迷迭香酸甲酯在大鼠腦核團(tuán)內(nèi)的分布

李 剛， 曹桂云， 張良聰， 王秀秀， 呂美華

（1.菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東 菏澤274000；2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇 揚(yáng)州225001；3.菏澤市立醫(yī)院，山東 菏澤274000）

迷迭香酸甲酯（C19H18O8）是具有多個羥基的木脂素類化合物，已從多種唇形科植物，如丹參、絨毛栗色鼠尾草、冬凌草、石見穿、紫蘇中分離得到，具有多種生物活性，如抗菌［1］、抗氧化［2］、抗炎、抗糖基化［3］等，另外前期研究表明它可較好地抑制胃癌細(xì)胞增殖遷移［4］、抗帕金森［5-6］，但其在腦核團(tuán)分布的動力學(xué)變化如何尚不明確，這對于證實其體內(nèi)過程、生物活性及可能作用機(jī)制具有重要意義。因此，本實驗對迷迭香酸甲酯的腦核團(tuán)分布進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀，配置四元梯度泵、DAD 檢測器、ChemStation 數(shù)據(jù)處理工作站（美國安捷倫科技公司）； MIKRO 22R 臺式冷凍離心機(jī) （德國Hettich 公司）；YMC ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） （日本YMC 公司）。

1.2 試藥 迷迭香酸甲酯、迷迭香酸乙酯（內(nèi)標(biāo)） 由本課題組從絨毛栗色鼠尾草中分離純化得到［7］，其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振波譜和質(zhì)譜確認(rèn)，HPLC 面積歸一化法鑒定其含有量大于98%。乙腈為色譜純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 動物 Wistar 健康雄性大鼠，體質(zhì)量250 ～280 g，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號SYXK（蘇） 2012-0029，在（25±1）℃、光暗周期12 h 環(huán)境下，給予清潔級普通大鼠飼料（揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心）。實驗前12 h，大鼠禁食不禁水。

2 方法

2.1 內(nèi)標(biāo)、工作溶液制備 精密稱取迷迭香酸乙酯（內(nèi)標(biāo)） 適量，甲醇配制成50 μg／mL 內(nèi)標(biāo)溶液。精密稱取迷迭香酸甲酯適量，甲醇配制成2.00 mg／mL 貯備液，再將其稀釋成系列質(zhì)量濃度的工作溶液，密封，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分組、給藥及標(biāo)本采集 60 只大鼠隨機(jī)分為空白組和給藥組，其中給藥組大鼠按20 mg／kg 劑量尾靜脈注射迷迭香酸甲酯（溶于15%乙醇中）。各組大鼠于給藥后3、8、15、22.5、30、45、60、80、100、120 min 后脫頸椎處死，冰盒上迅速取腦，分離海馬、紋狀體、丘腦、下丘腦、大腦皮層、小腦、腦干，于-20 ℃下冷凍備用。

2.3 樣品預(yù)處理 精密稱取各腦核團(tuán)組織，加入2 倍量生理鹽水勻漿，取1 mL 勻漿液于潔凈離心管中，加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液、2 mL 乙酸乙酯后渦旋混合1 min，4 ℃、8 000×g離心10 min，取上清液，殘液再加入2 mL 乙酸乙酯萃取1次，合并有機(jī)相，45 ℃下N2吹干，殘渣溶于500 μL 甲醇中，0.45 μm 微孔濾膜過濾。

2.4 色譜條件 采用RP-HPLC 法進(jìn)行分析。YMC ODS C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-水（40 ∶60）；體積流量0.8 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長336 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 取各空白腦核團(tuán)勻漿液，加入工作溶液和20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，按“2.3” 項下方法預(yù)處理，設(shè)置6 個質(zhì)量濃度，每個平行3 份，在“2.4” 項色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），迷迭香酸甲酯與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸。

2.5.2 最低檢測限（LLOD）、最低定量限（LLOQ） 各空白腦核團(tuán)勻漿液加入貯備液和20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，配制成回歸方程末端質(zhì)量濃度，并逐漸降低，以檢測成分的信號與噪音信號比為3 ∶1 時的質(zhì)量濃度為LLOD，10 ∶1 時的為LLOQ，平行3 次。

2.5.3 準(zhǔn)確度、精密度試驗 各空白腦核團(tuán)勻漿液加入適量貯備液和20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，配制成高、中、低質(zhì)量濃度，平行3 份，按“2.3” 項下方法預(yù)處理，在“2.4” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，同1 d 連續(xù)進(jìn)行3 次，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)進(jìn)行3 d，每天1 次，計算日間精密度。

2.5.4 萃取回收率試驗 各空白腦核團(tuán)勻漿液加入適量貯備液和20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，配制成高、中、低質(zhì)量濃度，平行3 份，按“2.3” 項下方法預(yù)處理，在“2.4” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，以勻漿處理后腦核團(tuán)樣品峰面積與等量迷迭香酸甲酯直接加到甲醇中后峰面積的比值為萃取回收率。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 各空白腦核團(tuán)勻漿液加入適量貯備液和20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，配制成高、中、低質(zhì)量濃度，平行3份，將組織液放入-20 ℃冰箱中冷凍24 h，室溫下再放置1 h后解凍，平行3 次，按“2.3” 項下方法預(yù)處理，在“2.4” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，考察凍融穩(wěn)定性。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性 在“2.4” 項色譜條件下，迷迭香酸甲酯、內(nèi)標(biāo)保留時間分別為8.9、12.3 min，內(nèi)源性物質(zhì)無干擾，表明該方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

3.1.2 線性關(guān)系 表1 顯示，各腦核團(tuán)中迷迭香酸甲酯在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.990）。

表1 迷迭香酸甲酯在各腦核團(tuán)中的線性關(guān)系

3.1.3 LLOD、LLOQ 迷迭香酸甲酯LLOD、LLOQ 分別為0.02、0.06 μg／g。

3.1.4 準(zhǔn)確度、精密度 表2 顯示，迷迭香酸甲酯在各腦核團(tuán)中的日內(nèi)、日間精密度RSD 均小于15%，日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度分別在88.62%～112.28%、88.44%～114.22%之間，表明該方法精密度、準(zhǔn)確度良好。

3.1.5 萃取回收率 表2 顯示，迷迭香酸甲酯在各腦核團(tuán)中的萃取回收率大于80.26%，表明該方法萃取回收率良好。

圖1 迷迭香酸甲酯HPLC 色譜圖

表2 迷迭香酸甲酯精密度、準(zhǔn)確度、萃取回收率、穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n＝3）

3.1.6 穩(wěn)定性 表2 顯示， 迷迭香酸甲酯準(zhǔn)確度在94.37%～106.85%之間，表明該成分在凍融條件下穩(wěn)定性良好。

3.2 迷迭香酸甲酯腦核團(tuán)分布 圖2 顯示，迷迭香酸甲酯可透過血腦屏障快速廣泛地在腦核團(tuán)內(nèi)分布。給藥后8 min左右，該成分含有量在大腦皮層、丘腦、紋狀體、下丘腦、小腦、腦干中達(dá)到峰值，之后緩慢下降，但在120 min 后仍可檢測到；給藥后45 min，該成分含有量在海馬中達(dá)到峰值，之后緩慢下降，但在120 min 后仍可檢測到，達(dá)峰濃度依次為海馬＞丘腦＞大腦皮層＞小腦＞下丘腦＞紋狀體＞腦干，即有向海馬富集的傾向。

圖2 迷迭香酸甲酯在各腦核團(tuán)中的濃度-時間曲線

4 討論

本研究建立了一種簡便、快捷、靈敏的RP-HPLC-UV法來檢測迷迭香酸甲酯在大鼠腦核團(tuán)內(nèi)的分布，該方法專屬性、線性關(guān)系、精密度、萃取回收率、穩(wěn)定性均滿足生物樣品分析要求。結(jié)果顯示，大鼠尾靜脈注射給藥后迷迭香酸甲酯通過血腦屏障在腦核團(tuán)內(nèi)迅速廣泛的分布，在7個腦核團(tuán)中都能定量檢測到該成分，但在海馬中的含有量明顯高于其他腦核團(tuán)中，提示其在海馬中有富集傾向。海馬體位于大腦丘腦和內(nèi)側(cè)顳葉之間，屬于邊緣系統(tǒng)的一部分，主要負(fù)責(zé)長時記憶存儲轉(zhuǎn)換及空間信息存儲，日常生活中的短期記憶都儲存在其中，臨床上很多疾病的發(fā)生與海馬體有著重要聯(lián)系，如幾乎所有癲癇患者的發(fā)作都是由海馬區(qū)起始，而且其中有一部分，尤其是內(nèi)嗅皮質(zhì)，為阿爾茨海默病最先病變的地方。

研究表明，炎癥和氧化應(yīng)激是癲癇和阿爾茨海默病的重要因素［8-11］，貫穿于病情發(fā)生發(fā)展全過程，而迷迭香酸甲酯具有良好的抗炎、抗氧化應(yīng)激作用，表明該成分對上述疾病可能有一定作用。另外，迷迭香酸甲酯對腦的影響很復(fù)雜，靜脈注射后在丘腦、大腦皮層、小腦、下丘腦、紋狀體、腦干中也有分布，提示在設(shè)計中樞治療藥物時應(yīng)充分考慮具體的腦核團(tuán)分布規(guī)律，從而得到較好的藥效和較低的副作用。因此，動態(tài)地觀察藥物在腦內(nèi)不同核團(tuán)中的分布，對于探討其對腦功能的影響有著重要的理論意義，同時能更好地指導(dǎo)相應(yīng)藥物的開發(fā)。