花生長(zhǎng)鏈?；o酶A合成酶6基因(LACS6)的克隆、鑒定與組織表達(dá)

徐日榮，陳湘瑜，唐兆秀*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,福建 福州 350013; 2.國(guó)家農(nóng)業(yè)部閩臺(tái)農(nóng)作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350013)

花生長(zhǎng)鏈?；o酶A合成酶6基因(LACS6)的克隆、鑒定與組織表達(dá)

徐日榮1,2，陳湘瑜1,2，唐兆秀1,2*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,福建 福州 350013; 2.國(guó)家農(nóng)業(yè)部閩臺(tái)農(nóng)作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350013)

長(zhǎng)鏈?；o酶A合成酶(long chain acyl-CoA synthetase：LACS)是油脂代謝的重要催化酶。為揭示花生脂肪酸代謝機(jī)理，采用RT-PCR技術(shù)，首次從花生ArachishypogaeaL.克隆到LACS6(GenBank登錄號(hào)：KU301860)，分析該基因的結(jié)構(gòu)組成，預(yù)測(cè)編碼氨基酸與其他植物的同源性，采用Real-Time PCR技術(shù)對(duì)LACS6的組織表達(dá)進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，花生LACS6基因全長(zhǎng)2 116 bp，包含2 088 bp的ORF，編碼695個(gè)氨基酸，有23個(gè)外顯子和22個(gè)內(nèi)含子。氨基酸序列比對(duì)顯示花生LACS6有真核生物?；o酶A合成酶保守結(jié)構(gòu)域，并含有保守的激活位點(diǎn)和綁定位點(diǎn)。同源性分析發(fā)現(xiàn)花生LACS6與鷹嘴豆、綠豆、大豆、梅等13種物種的氨基酸一致性在79%～87%，進(jìn)化樹分析顯示，花生LACS6與鷹嘴豆等豆科植物親緣較近。實(shí)時(shí)熒光PCR分析表明，花生LACS6在花生根、莖、葉、子房柄、仁和花等組織均有表達(dá)，且差異明顯。子房柄和花的表達(dá)量極高，與根、莖、葉和仁等組織有極顯著差異，花生LACS6組織的表達(dá)量大小排序?yàn)榛?子房柄>葉>仁>莖>根。本研究結(jié)果為揭示花生脂肪酸代謝和品質(zhì)改良提供理論依據(jù)。

花生；長(zhǎng)鏈?；o酶A合成酶；組織表達(dá)；油脂

花生是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的油料與經(jīng)濟(jì)作物，是重要的油脂和蛋白質(zhì)來(lái)源[1]。中國(guó)是世界花生的主產(chǎn)國(guó)之一，根據(jù)中國(guó)統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，2014年中國(guó)花生種植面積為460.39萬(wàn)hm2，總產(chǎn)1 648.17萬(wàn)t?；ㄉ舅崾鞘秤弥参镉偷闹匾獊?lái)源，有學(xué)者研究認(rèn)為，花生原料含油量每提高1個(gè)百分點(diǎn)相當(dāng)于產(chǎn)量提高2個(gè)百分點(diǎn)，加工企業(yè)的效益可提高7個(gè)百分點(diǎn)以上[2]。因此，揭示花生脂肪酸代謝機(jī)理，提高花生品種含油量，對(duì)增加單位面積油產(chǎn)量、提高企業(yè)效益具有重要意義。

油料作物種子中的油脂即三?；视?triacylglycerol: TAG)[3]，在TAG的合成和降解代謝中，長(zhǎng)鏈?；o酶 A合成酶(long chain acyl-CoA synthetase: LACS)都起著重要的作用。TAG的合成底物脂肪酰輔酶A是由LACS催化脂肪酸和輔酶A而成的，TAG分解成的脂肪酸必須由LACS催化后形成脂肪?；o酶A后才能進(jìn)入β-氧化途徑，脂肪酸最終降解成乙酰輔酶 A的形式供給幼苗的生長(zhǎng)[4]。

在植物中，LACS基因的研究率先在模式植物擬南芥中開展，2002年已經(jīng)證實(shí)有9個(gè)LACS基因存在，大多數(shù)LACS酶與脂肪酸組成的結(jié)構(gòu)和存儲(chǔ)脂肪具有高的活性[5]。AtLACS1和AtLACS2可能參與角質(zhì)和蠟的合成[6-7]，AtLACS1、AtLACS2和AtLACS3在酵母中可以促進(jìn)脂肪酸的攝取[8]，AtLACS1和AtLACS4共同參與花粉外壁的形成[9]，AtLACS6和AtLACS7編碼氧化物酶體LACS蛋白并與脂肪酸β-oxidation[10-11]，AtLACS9是一個(gè)葉綠體蛋白,和AtLACS1參與種子油的生物合成[12-13]。從油菜克隆了BnACS6基因，在脂肪合成的組織中高度表達(dá)，可能參與了脂質(zhì)合成[14]。從大豆的過(guò)氧酶體中分離到GmACSL2基因，顯示參與脂肪酸和脂質(zhì)的降解[15]。從棉花分離到GhACS1，是早期花粉發(fā)育的重要基因[16]。此外, LACS酶存在于蓖麻[17]、向日葵[18]、山羊草[19]和小麥[20]。

本研究對(duì)花生LACS6基因進(jìn)行cDNA克隆及序列分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)花生根、莖、葉、子房柄、仁和花不同組織的表達(dá)情況，為深入研究LACS6基因的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料與樣品采集 供試材料為福花8號(hào)，以幼苗期健康的葉片作為L(zhǎng)ACS6基因克隆的材料，在花生下針40 d，采取植株根、莖、葉、子房柄、仁和花等組織，作為L(zhǎng)ACS6基因組織表達(dá)的研究材料，材料采集后放入液氮罐轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑與儀器TaqDNA聚合酶、pMD18-T vector、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit)均購(gòu)自TaKaRa公司(大連)，熒光定量PCR試劑TransStart Top Green qPCR SuperMix購(gòu)于全式金公司，其他生化試劑購(gòu)于鼎國(guó)生物公司。ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀(ABI公司,德國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 按熊發(fā)前等[21]的CTAB方法提取花生各個(gè)組織的總RNA。由Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.2.2 花生LACS6基因的克隆 以GenBank大豆LACS6 mRNA (登錄號(hào): XM_004496693)為探針，搜索并拼接數(shù)據(jù)庫(kù)中花生的EST序列，用primer軟件設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物AhLACS6-F(AGC TTT CGC GTT AAT GGA TT)和AhLACS6-R(ATA GGG CCT TCA GCA TCA CA)。采用CTAB法提取花生幼苗葉片的總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL，其中cDNA模板1 μL、10×TaqBuffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、10 mmol·L-1正反引物各0.5 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL、ddH2O 18 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)后，選擇與預(yù)測(cè)大小一致的目的條帶切膠回收并連接載體pMD19-T，經(jīng)熱擊轉(zhuǎn)化、擴(kuò)大培養(yǎng)、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒PCR鑒定，選擇陽(yáng)性質(zhì)粒，送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 花生LACS6的鑒定 根據(jù)測(cè)序獲得的核苷酸序列預(yù)測(cè)編碼氨基酸，利用NCBI blastp和CCD在線程序分析該氨基酸序列與其他物種LACS6的相似性及功能結(jié)構(gòu)域，下載大豆、綠豆和鷹嘴豆等13個(gè)物種的氨基酸序列，用Clustalx2、Genedoc和Mega6.0軟件對(duì)AhLACS6與其他物種進(jìn)行蛋白同源性和進(jìn)化樹分析。

1.2.4 花生LACS6的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 根據(jù)獲得花生LACS6基因序列重新設(shè)計(jì)表達(dá)引物RT- AhLACS6-F(TTT GGT GGG CTA AAG GGC TGA AGA TTA CTG) 和RT- AhLACS6-R(ACG ACT AAT TGT GGT AGT TGG AGG CAT TGA)，以‘福花8號(hào)’下針40 d的葉片、莖、花、子房柄、仁和根cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以內(nèi)參基因ACTIN(RT-ACTIN-F: GTC ATC GTC ATC CTC TTC TC, RT- ACTIN-R: CAT TCC TGT TCC ATT GTC AC)為對(duì)照，分析花生LACS6基因在植株各部位的表達(dá)情況。反應(yīng)體系總體積為25 L，包括12.5 μL TransStart Top Green qPCR SuperMix，1 μL cDNA，正反向引物各0.5 μL(濃度為10 μmol·L-1)，10.5 μL蒸餾水。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生LACS6基因的克隆

2.1.1 序列拼接 以大豆登錄號(hào): XM_004496693的LACS6 mRNA為電子探針，利用NCBI blastn在線工具，搜索出2個(gè)花生的EST序列，登錄號(hào)分別為：JK157315.1和ES759871.1，他們與大豆的LACS6一致性在83%和90%。用ES759871.1繼續(xù)查詢花生EST文庫(kù)，獲得100%一致性的ES723932序列，2條EST拼接成1 159 bp的3端，長(zhǎng)度為520 bp的JK157315.1序列查詢沒有獲得其他花生EST序列，利用兩端獲得的并拼接的片段設(shè)計(jì)引物，克隆花生LACS6基因。

2.1.2 基因的克隆 利用CTAB法提取健康的花生葉片總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此為基因克隆模板，用設(shè)計(jì)的引物AhLACS6-F和AhLACS6-R PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在DNA Marker 2 000 bp上面有1條明亮的條帶(圖1)，與預(yù)測(cè)的大小一致。經(jīng)切膠回收后，連接T載體，熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒電泳后，選取陽(yáng)性克隆測(cè)序。鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司的測(cè)序結(jié)果表明，目的片段的長(zhǎng)度為2 116 bp，經(jīng)過(guò)NCBI網(wǎng)址BLAST比對(duì)，該序列與大豆Glycinemax、鷹嘴豆Cicerarietinum和綠豆Vignaradiatavar. radiata等植物的LACS6 基因有很高的同源性，確認(rèn)為花生的LACS6基因，命名為AhLACS6(Arachis hypogaea long chain acyl-CoA synthetase)。

2.1.3 序列分析 根據(jù)DNASTAR軟件分析，AhLACS6序列包括13 bp的5′UTR區(qū)、15 bp的3′UTR區(qū)以及2 088 bp的完整CDS區(qū)，預(yù)測(cè)編碼695個(gè)氨基酸(圖2)，該氨基酸分子量為76.5 kD，理論等電點(diǎn)為7.13?；ㄉ蚪M比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因與Arachisipaensis第9和第5染色體分別有68.2%和66.24%的相似性，與Arachisduranensis第5和第9染色體分別有96.36%和62.50%的相似性，該結(jié)果顯示AhLACS6是單拷貝基因，可能存在同源基因。AhLACS6具體分布在Arachisduranensis第5染色體19030831～19036754區(qū)域，總共有5 923 bp，含有23個(gè)外顯子和22個(gè)內(nèi)含子(圖3)?；蛟撔蛄幸烟峤坏紾enBank，登錄號(hào)為：KU301860。

2.2 花生AhLACS6基因的鑒定

2.2.1 花生AhLACS6的功能結(jié)構(gòu)域分析 花生AhLACS6基因編碼695個(gè)氨基酸，利用NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(Conserved Domain Database，CDD)分析預(yù)測(cè)，花生LACS6的含有1個(gè)真核生物?；o酶A合成酶保守結(jié)構(gòu)域(Eukaryotic long-chain fatty acid CoA synthetase :LC-FACS)，序列上包含保守的激活位點(diǎn)和綁定位點(diǎn)，該結(jié)構(gòu)域?qū)儆贏FD_class_I超級(jí)家族。在花生AhLACS6 261～272的氨基酸序列具有 [LIVMFY]-X-X-[STG]-[STAG]-G-[ST]-[STEI]-[SG]-X-[PASLIVM]-[KR]12個(gè)酰基激活酶(acyl-activating enzyme：AAE)高度保守序列，具體為ICYTSGTTGTPK氨基酸序列(圖4下劃線部分)。

2.2.2AhLACS6基因同源性分析 通過(guò)NCBI的blastp在線搜索，利用ClustalX2軟件將花生與其他物種的LACS6氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，鷹嘴豆、綠豆、大豆、梅、葡萄、蓖麻、白梨蘋果、棗、野草莓、楊、黃瓜和歐洲油菜等13種物種與花生AhLACS6氨基酸序列一致性在79%～87%(表1)，其中與鷹嘴豆、綠豆和大豆等豆科植物一致性在86%以上。用GeneDoc軟件形成多重比較，LACS6氨基酸序列整體同源性較高，在對(duì)比方陣第0～35、91～98和695～703氨基酸殘基有較大差異(圖4)。用Mega6.0繪制進(jìn)化樹顯示，花生和鷹嘴豆、綠豆和大豆等豆科植物處在一個(gè)分支上，它們的遺傳距離較近(圖5)。

表1 AhLACS6與其他植物L(fēng)ACS6的一致性Table 1 Homology of AhLACS6 gene and other plant LACS6 genes

2.3 AhLACS6基因花生組織的表達(dá)

利用定量PCR技術(shù)分析AhLACS6基因花生不同組織的表達(dá)，以各部位內(nèi)參基因ACTIN為對(duì)照，設(shè)定莖的相對(duì)表達(dá)為1.00，結(jié)果表明在花生根、莖、葉、子房柄、仁和花組織均有檢測(cè)到AhLACS6的表達(dá)，但不同部位表達(dá)差異明顯(圖6)。在根有輕微表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量分別為0.21，莖部表達(dá)有所增加，仁和葉片表達(dá)明顯，相對(duì)表達(dá)量分別為2.60和4.74，前4個(gè)組織相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異，子房柄和花的表達(dá)量極高，相對(duì)表達(dá)量分別為30.49和53.21，它們與根、莖、葉和仁等組織的表達(dá)量有極顯著差異。AhLACS6在花生組織表達(dá)量大小排序?yàn)榛?子房柄>葉>仁>莖>根。

3 討 論

長(zhǎng)鏈酰基輔酶 A合成酶(LACS)在TAG的合成和降解代謝中起著重要的作用。本研究首次從花生克隆獲得AhLACS6基因，該基因cDNA全長(zhǎng)2 116 bp，包含2 088 bp的完整開放閱讀框，編碼695個(gè)氨基酸，含有1個(gè)真核生物?；o酶A合成酶(LC-FACS)保守結(jié)構(gòu)域，并有[LIVMFY]-X-X-[STG]-[STAG]-G-[ST]-[STEI]-[SG]-X-[PASLIVM]-[KR]12個(gè)?；せ蠲?acyl-activating enzyme：AAE)保守序列[22-24]。AhLACS6氨基酸與GenBank登錄的鷹嘴豆(GenBank登錄號(hào)：XP_004495889.1)、綠豆(GenBank登錄號(hào)：XP_014514389.1)、大豆(GenBank登錄號(hào)：XP_003518711.1)、梅(GenBank登錄號(hào)：XP_008222945.1)、葡萄(GenBank登錄號(hào)：XP_002277936.1)、蓖麻(GenBank登錄號(hào)：NP_001310618.1) 、白梨(GenBank登錄號(hào)：XP_009364219.1) 、蘋果(GenBank登錄號(hào)：XP_008390867.1) 、棗(GenBank登錄號(hào)：XP_015888035.1) 、野草莓(GenBank登錄號(hào)：XP_004296905.1) 、楊(GenBank登錄號(hào)：XP_002315784.2) 、黃瓜(GenBank登錄號(hào)：XP_004134142.1)和歐洲油菜(GenBank登錄號(hào)：XP_013735920.1)等預(yù)測(cè)的693～703個(gè)氨基酸極其相近，氨基酸序列同源性的多重分析也顯示與這些物種具有很高的保守性，進(jìn)化樹分析顯示了與豆科植物L(fēng)ACS6有較好的親緣關(guān)系，這些結(jié)果很好地表明本研究成功克隆到花生的AhLACS6基因。

AhLACS6的組織表達(dá)量大小排序?yàn)榛?子房柄>葉>仁>莖>根，與擬南芥的組織表達(dá)類似[5]，LACS6在擬南芥中表達(dá)順序?yàn)榛?葉>莖>根>發(fā)育種子，但在發(fā)育的種子中，擬南芥LACS6表達(dá)量很低，這可能與種子的含油量有關(guān)。

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(責(zé)任編輯：柯文輝)

Cloning, Verification and Tissue Expression of Long-chain Acyl-CoA Synthetase 6 (LACS6) Gene in Peanut (ArachishypogaeaL.)

XU Ri-rong1,2, CHEN Xiang-yu1,2, TANG Zhao-xiu1,2*

(1.InstituteofCropSciences,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013,China; 2.KeyLaboratoryofCropGermplasmUtilizationbetweenFujianandTaiwan,MinistryofAgriculture,Fuzhou,Fujian350013,China)

Long-chain acyl coenzyme A synthetase (LACS) is one of the important catalytic lipid metabolic enzymes in peanut plants. To understand the mechanism of the fatty acid metabolism in peanut (ArachishypogaeaL.), the cDNA ofLACS6 gene was cloned by RT-PCR (GenBank accession number: KU301860). Its structure was analyzed, homology with other plants compared, and mRNA expression in different tissues obtained using real-time PCR. The results showed that the cDNA was 2,116 bp including an open reading frame of 2,088 bp, encoded 695 amino acids, and had 23 exons and 22 introns. Its amino acid sequence alignment showed a conserved domain of eukaryotic long-chain fatty acid CoA synthetase, as well as conserved activation and binding sites. The homologies ofLACS6 gene with the genes fromCicerarietinum,Vignaradiate,Glycinemax,Prunusmumeand others were between 79% and 87%. The evolutionary tree indicated that the gene was close to those from leguminous plants, such as chickpeas. The real-time PCR analysis showed that it was differentially expressed in the ovary stalks, roots, stems, leaves, flowers and kernels on a peanut plant. The ovary stalks and flowers had the highest expression among all,and with significant differences,The order of expression ranked as flowers>ovary stalks>leaves>kernels>stems>roots. The information obtained would benefit further studies on the fatty acid metabolism and quality improvement for peanut.

peanut (ArachishypogaeaL.); long-chain acyl CoA synthetase; tissue expression; lipid

2016-05-12初稿；2016-09-19修改稿

徐日榮(1979-)，男，碩士，副研究員，研究方向：花生遺傳育種(E-mail：rirongxu@163.com) *通訊作者：唐兆秀(1958-)，男，研究員，研究方向：花生遺傳育種(E-mail：tzxfz@163.com)

福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目——省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2014R1026-4)

S 565.2

：A

：1008-0384(2016)11-1164-07

徐日榮，陳湘瑜，唐兆秀.花生長(zhǎng)鏈酰基輔酶A合成酶6基因(LACS6)的克隆、鑒定與組織表達(dá)[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31(11)：1164-1170.

XU R-R，CHEN X-Y，TANG Z-X.Cloning, Verification and Tissue Expression of Long-chain Acyl-CoA Synthetase 6 (LACS6) Gene in Peanut (ArachishypogaeaL.)[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1164-1170.