)并應(yīng)用青蒿素類抗瘧藥較久的地區(qū)，惡性瘧原蟲的敏感性呈緩慢下降的趨勢(shì)[35]，因此查找并確定青蒿素類藥物耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制對(duì)防治瘧疾具有重要意義。由于尚無法明確其耐藥機(jī)制，為防止青蒿素類抗瘧藥產(chǎn)生的大規(guī)模耐藥性，目前針對(duì)遏制青蒿素類藥物產(chǎn)生抗性的對(duì)策是聯(lián)合用藥，現(xiàn)有的復(fù)方制劑主要為青蒿素或其衍生物與其他抗瘧藥物聯(lián)合用藥，如氯喹、萘酚喹、哌喹、甲氟喹等，這種聯(lián)合用藥的治療方法也可達(dá)到延緩耐藥性的產(chǎn)生，但要想完全控制其產(chǎn)生耐藥性還需要更進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Noedl H，Se Y，Schaecher K，et al.Evidence of artemisinin-resistant malaria in western Cambodia[J].N Engl J Med，2008，359（24）：2619-2620.

[2]譚濤，秦宗會(huì)，譚蓉.青蒿素類藥物的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥業(yè)，2009，18（3）：63-64.

[3] Yang H，Yang Y，Yang P，et al.Monitoring plasmodium falciparum chloroquine resistance in Yunnan Province，China，1981–2006[J].Acta Tropica，2008，108（1）：44-49.

[4] Wang J Y.Antimalarial mechanism of Qinghaosu and itsderivatives[J].Chin Tradit Herb Drugs，1994（25）：152-155.

[5] Chen Y，Zhu S M，Chen H Y.The progress in qinghaosu and its derivative as antimalaria s[J].Acta Pharm Sin，1998（33）：234-239.

[6] Kapetanaki S，Varotsis C.Ferryl-oxo heme intermediate in the antimalarial mode of action of artemisinin[J].FEBS Lett，2000，474（2）：238-241.

[7] Macreadie I，Ginsburg H，Sirawaraporn W，et al.Antimalarial drug development and new targets[J].Parasitol Today，2000，16（10）：438-444.

[8] Olliaro P L，Haynes R K，Meunier B，et al.Possible modes of action of the artemisinin-type compounds[J].Trends Parasitol，2001，17（3）：122-126.

[9] Meshnick S R.Artemisinin：mechanisms of action，resistance and toxicity[J].Int J Parasitol，2002，32（13）：1655-1660.endprint

[10]王安平，高琪，顧亞萍，等.用pfcrt點(diǎn)突變基因檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)惡性瘧原蟲氯喹抗藥性的初步研究[J].中國(guó)血吸蟲病防治雜志，2005，17（2）：120-123.

[11]翟自立，肖樹華.青蒿素類抗瘧藥的作用機(jī)制[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2001，19（3）：182-185.

[12] Krishna S，Bustamante L，Haynes R K，et al.Artemisinins：their growing importance in medicine[J].Trends Pharmacol Sci，2008，29（10）：520-527.

[13]李國(guó)棟.青蒿素類藥物的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，1998，33（7）：385-389.

[14] Taranto A G，de M Carneiro J W，de Oliveira F G，et al.The role of C-centered radicals on the mechanism of action of artemisinin[J].Journal of Molecular Structure：THEOCHEM，2002，580（1）：207-215.

[15] Selmeczi K，Robert A，Claparols C，et al.Alkylation of human hemoglobin A0 by the antimalarial drug artemisinin[J].FEBS lett，2004，556（1）：245-248.

[16] Pandey A V，Tekwani B L，Singh R L，et al.Artemisinin，an endoperoxide antimalarial，disrupts the hemoglobin catabolism and heme detoxification systems in malarial parasite[J].The Journal of Biological Chemistry，1999，274（27）：19383-19388.

[17]鄭全芳，楊志剛，孫紅祥，等.青蒿素及其衍生物藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸藥雜志，2006，40（1）：40-44.

[18] Tanabe K，Zakeri S，Palacpac N M Q，et al.Spontaneous mutations in the Plasmodium falciparum sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase （PfATP6） gene among geographically widespread parasite populations unexposed to artemisinin-based combination therapies[J].Antimicrob Agents Chemother，2011，55（1）：94-100.

[19]孫辰，李堅(jiān)，周兵.青蒿素類藥物的作用機(jī)制：一個(gè)長(zhǎng)久未決的基礎(chǔ)研究挑戰(zhàn)[J].中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)，2012，42（5）：345-354.

[20] Afonso A，Hunt P，Cheesman S，et al.Malaria parasites can develop stable resistance to artemisinin but lack mutations in candidate genes atp6 （encoding the sarcoplasmic and endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase），tctp，mdr1，and cg10[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2006，50（2）：480-489.

[21]徐進(jìn)，鄭瑩.青蒿素類藥物作用機(jī)制的探討[J].藥學(xué)進(jìn)展，2002，26（5）：274-278.

[22] Eckstein-Ludwig U，Webb R J，Van Goethem I D A，et al.Artemisinins target the SERCA of plasmodium falciparum[J].Nature，2003，424（6951）：957-961.

[23] Teuscher F，Gatton M L，Chen N，et al.Artemisinin-induced dormancy in Plasmodium falciparum：duration，recovery rates，and implications in treatment failure[J].Infect Dis，2010，202（9）：1362-1368.

[24]楊亞明，李雪平，張蒼林，等.云南省抗氯喹惡性瘧原蟲雙氫青蒿素抗性株體外培育與單克隆品系的建立[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2013，8（8）：714-717.

[25]剌德全，荊瑞君，張春勇，等.我國(guó)惡性瘧原蟲對(duì)抗瘧藥敏感性的現(xiàn)狀[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1996，14（1）：37.

[26] Li W，Mo W，Shen D，et al.Yeast model uncovers dual roles of mitochondria in the action of artemisinin[J].PLoS Genet，2005，1（3）：36.

[27] Walker D J，Pitsch J L，Peng M M，et al.Mechanisms of artemisinin resistance in the rodent malaria pathogen Plasmodium yoelii[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2000，44（2）：344-347.endprint

[28]楊恒林，高白荷.惡性瘧原蟲FCC1/HN株對(duì)青蒿琥酯，咯萘啶等藥的體外敏感性[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2002，20（2）：118.

[29] Krishna S，Woodrow C J，Staines H M，et al.Re-evaluation of how artemisinins work in light of emerging evidence of in vitro resistance[J].Trends in Molecular Medicine，2006，12（5）：200-205.

[30] Jung M，Kim H，Nam K Y，et al.Three-dimensional structure of Plasmodium falciparum Ca2+-ATPase （PfATP6） and docking of artemisinin derivatives to PfATP6[J].Bioorg Med Chem Lett，2005，15（12）：2994-2997.

[31] Reed M B，Saliba K J，Caruana S R，et al.Pgh1 modulates sensitivity and resistance to multiple antimalarials in plasmodium falciparum[J].Nature，2000，403（6772）：906-909.

[32] Witkowski B，Lelièvre J，Barragán M J L，et al.Increased tolerance to artemisinin in plasmodium falciparum is mediated by a quiescence mechanism[J].Antimicrob Agents Chemother，2010，54（5）：1872-1877.

[33]楊恒林.東南亞某些地區(qū)惡性瘧原蟲對(duì)青蒿素類藥物的敏感性監(jiān)測(cè)與臨床研究[J].中國(guó)寄生蟲病防治雜志，1997，10（1）：55-57.

[34]楊恒林，劉德全，黃開國(guó).云南省惡性瘧原蟲對(duì)青蒿素類藥物及云南省惡性瘧原蟲對(duì)青蒿素類藥物及咯萘啶與氯喹敏感性的體外測(cè)定[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1997，15（5）：292-296.

[35]楊恒林，李春富，楊亞明，等.云南東南部地區(qū)惡性瘧原蟲對(duì)氯喹敏感性縱向觀察[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2009，3（12）：917-919.

（收稿日期：2014-01-14） （本文編輯：歐麗）endprint