NDRG2通過(guò)抑制β-catenin表達(dá)和入核調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖

河北科技大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)中心，河北 石家莊 050018

NDRG2通過(guò)抑制β-catenin表達(dá)和入核調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖

周曉雷，朱重悅，張世光，周志艷，李海潮，鄒 衛(wèi)

河北科技大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)中心，河北 石家莊 050018

背景與目的：乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，腫瘤細(xì)胞的惡性增殖是造成患者死亡的重要原因。本研究利用具有相同遺傳背景但不同增殖能力的乳腺癌細(xì)胞模型，研究N-myc下游調(diào)節(jié)基因2(N-myc downstream regulated gene 2，NDRG2)調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖的作用及分子機(jī)制。方法：通過(guò)蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)MCF-7/LM-MCF-7細(xì)胞中NDRG2蛋白表達(dá)水平；構(gòu)建NDRG2真核表達(dá)載體及siRNA干擾片段，通過(guò)轉(zhuǎn)染上調(diào)或沉默NDRG2表達(dá)，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，Western blot檢測(cè)β-連環(huán)蛋白(β-catenin)表達(dá)，免疫熒光染色檢測(cè)β-catenin細(xì)胞定位；共轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞NDRG2 siRNA和pCMV-Tcfδ，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。結(jié)果：NDRG2的蛋白表達(dá)水平同乳腺癌細(xì)胞增殖能力負(fù)相關(guān)；在增殖的LMMCF-7細(xì)胞中上調(diào)NDRG2表達(dá)，細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation index，PI)由47.18%下降至31.78%(P<0.001)；在低增殖的MCF-7細(xì)胞中沉默NDRG2表達(dá)，PI由32.00%上升至52.59%(P<0.001)；Western blot及免疫熒光結(jié)果顯示，NDRG2可抑制β-catenin表達(dá)，并抑制其聚集入核；流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染siRNA和pCMV-Tcfδ的MCF-7細(xì)胞增殖能力未增強(qiáng)，進(jìn)一步說(shuō)明NDRG2是通過(guò)抑制β-catenin的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用抑制腫瘤細(xì)胞增殖。結(jié)論：在乳腺癌細(xì)胞中，NDRG2的表達(dá)水平下調(diào)，導(dǎo)致β-catenin聚集入核，并激活下游靶基因，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。此分子機(jī)制對(duì)闡明乳腺癌細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

乳腺腫瘤；N-myc下游調(diào)節(jié)基因2；β-連環(huán)蛋白；細(xì)胞增殖

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，全球每年約有138萬(wàn)女性被診斷為乳腺癌，占全部新發(fā)腫瘤的23%。我國(guó)每年女性乳腺癌發(fā)病16.9萬(wàn)例，居女性常見(jiàn)腫瘤首位。有研究表明，腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和分裂失調(diào)是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)［1］。癌細(xì)胞獲得高增殖能力是乳腺癌后期轉(zhuǎn)移的重要條件之一，研究癌細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)制對(duì)乳腺癌的診斷和治療具有重要價(jià)值。

N-myc下游調(diào)節(jié)基因2(N-myc downstream regulated gene 2，NDRG2)是NDRG家族的重要成員，其基因染色體定位于14q11.2，含有16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子，表達(dá)蛋白含357個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量約41×103。NDRG2具有APC樣結(jié)構(gòu)域，受原癌基因N-Myc的表達(dá)調(diào)控。近年研究發(fā)現(xiàn)，NDGR2基因除參與胚胎組織發(fā)育、細(xì)胞分化及血液免疫外，還與腫瘤進(jìn)展具有密切關(guān)系［2］。NDRG2在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到抑癌基因的作用［3］。在腫瘤細(xì)胞中，NDRG2啟動(dòng)子常發(fā)生甲基化［4-5］，因此在多種腫瘤中，如消化系統(tǒng)腫瘤、甲狀腺癌、肺癌、和中樞神經(jīng)腫瘤中呈顯著低表達(dá)，且與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)［4,6-10］。但NDRG2是否可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及其分子機(jī)制目前尚不清楚。

β-連環(huán)蛋白(β-catenin)作為Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，通過(guò)T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(T cellspecific transcription factor，Tcf)或其他轉(zhuǎn)錄因子與特定的DNA序列相結(jié)合，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄［11］，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用。腫瘤細(xì)胞可通過(guò)上調(diào)Dsh蛋白或下調(diào)Frp1蛋白表達(dá)激活經(jīng)典的Wnt途徑，并上調(diào)β-catenin表達(dá)［12-13］。腫瘤細(xì)胞也可通過(guò)非Wnt通路機(jī)制穩(wěn)定β-catenin表達(dá)，如通過(guò)調(diào)控PTEN、ILK、IKKA、Pin1及P53等因子的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)β-catenin［14］。前期研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2信號(hào)通路的激活可上調(diào)β-catenin表達(dá)，并促進(jìn)其轉(zhuǎn)移入核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移［15-16］，但β-catenin是否受到NDRG2的調(diào)控需要進(jìn)一步研究。

在前期研究中，我們應(yīng)用嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠從人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中篩選和建立了具有高轉(zhuǎn)移能力的轉(zhuǎn)移亞克隆LM-MCF-7。與MCF-7細(xì)胞相比，LM-MCF-7細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖和遷移能力，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，其具有成瘤早、轉(zhuǎn)移快和轉(zhuǎn)移部位廣泛等特點(diǎn)。基因芯片研究結(jié)果顯示，在人的21 329種基因中，有67種基因的表達(dá)水平在LM-MCF-7細(xì)胞中和MCF-7細(xì)胞中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［15］。本研究應(yīng)用MCF-7和LM-MCF-7細(xì)胞模型研究NDRG2對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、LM-MCF-7、pCMV-tag2b質(zhì)粒和pCMV-Tcfδ質(zhì)粒(表達(dá)的Tcfδ具有蛋白結(jié)合位點(diǎn)但缺少DNA結(jié)合位點(diǎn)，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制Tcf的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能)為本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)備；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清和LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；兔抗人NDRG2多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體和碘化丙啶購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；兔抗人β-catenin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santacruz公司；小量總RNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；QuantScript RT試劑盒購(gòu)自天根公司。靶向NDRG2的小RNA干擾片段由廣州市銳博生物科技有限公司合成，NDRG2 siRNA正義序列：5’-ACAUCCUGGCGAGAUAUGCUCUUAA-3’，反義序列：5’-UUAAGAGCAUAUCUCGCCAGGA UGU-3’；對(duì)照siRNA正義序列：5’-UUCUCCGA A C G U G U C A C G U T T-3’，反義序列：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7和LM-MCF-7細(xì)胞采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL硫酸鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。

1.3 pCMV-NDRG2真核表達(dá)載體構(gòu)建

用小量總RNA提取試劑盒提取MCF-7細(xì)胞總RNA，利用QuantScript RT試劑盒制備cDNA。根據(jù)NDRG2(GENEBANK：NM_201535.1)mRNA CDS序列設(shè)計(jì)引物：上游加入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，下游加入SalⅠ酶切位點(diǎn)。上、下游引物序列分別為5’-GAATTCATGGCGGAGCTGCAGGA GGTG-3’和5’-GTCGACTCAACAGGAGACCTCC ATGGT-3’。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板。用上述引物PCR擴(kuò)增，獲得目的基因片段(PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共20個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min)。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切純化后，與pCMV重組，轉(zhuǎn)化DH5α菌。提取轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切和DNA測(cè)序分析，對(duì)NDRG2序列進(jìn)行鑒定，得到重組真核表達(dá)載體pCMVNDRG2。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將培養(yǎng)至覆蓋率達(dá)80%的MCF-7和LMMCF-7細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將8 μg質(zhì)粒(或80 nmol/L siRNA)和24 μL LipofectamineTM2000分別加入到500 μL的OMEM培養(yǎng)基中，室溫靜置5 min，然后將二者混勻并于37 ℃靜置15 min。隨后將質(zhì)粒(或siRNA)/LipofectamineTM2000/OMEM混合物加入細(xì)胞中，37 ℃溫育6 h后換成無(wú)抗生素的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進(jìn)行蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)或流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.5 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞增殖

用胰蛋白酶消化收集正常培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細(xì)胞，PBS洗2遍，1 000×g離心5 min，70%的冰乙醇固定，4 ℃過(guò)夜。上機(jī)檢測(cè)前細(xì)胞用PBS洗2遍后重懸在含50 mg/L RNA酶和25 mg/L碘化丙錠的PBS中，室溫避光溫育15 min后用FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行單色熒光細(xì)胞流式檢測(cè)。每個(gè)樣本采集1×104個(gè)細(xì)胞，用ModFit軟件(購(gòu)自美國(guó)Verity Software House公司)分析結(jié)果。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 免疫熒光檢測(cè)β-catenin細(xì)胞定位

將正常培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種在放有蓋玻片的六孔板中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。隨后用-20 ℃預(yù)冷的無(wú)水甲醇于4 ℃固定15 min，用含5%Triton X-100的PBS洗細(xì)胞，5 min×2次。加入10%血清，室溫封閉20 min。加入兔抗人β-catenin抗體，室溫溫育2 h。PBS洗細(xì)胞，5 min×3次。滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗，室溫溫育1 h。PBS洗細(xì)胞，5 min×3次。用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，室溫溫育1 h，PBS洗細(xì)胞，5 min×3次。封片后，置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.7 Western blot

收獲正常培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，隨后加入細(xì)胞裂解液(10 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0，0.1 mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，1%NP-40，1 mmol/L PMSF，1%SDS)冰上放置20 min，4 ℃，12 000×g離心20 min，收集上清定量分析，取30 μg總蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，隨后電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入相應(yīng)一抗，室溫溫育2 h，TBS-T洗膜后加入相應(yīng)二抗室溫溫育1 h，TBS-T洗膜后，應(yīng)用增強(qiáng)型ECL顯色試劑盒于暗室曝光顯影，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 過(guò)表達(dá)NDRG2抑制乳腺癌細(xì)胞增殖

Western blot結(jié)果顯示，與高增殖能力的LM-MCF-7細(xì)胞相比，NDRG2在低增殖能力的MCF-7中表達(dá)較高(如圖1A)。NDRG2表達(dá)同腫瘤細(xì)胞增殖能力負(fù)相關(guān)。轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞NDRG2 siRNA，沉默NDRG2表達(dá)，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA組相比，細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation index，PI)由32.00%上升至52.59%(P<0.01)。利用pCMV-tag2b真核表達(dá)載體，構(gòu)建pCMV-NDRG2載體(圖1B)。轉(zhuǎn)染LM-MCF-7細(xì)胞pCMV-NDRG2質(zhì)粒，過(guò)表達(dá)NDRG2(圖1C)，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染對(duì)照pCMV-tag2b組相比，PI由47.18%下降至31.78%(P<0.01，圖1D)。以上結(jié)果說(shuō)明，NDRG2表達(dá)水平同細(xì)胞增殖能力負(fù)相關(guān)，NDRG2表達(dá)下調(diào)是乳腺癌細(xì)胞獲得高增殖能力的重要原因。

圖 1 過(guò)表達(dá)NDRG2抑制乳腺癌細(xì)胞增殖Fig. 1 The proliferation of breast cancer cells was inhibited by over-expressing NDRG2

2.2 NDRG2抑制β-catenin表達(dá)并促進(jìn)其磷酸化

本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)改變NDRG2表達(dá)水平后，β-catenin的表達(dá)水平及磷酸化水平變化。轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞siRNA，沉默NDRG2表達(dá)，Western blot結(jié)果顯示，同轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA組相比，β-catenin表達(dá)水平顯著上調(diào)，且磷酸化的p-β-catenin水平下降(圖2A)。轉(zhuǎn)染LM-MCF-7細(xì)胞pCMV-NDRG2表達(dá)載體，上調(diào)NDRG2表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示，β-catenin表達(dá)水平下降，并且磷酸化的p-β-catenin表達(dá)水平上調(diào)(圖2B)。以上結(jié)果說(shuō)明，NDRG2能夠抑制β-catenin表達(dá)，并且促進(jìn)β-catenin磷酸化，促使其進(jìn)入泛素化降解途徑。

2.3 NDRG2抑制β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核

β-catenin發(fā)揮促增殖作用主要依賴其在細(xì)胞質(zhì)中聚集并進(jìn)入細(xì)胞核，與Tcf/LEF結(jié)合形成Tcf/LEF/β-catenin復(fù)合體，特異性啟動(dòng)和激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄［17］。利用β-catenin特異性抗體，通過(guò)免疫熒光技術(shù)對(duì)MCF-7和LM-MCF-7中β-catenin在細(xì)胞中的定位進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-catenin在高增殖能力的LM-MCF-7細(xì)胞中存在明顯的核定位，而在低增殖能力的MCF-7細(xì)胞中主要存在于細(xì)胞質(zhì)。利用RNA干擾方法沉默MCF-7細(xì)胞中的NDRG2表達(dá)后，免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-catenin由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核(圖3A)。在LM-MCF-7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NDRG2后，β-catenin主要定位于細(xì)胞質(zhì)，而核定位的β-catenin接近消失(圖3A)。免疫熒光結(jié)果說(shuō)明，NDRG2能夠抑制β-catenin聚集入核。為進(jìn)一步驗(yàn)證NDRG2抑制β-catenin的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，我們共轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞NDRG2 siRNA和pCMV-Tcfδ，在降低NDRG2表達(dá)的同時(shí)，過(guò)表達(dá)Tcfδ(具有蛋白結(jié)合位點(diǎn)，但缺失DNA結(jié)合位點(diǎn)的Tcf突變體，能夠同野生型Tcf競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合β-catenin，抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄激活［15］)。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，干擾NDRG2表達(dá)后，與對(duì)照組相比，MCF-7細(xì)胞PI明顯上升至53.25%(P<0.01)；干擾NDRG2的同時(shí)過(guò)表達(dá)Tcfδ，與pCMV-tag2b相比，細(xì)胞PI下降至40.78%(P<0.05%，圖3B)。流式細(xì)胞結(jié)果表明，在乳腺癌細(xì)胞中，NDRG2表達(dá)下降，促進(jìn)了β-catenin入核，并與Tcf結(jié)合促進(jìn)下游因子轉(zhuǎn)錄。此分子機(jī)制是乳腺癌細(xì)胞獲得高增殖能力的重要原因。

圖 2 NDRG2調(diào)控β-catenin表達(dá)及其磷酸化Fig. 2 NDRG2 regulated the expression and phosphorylation of β-catenin

圖 3 NDRG2抑制β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核Fig. 3 Translocation of β-catenin into the nucleus was inhibited by NDRG2

3 討 論

細(xì)胞增殖和分裂失調(diào)是乳腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)，深入研究癌細(xì)胞的增殖調(diào)控機(jī)制對(duì)腫瘤的診斷和治療具有重要意義。目前研究已證實(shí)，NDRG2除參與正常細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化以及應(yīng)激反應(yīng)外，還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。腫瘤組織的NDRG2表達(dá)顯著低于癌旁及正常組織，表達(dá)水平隨腫瘤TNM分期增加或惡性度增加而降低［2］。本研究利用具有相同遺傳背景但具有不同增殖能力的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和LM-MCF-7［15］探明NDRG2在調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖中的作用，發(fā)現(xiàn)NDRG2的表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞的增殖能力呈負(fù)相關(guān)，提高NDRG2的表達(dá)水平可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖；相反，RNAi沉默NDRG2表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)。目前已有多項(xiàng)研究證實(shí)，NDRG2在乳腺腫瘤中起到抑癌基因的作用，通過(guò)多種分子機(jī)制抑制乳腺腫瘤生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。在乳腺癌細(xì)胞SKBR-3和MCF-7中過(guò)表達(dá)NDRG2能夠抑制細(xì)胞增殖，下調(diào)促血管生成因子VEGF和HIF-1α的表達(dá)并抑制血管新生，進(jìn)而抑制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)［18-19］。在MDA-MB-231細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NDRG2，能夠激活BMP-4通路，并通過(guò)抑制MMP-9活性抑制細(xì)胞侵襲［20］。Kim等［21］研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NDRG2能夠抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，進(jìn)而下調(diào)COX-2表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲。NDRG2還可通過(guò)激活p38 MAPK途徑，抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1磷酸化，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和遷移［22］。在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NDRG2可促進(jìn)SAPK和JNK磷酸化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［22］。除乳腺腫瘤外，NDRG2對(duì)多種腫瘤生長(zhǎng)、腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲具有抑制作用。在大腸癌SW620細(xì)胞中，上調(diào)NDRG2表達(dá)可降低c-Jun磷酸化水平，減弱轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子AP-1活性，進(jìn)而抑制cyclinD1表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖［23］。在肝癌細(xì)胞中，NDRG2還可通過(guò)上調(diào)p38磷酸化水平抑制細(xì)胞增殖［24］；通過(guò)下調(diào)CD24的表達(dá)抑制細(xì)胞黏附、遷移和侵襲［25］。NDRG2還可通過(guò)促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1降解阻斷腫瘤細(xì)胞能量代謝，抑制腫瘤生長(zhǎng)［26］。過(guò)表達(dá)NDRG2可增強(qiáng)GSK-3β活性，促進(jìn)Snail降解，進(jìn)而上調(diào)E-cadherin抑制腫瘤細(xì)胞侵襲［27］。NDRG2還可通過(guò)抑制MMP2和laminin332信號(hào)通路并同時(shí)降低Rho GTPase活性，抑制由TGFβ1介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞侵襲［28］。

β-catenin蛋白是介導(dǎo)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵分子，其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平?jīng)Q定著Wnt信號(hào)通路的開(kāi)放或關(guān)閉，在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵作用［29］。β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的水平受到嚴(yán)格調(diào)控，由GSK-3β、Axin及APC組成的復(fù)合體能夠使β-catenin磷酸化，并進(jìn)入泛素化降解途徑。當(dāng)磷酸化被抑制時(shí)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中聚集并進(jìn)入細(xì)胞核，形成Tcf/LEF/β-catenin復(fù)合體，特異性啟動(dòng)和激活下游靶基因［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)NDRG2水平可促進(jìn)β-catenin磷酸化，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)β-catenin水平；免疫熒光發(fā)現(xiàn)，NDRG2可抑制細(xì)胞質(zhì)的β-catenin轉(zhuǎn)移入核，阻礙其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。近年來(lái)多項(xiàng)相關(guān)研究均證實(shí)，乳腺癌的發(fā)生與β-catenin表達(dá)異常有關(guān)。β-catenin的表達(dá)激活可增強(qiáng)cyclinD1表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞異常增殖［29］；C-myc基因啟動(dòng)子上有Tcf結(jié)合位點(diǎn)，β-catenin/TCF復(fù)合物可促進(jìn)其基因表達(dá)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖［14］。乳腺癌細(xì)胞中有多種途徑可穩(wěn)定調(diào)節(jié)β-catenin，如Pin1蛋白在80%的乳腺癌中上調(diào)，Pin1能夠抑制APC蛋白作用，從而穩(wěn)定β-catenin處于高表達(dá)水平［31］。PTEN基因的丟失及異常激活A(yù)kt蛋白能夠激活β-catenin，引起乳腺癌細(xì)胞增殖［32］。腫瘤細(xì)胞中p53蛋白能夠通過(guò)GSK-3β依賴性和Siah依賴性機(jī)制穩(wěn)定β-catenin表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［33］。我們的前期研究還發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，激活的MLCK-ERK1/2正反饋信號(hào)途徑通過(guò)促進(jìn)β-catenin高表達(dá)及轉(zhuǎn)移入核，激活cyclin D1和Survivin表達(dá)，維持乳腺癌細(xì)胞高增殖和高遷移能力［15］。在腫瘤細(xì)胞中，β-catenin作為信號(hào)因子受到多種信號(hào)途徑調(diào)控，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。

綜上所述，NDRG2作為腫瘤抑制因子，在調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要的抑制作用。NDRG2抑制β-catenin表達(dá)，阻礙其轉(zhuǎn)移入核發(fā)揮抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用是乳腺癌細(xì)胞獲得高增殖能力的重要原因。此分子調(diào)控機(jī)制的闡明為乳腺癌的診斷和治療提供了重要理論依據(jù)。

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NDRG2 inhibits the proliferation of breast cancer cells via regulating β-catenin expression and nuclear translocation

ZHOU Xiaolei, ZHU Chongyue, ZHANG Shiguang, ZHOU Zhiyan, LI Haichao, ZOU Wei (Public R&D Center of Bio-Manufacture, Hebei University of Science & Technology, Shijiazhuang 050018, Hebei Province, China)

Background and purpose:Breast cancer is one of the most common malignant diseases in women and its malignant proliferation is the major cause of death. To investigate the effects of N-myc downstream regulated gene 2 (NDRG2) on proliferation of breast cancer cells by using two parallel cell lines (MCF-7 and LM-MCF-7) with different metastatic abilities.Methods:The expression level of NDRG2 in breast cancer cells was detected by Western blot. The effects of overexpressing (or down-regulating) NDRG2 on proliferation of breast cancer cells were investigated by flow cytometry. The expression and location of β-catenin were detected by Western blot and immunofluorescence respectively. NDRG2 blocking the transcription activity of β-catenin was investigated via co-transfecting MCF-7 cells with NDRG2 siRNA and pCMV-Tcfδ (lacking the portion responsible for the protein binding to DNA).Results:The expression level of NDRG2 was negatively related to the proliferation ability of breast cancer cells. Over-expressing NDRG2 (or down-regulating) via transfecting LM-MCF-7 (or MCF-7) cells with pCMV-NDRG2 (or NDRG2 siRNA) could inhibit (or promote) cell proliferation. Interestingly, the results of Western blot, immunofluorescence and flow cytometry revealed that down-regulation of NDRG2 resulted from the down-regulation of β-catenin and blocking its nuclear translocation, which led to losing control of the proliferation of breast cancer cells.Conclusion:NDRG2 inhibitthe proliferation of breast cancer cells via down-regulating the expression of β-catenin and blocking its nuclear translocation, which is significant for exploring the molecular mechanism of proliferation of breast cancer cells.

Breast neoplasms; N-myc downstream regulated gene 2; β-catenin; Cell proliferation

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.12.004

R737.9

A

1007-3639(2016)12-0981-08

2016-04-25

2016-06-27）

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(QN2016020)；2015年度河北科技大學(xué)五大平臺(tái)開(kāi)放基金課題；河北科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金課題。

周曉雷 E-mail: foxlei@live.cn