木霉菌對番茄灰霉病菌的抑制作用

甘 林，代玉立，楊秀娟，石妞妞，阮宏椿，杜宜新，陳福如*

(1.福建省農業(yè)科學院植物保護研究所，福建 福州 350013；2.福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點實驗室，福建 福州 350003)

木霉菌對番茄灰霉病菌的抑制作用

甘 林1,2，代玉立1,2，楊秀娟1,2，石妞妞1,2，阮宏椿1,2，杜宜新1,2，陳福如1,2*

(1.福建省農業(yè)科學院植物保護研究所，福建 福州 350013；2.福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點實驗室，福建 福州 350003)

為明確木霉菌對福建省番茄灰霉病菌的抑制效果，研究了8株木霉菌對病原菌的拮抗作用。結果表明，在對峙培養(yǎng)條件下，供試木霉菌能顯著抑制灰霉病菌菌絲生長，其抑制率為86.83%～91.39%，不同木霉菌株的發(fā)酵液對病原菌菌絲生長具有不同程度的抑制效果，其差異達顯著水平。其中，菌株FJ2006-8發(fā)酵液的抑制生長率最高，為39.44%。此外，供試的木霉菌均能產(chǎn)生非揮發(fā)性和揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，其中，菌株FJ2006-8的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌菌絲生長的抑制效果最佳，抑制率為61.09%；而菌株T05-58的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌菌絲生長的抑制率最高，為22.95%。研究結果可為木霉菌生防菌劑的開發(fā)以及番茄灰霉病的綠色防控提供理論依據(jù)。

木霉菌；番茄灰霉病菌；拮抗作用；代謝產(chǎn)物

番茄是福建省設施栽培中主要蔬菜品種之一，在生產(chǎn)中侵染番茄的病蟲害種類繁多，其中以番茄灰霉病對番茄的生產(chǎn)為害尤為嚴重。該病害由灰葡萄孢菌Botrytiscinerea引起，主要為害番茄的莖、葉、花及果實，其中以為害幼果為主，常造成爛果。由于設施大棚較大田可保持較高的空氣相對濕度和溫度，因此，灰霉病的發(fā)生也日趨嚴重，在一般的年份平均葉發(fā)病率可達15%，造成的經(jīng)濟損失在40%左右[1]。目前生產(chǎn)上尚未有抗病的番茄品種，主要還是依靠化學殺菌劑進行病害的防治，常用的殺菌劑有異菌脲、啶酰菌胺、嘧霉胺、啶菌嗯唑等[2]。然而，由于灰霉病菌在種群上存在變異性，長期大量施用單一的殺菌劑不可避免地使得病原菌產(chǎn)生抗藥性。此外，殺菌劑劑量的加大也帶來了環(huán)境污染和對人類健康危害等問題，而生物防治因其具有高效、低毒、安全等特性，作為一項植物病害防治的重要措施已逐漸引起人們的高度重視。近年來，利用拮抗微生物及其生防菌劑進行灰霉病的防治已成為一項可持續(xù)的防治措施，從健康土壤和番茄果實上分離篩選到的真菌、細菌和放線菌及其代謝產(chǎn)物對番茄灰霉病菌均表現(xiàn)出較好的拮抗效果和防治作用[3-6]。

木霉菌Trichodermaspp.是自然界中普遍存在的，目前研究最多、應用最廣泛的生防菌，可拮抗18個屬20余種植物病原真菌[7]。主要通過重寄生、分泌胞外降解酶，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物等一系列拮抗作用，有效抑制病原菌的生長，特別對疫霉病菌、黑星病菌、灰霉病菌等具有較強的拮抗作用[8-9]。目前，生產(chǎn)上登記銷售、應用的木霉菌生防菌劑較多，然而關于木霉菌對灰霉病菌的拮抗作用和生防機理相關報道還較少[10-11]。本課題組前期利用實驗室保存的47株木霉菌完成了對番茄灰霉病菌生防菌的初步篩選，獲得了8株拮抗活性較好的木霉菌。本研究以此為基礎，進一步分析、探明篩選出的木霉菌對灰霉病菌的抑制效果和作用機理，以期為木霉菌菌劑的研發(fā)與應用以及番茄灰霉病的綠色防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試病原菌為番茄灰霉病菌B.cinerea，由福建省農業(yè)科學院植物保護研究所分離自福清市番茄溫室大棚中采集的病果，經(jīng)分類鑒定，用柯赫氏法則驗證其致病性；8株木霉菌由本課題組分離，-20℃濾紙片保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 平皿對峙培養(yǎng) 參照劉波微等[12]的方法。將供試番茄灰霉病菌和木霉菌分別接種于馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基中，(28±1)℃，黑暗培養(yǎng)4 d后，用5 mm打孔器分別打取灰霉病菌和木霉菌邊緣菌絲體菌餅，在直徑為90 mm的平板一側接種病原菌，另一側接種木霉菌，兩者間距離約60 mm，同時以只接種病原菌為空白對照，每個處理4次重復，接種后置于(25±1)℃，黑暗培養(yǎng)。每隔6 h分別測量病原菌和木霉菌菌落生長半徑，統(tǒng)計各自的增長速率，計算供試木霉菌對灰霉病菌生長的抑制率。此外，分別于42 、144 h后在平板和顯微鏡上觀察木霉菌對病原菌菌絲生長的抑制情況。

菌絲增長速率=Σ(供試菌每6 h菌絲生長半徑差)/7

1.2.2 木霉菌發(fā)酵液對病原菌菌絲生長的抑制作用測定 發(fā)酵液的制備參考甘林等[13]的方法。將培養(yǎng)4 d的木霉菌菌餅接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基裝量為每250 mL三角瓶100 mL)，(28±1)℃、150 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)4 d后，離心10 min，吸取上清液經(jīng)細菌過濾器真空過濾后置于4℃冰箱中，備用。

將10 mL木霉菌發(fā)酵液與10 mL PDA培養(yǎng)基混勻，凝固后制成含發(fā)酵液平板，備用。將供試的番茄灰霉病菌接種于PDA培養(yǎng)基中，(28±1)℃，黑暗培養(yǎng)4 d后，使用5 mm打孔器打取病原菌邊緣菌絲體菌餅，接種于發(fā)酵液平板中央，同時設置空白的PDA培養(yǎng)基平板作為對照，每組4次重復。(25±1)℃，黑暗培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測量并計算病原菌菌落平均直徑和抑制率。

抑菌率/%=[(對照菌落直徑一處理的菌落直徑)/對照菌落直徑]×100%

1.2.3 木霉菌代謝產(chǎn)物對病原菌菌絲生長的拮抗活性測定 非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑菌作用測定參考梁巧蘭等[14]的方法。平鋪雙層無菌玻璃紙于PDA平板上，中央接種已培養(yǎng)4 d、直徑為5 mm的木霉菌菌絲體菌餅，(28±1)℃，黑暗培養(yǎng)，待木霉菌菌絲長滿玻璃紙前，用鑷子移除表面的玻璃紙，在平板中央接種已培養(yǎng)好4 d，直徑為5 mm的病原菌菌餅，同時設置在不接種木霉菌的PDA平板上接種病原菌為空白對照，每組4次重復。(25±1)℃，黑暗培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測量病原菌菌落擴展直徑，并計算抑菌率，計算方法同1.2.2。

揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌活性測定參考鐘小燕等[15]的方法。采用平皿對扣培養(yǎng)法，在2個PDA平板中央分別接種已培養(yǎng)4 d、直徑為5 mm的灰霉病菌和木霉菌菌絲體菌餅，然后將2個平板的皿口相互對扣，用封口膜密封，其中接種木霉菌的平皿在下，接種病原菌的平皿在上，同時設置只接種病原菌，不接種木霉菌為空白對照，每組4次重復。(25±1)℃，黑暗培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測量病原菌菌落擴展直徑，抑菌率計算方法同1.2.2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003、DPS軟件處理工作平臺進行統(tǒng)計和分析，采用Duncan氏新復極差法分析不同處理間差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 平皿對峙培養(yǎng)對病原菌菌絲生長的抑制作用

供試木霉菌與灰霉病菌的對峙試驗結果如表1所示，8株木霉菌的菌絲總體平均生長速度要明顯快于病原菌。與對照相比，對峙培養(yǎng)42 h后，木霉菌對灰霉病菌菌絲生長速度抑制率均在80%以上，且供試木霉菌與病原菌之間未發(fā)現(xiàn)有明顯的抑制帶(圖1-A)。之后木霉菌繼續(xù)生長，并與病原菌菌絲發(fā)生接觸，抑制病原菌的生長，144 h后木霉菌包圍整個病原菌，布滿整個培養(yǎng)皿，并在病原菌菌落上產(chǎn)生大量的孢子堆(圖1-C)。顯微觀察可見，在木霉菌與病原菌接觸處，木霉菌通過纏繞、緊貼等方式重寄生于病原菌之上，而病原菌菌落邊緣的菌絲顏色也逐漸變淺，菌絲變形、變薄，甚至停止生長(圖1-D)。

表1 平皿對峙下木霉菌對病原菌菌絲生長的抑制活性Table 1 Inhibition activity of Trichoderma spp. on B. cinerea in confrontation culture

2.2 木霉菌發(fā)酵液對病原菌菌絲生長的抑制作用

供試的木霉菌發(fā)酵液對番茄灰霉病菌菌絲生長表現(xiàn)出一定的抑制活性，對病原菌菌絲生長抑制率為10.36%～39.44%，各菌株間的抑制率差異達顯著水平(表2)。其中，菌株FJ2006-8發(fā)酵液的抑制率最高，為39.44%，而菌株FJ2007-2的抑菌率最低，為10.36%。

表2 木霉菌發(fā)酵液對病原菌菌絲生長的抑制活性Table 2 Inhibition activity of fermentation broths of Trichoderma spp. on B. cinerea

2.3 木霉菌非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌菌絲生長的抑制作用

在平板對峙培養(yǎng)和發(fā)酵液抗生作用的試驗結果基礎上，進一步研究供試木霉菌對病原菌的作用機理。非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌試驗結果(表3)表明，8株木霉菌均能產(chǎn)生抑制番茄灰霉病菌生長的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。方差分析表明不同菌株間的抑菌強弱存在顯著性差異。其中，菌株FJ2006-8對病原菌的抑制效果最佳，抑制率為61.09%，而菌株T05-48的抑制效果較差，抑制率為52.09%。

表3 木霉菌非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌菌絲生長的抑制活性

Table 3 Inhibition activity of non-volatile metabolites produced byTrichodermaspp. onB.cinerea

木霉菌菌株編號抑制率/%木霉菌菌株編號抑制率/%FJ2007?35273±123CcdFJ2006?86109±162AaFJ2010?515450±185BCbcdFJ2007?25563±129BCbcT05?585338±123BCcdC1?15691±074BbT05?495305±166CcdT05?485209±064Cd

2.4 木霉菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌菌絲生長的抑制作用

從表4可以看出，供試木霉菌可通過釋放揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌菌絲生長產(chǎn)生一定的抑制作用，但總體抑菌效果不高。接菌處理后7 d，菌株T05-58對灰霉病菌菌絲生長抑制率最高，為22.95%，而菌株C1-1的抑制率最低，僅為3.16%。此外，通過后期平板觀察病原菌菌絲生長情況發(fā)現(xiàn)，與對照相比，在揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的作用下，其菌落邊緣菌絲表現(xiàn)為稀薄。

表4 木霉菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌菌絲生長的抑制活性Table 4 Inhibition activity of volatile metabolites produced by Trichoderma spp. on B. cinerea

3 討論與結論

番茄灰霉病是設施大棚栽培過程中最易發(fā)生的重要病害之一。近年來，隨著保護地番茄種植面積的不斷擴大，大量種植高產(chǎn)、單一的番茄感病品種也給田間灰霉病菌的積累提供了有利的小環(huán)境，病害為害的程度也在逐年的加重[12]。由于生產(chǎn)上還未有抗病品種，而化學藥劑防治高效，大多數(shù)菜農在防治番茄灰霉病時常選擇使用化學藥劑。然而，隨著逐年施藥劑量、次數(shù)地不斷增加，灰霉病菌對常規(guī)殺菌劑的抗藥性也在逐漸增大，目前生產(chǎn)上已出現(xiàn)了病原菌對灰霉病防治的特效藥嘧霉胺抗性的菌株[16]。因此，開發(fā)新型、作用機理獨特且對人畜和生態(tài)環(huán)境無害的生防菌劑成為目前農藥開發(fā)的一個重要領域[17]，利用生物防治作為病害防治的一項重要措施也引起人們的高度重視。

木霉菌是一種應用較廣的生防菌，其主要的作用機制包括競爭作用、重寄生作用、抗生作用、誘導抗性及協(xié)同拮抗作用[18]。本研究通過平板對峙試驗發(fā)現(xiàn)，供試的8株木霉菌生長速度明顯快于病原菌，灰霉病菌菌絲生長抑制率為86.83%～91.39%。木霉菌與病原菌在產(chǎn)生營養(yǎng)或空間競爭的同時，也抑制了病原菌菌絲的擴展。此外，Inbar等[19]曾發(fā)現(xiàn)木霉菌能夠通過產(chǎn)生帶有凝集素的尼龍纖維識別、接觸并纏繞病原菌，證實了凝集素是其進行識別靶標真菌的外源信號。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，供試木霉菌的菌絲也可纏繞于病原菌菌絲之上形成重寄生，有的木霉菌還會產(chǎn)生分枝吸附在病原菌菌絲表面從而影響、破壞其生長，而接觸木霉菌的灰霉病菌菌絲也會發(fā)生畸形，最終病原菌被木霉菌所覆蓋，表面并伴有綠色孢子堆的產(chǎn)生。試驗結果與前人的報道相符[20]。然而僅通過平板對峙培養(yǎng)只能篩選獲得拮抗作用較好木霉菌，其在田間實際的防治效果還有待進一步研究。

木霉菌除了競爭作用和重寄生作用外，產(chǎn)生各種次生代謝物質對病原菌的抗生作用也是其重要的作用機理。目前，已報道有超過140種的木霉菌可產(chǎn)生抗生性的代謝產(chǎn)物，而這些代謝產(chǎn)物主要包括聚酮類、氨基酸及其衍生物、萜烯類等[21]。通過抑菌試驗結果表明，8株木霉菌發(fā)酵液對灰霉病菌均具有一定的拮抗活性，不同菌株之間的抑菌率存在顯著差異。然而，各木霉菌菌株發(fā)酵液對病原菌的抑制率總體水平不高，有報道稱，發(fā)酵液在除菌制備過程中一些具有抗菌活性的大分子物質可能因細菌過濾膜孔徑過小而無法通過，因而降低了其抗生效果[13]。本試驗中供試木霉菌發(fā)酵液的抑菌率較低是否與這個原因有關，還需要進行進一步的分析。此外，木霉菌還能產(chǎn)生多種揮發(fā)性或非揮發(fā)性的抗菌素類物質，其中僅抗真菌的代謝產(chǎn)物就可多達32種以上，這些代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生使得木霉菌即使不與病原菌菌絲發(fā)生接觸也可引起其菌絲生長緩慢，甚至停止生長[22]。本研究在平板對峙試驗中發(fā)現(xiàn)，對峙的病原菌菌絲稀薄，生長速度要顯著慢于對照，而通過平板對扣試驗和濾膜法試驗也證實了供試的木霉菌均可產(chǎn)生揮發(fā)性和非揮發(fā)性的代謝物質，其中揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌的抑菌率達22.95%，非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌率高達61.09%。揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑制效果不如非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物明顯，可能與其具體的物質組成對灰霉病菌的抑菌作用存在差異有關。

目前，雖然木霉菌菌劑在生產(chǎn)上應用廣泛，但在實際的生防應用中仍存在許多問題，如生防效果不穩(wěn)定、在作物上的定殖能力低、受環(huán)境因素的影響等[23]。本研究通過平板對峙培養(yǎng)、發(fā)酵液和代謝產(chǎn)物的抗生作用試驗，篩選到1株對番茄灰霉病菌抑制效果較好的木霉菌FJ2006-8，其在田間對病害的防治效果以及在番茄體內的定殖情況還需進一步的探明。此外，本研究發(fā)現(xiàn)木霉菌非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌的抑制效果較好，其代謝產(chǎn)物中具體的抑菌物質也有待于進一步研究。

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(責任編輯：林海清)

Antagonistic Effect ofTrichodermaspp. Strains onBotrytiscinerea

GAN Lin1,2, DAI Yu-li1,2, YANG Xiu-juan1,2, SHI Niu-niu1,2, RUAN Hong-chun1,2, DU Yi-xin1,2, CHEN Fu-ru1,2*

(1.InstituteofPlantProtection,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013,China; 2.FujianKeyLaboratoryforMonitoringandIntegratedManagementofCropPests,Fuzhou,Fujian350003,China)

Antifungal activities of 8 strains ofTrichodermaspp. onBotrytiscinereain Fujian was studied. By means of confrontation culture, all of the strains were shown to effectively inhibit the mycelial growth of the pathogen with inhibition rates ranging from 86.83% to 91.39%. The fermentation broths of theTrichodermastrains differed significantly in their inhibiting effects on hyphal growth of the pathogen. The broth from FJ2006-8 was found to render the highest inhibition rate of 39.44% among all. All tested strains produced volatile as well as non-volatile metabolites. The non-volatile metabolites produced by FJ2006-8 showed the greatest inhibitory effect, reaching a rate of 61.09%, while the volatiles from T05-58 exhibited the highest rate of 22.95%. The results would provide the needed information to develop a biocontrol agent fromTrichodermafor the disease on tomato plants caused by the gray mold.

Trichodermaspp.;Botrytiscinerea; antagonism; metabolite

2016-06-29初稿；2016-09-01修改稿

甘林(1981-)，男，碩士，助理研究員，研究方向：植物病害防治(E-mail:millergan@yeah.net) *通訊作者：陳福如(1961-)，男，研究員，研究方向：植物病害防治(E-mail:chenfuruzb@163.com)

福建省農業(yè)科學院青年基金項目(2014CX-16)

S 435

：A

：1008-0384(2016)11-1221-05

甘林，代玉立，楊秀娟，等.木霉菌對番茄灰霉病菌的抑制作用[J].福建農業(yè)學報，2016，31(11)：1221-1225.

GAN L，DAI Y-L，YANG X-J，et al.Antagonistic Effect ofTrichodermaspp. Strains onBotrytiscinerea[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1221-1225.