銀杏葉片對土三七誘導大鼠肝小靜脈閉塞病的干預作用

徐利君 陳賽貞 徐紅燕 林利芬 田自有 曹學全 陳文舉

銀杏葉片對土三七誘導大鼠肝小靜脈閉塞病的干預作用

徐利君 陳賽貞 徐紅燕 林利芬 田自有 曹學全 陳文舉

目的觀察銀杏葉片對土三七誘導的大鼠肝小靜脈閉塞病（HVOD）的干預作用。方法雌性SD大鼠42只，采用土三七誘導建立大鼠HVOD模型，隨機分為對照組10只，模型組12只，銀杏葉片低、高劑量組10只。對照組大鼠給予蒸餾水7mL/（kg·d）灌胃；模型組給予土三七濃縮煎液7mL/（kg·d）灌胃；銀杏葉片低、高劑量組分別給予土三七提取液[7mL/（kg·d）]+銀杏葉片[50mg/ （kg·d）]、土三七提取液[7mL/（kg·d）]+銀杏葉片[100mg/（kg·d）]灌胃；4周后處死大鼠，采集血清、肝組織，檢測血清學指標、觀察肝組織病理學變化，評價肝臟膠原表達及纖維化程度。結(jié)果銀杏葉片低、高劑量組大鼠總膽紅素（TBILI）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血清透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）等較模型組均有顯著降低[TBILI：（2.43±1.00）μmol/L、（2.28±0.55）μmol/L比（6.02±1.26）μmol/L，P＜0.05；ALT：（117.44±35.24）U/L、（98.13±13.50）U/L比（143.54±23.25）U/L，P＜0.05，P＜0.01；AST：（220.44±48.13）U/L、（198.20±41.64）U/L比（303.92±51.53）U/L，P＜0.05，P＜0.01；HA：（157.80±41.63）ng/mL、（162.63±13.48）ng/mL比（189.72±23.30）ng/mL，P＜0.05，P＜0.01；PCⅢ：（16.26±2.86）ng/mL、（14.40±1.73）ng/mL比（20.50±4.52）ng/mL，P＜0.05，P＜0.01]；銀杏葉片低、高劑量組大鼠血白蛋白（ALB）較模型組顯著增加[（31.95±1.64）、（32.48±1.33）g/L比（29.08±3.62）ng/ L，P＜0.05]，銀杏葉片高劑量組Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）較低劑量治療組下降更明顯[（2.58±0.36）ng/mL比（3.16±0.76）ng/mL，P＜0.05]；病理學檢查示，銀杏葉片各劑量組較模型組肝纖維化程度輕，其中高劑量組改善更顯著。結(jié)論銀杏葉片對土三七誘導的大鼠HVOD有明顯的防治作用。

大鼠；肝小靜脈閉塞??；銀杏葉片；土三七

土三七（gynura segetum），又名菊三七，是一味民間常用的中草藥，具有止血、散瘀、消腫止痛的功效，對于鼻出血、咳血、便血、外傷出血、跌打損傷等有較好的療效，但其可導致與細胞毒藥物環(huán)磷酰胺相似的肝小靜脈閉塞綜合征[1]。肝小靜脈閉塞綜合征（hepatic veno-occlusive disease，HVOD）是指肝小葉靜脈和肝小靜脈支內(nèi)皮腫脹、纖維化，從而導致管腔狹窄甚至閉塞繼而發(fā)生肝細胞萎縮、彌漫性肝纖維化，臨床表現(xiàn)為肝臟腫大疼痛、腹水、黃疸等[2]，其中肝星狀細胞的激活和轉(zhuǎn)化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)與必要環(huán)節(jié)。據(jù)文獻[3]報道，銀杏葉提取物能抑制肝星狀細胞的活化和擴張血管，改善管腔的狹窄程度和纖維化程度，有效防治肝纖維化的進展。本文觀察銀杏葉片對土三七導致的慢性肝纖維化的干預作用，報道如下。

1 實驗材料

1.1 動 物 健康雌性清潔級SD大鼠42只（由浙江省醫(yī)科院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK浙2008-0033），體質(zhì)量180～200g，自由飲水，自然采光，室溫15～25℃，予大鼠飼料喂養(yǎng)，實驗前適應環(huán)境1周。

1.2 儀 器 日立7600-020全自動生化分析儀（株式會社日立高新技術公司），DXI800發(fā)光免疫分析儀（美國貝克曼公司），TG1650-WS高速離心機（湖南賽特湘儀），移液器（Thermo Electron公司），Olympus BHS313顯微鏡（奧林巴斯株式會社），PN-10AC自動照相系統(tǒng)（奧林巴斯株式會社），Leica RM2235普通切片機（德國徠卡儀器有限公司），Leica TEC-2500攤片機（德國徠卡儀器有限公司），Mettler AE200-S十萬分之一電子天平（浙江科學器材進出口有限公司）

1.3 藥品及試劑 土三七根莖（購于安徽省毫州市藥材鑒定公司中藥公司）；銀杏葉片（批號131206，浙江康恩貝制藥股份有限公司）為市售品。甲醛（上海久億化學試劑有限公司），二甲苯（上海久億化學試劑有限公司蒸餾水），蒸餾水（浙江海正制藥廠）。

2 實驗方法

2.1 土三七提取液制備[4]取土三七切片150g置煎藥鍋中，加入915mL蒸餾水浸泡2h，用電磁爐1000W加熱煮沸，轉(zhuǎn)為500W繼續(xù)煎煮1.5h，濾出濾液，濾渣重新加入600mL蒸餾水，方法同上，合并濾液濃縮至150mL備用（濃度相當于1.0g土三七生藥/ mL）。

2.2 銀杏葉片灌胃液配制 取銀杏葉片10片（相當于銀杏葉片400mg）溶于12mL無菌生理鹽水稀釋成濃度為33.3mg/mL的灌胃液。

2.3 分 組 SD大鼠正常飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組10只，模型組12只，銀杏葉片低、高劑量組各10只。對照組每天按7mL/（kg·d）灌胃蒸餾水；模型組給予土三七濃縮煎液，藥量7mL/kg；銀杏葉片低劑量組給予土三七提取液7mL/（kg·d）+銀杏葉片50mg/（kg·d）灌胃；銀杏葉片高劑量組給予土三七提取液7mL/（kg·d）+銀杏葉片100mg/（kg·d）灌胃。各組大鼠每日稱體質(zhì)量1次，按體質(zhì)量變化相應調(diào)整灌胃藥物劑量。模型組大鼠灌胃4周后，先處死2只，確定造模成功后，再處死全部大鼠，末次給藥當晚禁食不禁水。

2.4 肝指數(shù)測定 于第4周末處死大鼠，取出肝臟，記錄肝臟質(zhì)量，計算肝指數(shù)（肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量）。

2.5 血液指標測定 灌胃4周后摘眼球取血，分離血清，-20℃冰箱保存；用日立7600-020全自動生化分析儀測定各項肝功能指標：總膽汁酸（TBA）、白蛋白（ALB）、總膽紅素（TBILI）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）等；血清透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）及IV型膠原（IV-C）等肝纖維化指標用DXI800發(fā)光免疫分析儀測定。

2.6 肝組織學檢查 實驗結(jié)束后選取肝左葉使用10%甲醛液固定，石蠟包埋，切片并進行HE染色，光鏡下觀察肝組織細胞的病理改變及肝臟纖維的增生程度。肝纖維化程度分級[5]如下，0級：無膠原纖維組織增生；I級：匯管區(qū)有少量纖維組織增生，纖維組織短而細；Ⅱ級：匯管區(qū)有較多纖維組織增生；Ⅲ級：匯管區(qū)有大量纖維組織增生，呈窄帶狀，并向肝小葉周圍伸展；Ⅳ級：匯管區(qū)有大量纖維組織增生，呈寬帶狀，伸展包繞或分割肝小葉，中央靜脈有偏位現(xiàn)象。

2.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s） 表示，采用單因素方差分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況 實驗前各組SD大鼠體毛、體質(zhì)量、排便、食量均正常，各組間無差異。灌胃3周后，模型組大鼠體質(zhì)量明顯增加，期間出現(xiàn)體質(zhì)量先降低再增加的現(xiàn)象，最后大鼠出現(xiàn)毛發(fā)稀疏雜亂，食欲減弱，精神萎靡、少動及目眥分泌物增多，運動明顯減少，剖腹可聞及惡臭味，腹腔可見少量腹水，大網(wǎng)膜滲出，死亡1只。銀杏葉片低劑量組大鼠體質(zhì)量稍增加，部分大鼠運動減少，體毛色澤稀疏，死亡1只。銀杏葉片高劑量組大鼠體質(zhì)量稍增加，體毛色澤稍稀疏。模型組與銀杏葉片低、高劑量組體質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；銀杏葉片低劑量組較高劑量組體質(zhì)量稍有增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（g±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（g±s）

注：與對照組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

組別對照組模型組銀杏葉片低劑量組銀杏葉片高劑量組鼠數(shù)10 11 9 10治療前194.98±11.16 201.45±8.30 195.29±10.21 201.13±8.11治療后228.04±12.51* 241.45±10.86▲223.90±13.27* 219.06±9.52*▲

3.2 肝指數(shù)改變 與對照組比較，模型組大鼠肝指數(shù)顯著增高（P＜0.01），與模型組比較，低、高劑量銀杏葉片治療組肝指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；兩治療組比較，低劑量銀杏葉片治療組肝指數(shù)有一些上升，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肝指數(shù)比較（%±s）

表2 各組大鼠肝指數(shù)比較（%±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別對照組模型組銀杏葉片低劑量組銀杏葉片高劑量組鼠數(shù)10 11 9 10 肝/體質(zhì)量比3.09±0.20** 3.71±0.35 3.30±0.26* 3.19±0.42*

3.3 肝功能指標檢測結(jié)果 與對照組比較，模型組大鼠總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽汁酸均升高（P＜0.01），白蛋白下降（P＜0.01）。與模型組比較，銀杏葉片高劑量組總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽汁酸均顯著下降（P＜0.01）、白蛋白上升（P＜0.05）；銀杏葉片低劑量組總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶均下降（P＜0.05）、白蛋白上升（P＜0.05），但總膽汁酸下降不明顯（P＞0.05）。銀杏葉片高、低劑量組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠肝功能比較（±s）

表3 各組大鼠肝功能比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；TBILI：總膽紅素；ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶；ALB：白蛋白；TBA：總膽汁酸

/L）ALT（U/L）AST（U/L）組別對照組模型組銀杏葉片低劑量組銀杏葉片高劑量組鼠數(shù)10 11 9 10 TBIL（μmol 1.32±0.65** 6.02±1.26 2.43±1.00** 2.28±0.55** 60.50±3.60** 143.54±23.25 117.44±35.24* 98.13±13.50** 143.40±18.13** 303.92±51.53 220.44±48.13* 198.20±41.64** ALB（g/L）34.47±1.10** 29.08±3.62 31.95±1.64* 32.48±1.33* TBA（μmol/L）23.35±5.18** 55.47±12.16 42.04±22.83 33.50±7.70**

3.4肝纖維化指標 與對照組比較，模型組透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原等均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，銀杏葉片組透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原等均有不同程度的降低，高劑量銀杏葉片組指標下降更明顯（P＜0.01）；銀杏葉片高、低劑量組間比較，Ⅳ型膠原差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余無顯著差異。見表4。

表4 各組大鼠肝纖維化指標比較（ng/mL±s）

表4 各組大鼠肝纖維化指標比較（ng/mL±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與低劑量組比較，△P＜0.05；HA：透明質(zhì)酸；PCⅢ；Ⅲ型前膠原；IV-C：IV型膠原

組別對照組模型組銀杏葉片低劑量組銀杏葉片高劑量組只數(shù)10 11 9 10 HA 106.44±8.32** 189.72±23.30 157.80±41.63* 162.63±13.48** PCⅢ7.63±0.67** 20.50±4.52 16.26±2.86* 14.40±1.73** IV-C 2.50±0.36** 3.86±0.94 3.16±0.76 2.58±0.36**△

3.5 肝組織病理學檢測 蘇木精—伊紅染色標本法觀察肝組織病理學變化發(fā)現(xiàn)：對照組大鼠擁有結(jié)構(gòu)完整的肝小葉，肝臟表面水潤有光澤，肝細胞以中央靜脈為中心，向四周略呈放射狀排列，模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不同程度的破壞，肝細胞變性、壞死，中央靜脈內(nèi)皮細胞受損、脫落，管腔變形狹窄，肝竇淤血、狹窄、閉塞，肝纖維化范圍較廣，呈片狀分布，部分肝細胞脂肪變性導致中央靜脈狹窄。銀杏葉片低劑量組HE染色主要表現(xiàn)為大部分肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整，局灶肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，部分肝區(qū)可見肝竇狹窄，匯管區(qū)纖維組織增生明顯，假小葉形成，但較模型組癥狀輕，銀杏葉片高劑量組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)完整，部分區(qū)肝細胞脂肪變性，可見散在的肝竇淤血及內(nèi)皮細胞損傷，匯管區(qū)纖維組織增生形成小的條索，尚未形成間隔改建肝小葉結(jié)構(gòu)（見封三圖1）。

4 討 論

HVOD是一種棘手的肝臟病變，病因可能與服用烷化劑類化療藥、吡咯類生物堿類植物（如狗舌草、土三七中毒可引起靜脈內(nèi)膜炎、靜脈纖維性改變）[6-7]和放射線照射有關。近幾年由于癌癥高發(fā)，放化療增多，HVOD患者越來越多。有關HVOD治療藥物的篩選、開發(fā)成為國際醫(yī)學領域研究的熱點[8-9]。

銀杏葉片具有改善心、肝、肺、腦等臟器的缺血再灌注損傷作用；對肝細胞的損傷、肝纖維化、肝硬變、肝癌亦有一定的治療作用，本實驗HVOD大鼠建立模型經(jīng)過預實驗篩選后，確定濃縮土三七灌胃劑量為7g/kg。

本實驗結(jié)果顯示，銀杏葉片50mg/（kg·d）、100mg/（kg·d），干預后各組HVOD模型大鼠的體毛、體質(zhì)量、食量、活動度等一般情況明顯好于模型組，且無大鼠出現(xiàn)腹水。大鼠AST、ALT、TBIL、HA、PCⅢ、IV-C等臨床和實驗室指標較模型組均有很大改善。與銀杏葉片50mg/（kg·d）治療組比較，銀杏葉片100mg/（kg·d）組大鼠肝功能、肝纖維化指標結(jié)果更接近于對照組，且Ⅳ型膠原指標差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

病理學顯示，土三七誘導大鼠成HVOD模型10只，以病理改變中度為主，肝小葉結(jié)構(gòu)不同程度的破壞，肝細胞變性、壞死，肝竇淤血、擴張，肝纖維化范圍較廣；銀杏葉片各劑量組大鼠發(fā)生慢性HVOD較少，銀杏葉片100mg/（kg·d）治療組6只大鼠出現(xiàn)輕度HVOD，肝纖維化不明顯；銀杏葉片50mg/（kg·d）治療組5只成模，且病理改變多以輕、中度為主，其中兩只大鼠出現(xiàn)中度肝纖維化，肝竇狹窄、淤血明顯，但病變程度較模型組減輕，說明銀杏葉片對HVOD發(fā)生有一定防治作用，可減少肝纖維化的發(fā)生。

［1］周燕萍，孫李建，于珊珊，等.土三七引起肝靜脈閉塞性疾病并致死亡［J］.藥物不良反應雜志，2012，14（5）：327-328.

［2］徐靜，汪茂榮.土三七導致肝小靜脈閉塞綜合征研究進展［J］.實用肝臟病雜志，2013，16（1）：94-96.

［3］李婉兒，陳芝蕓，嚴茂祥，等.銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠肝臟血小板衍生生長因子表達的影響［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，23（5）：339-341.

［4］宋宇，禹錚，樊艷華，等.土三七水煎劑所致肝小靜脈閉塞病大鼠模型的建立［J］.臨床肝膽病雜志，2011，27（8）：860-864.

［5］DeLeve LD，McCuskey RS，Wang X，et al.Characterization of a reproducible rat model of hepatic veno-occlusive disease ［J］.Hepatology，1999，29（6）：1779-1791.

［6］Chen MY，Cai JT，Du Q，et al.Reliable experimental model of hepatic veno-occhsive disease caused by monocrotaline ［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2008，7（4）：395-400.

［7］Chen Z，Huo JR.Hepatic veno-occlusive disease associated with toxicity of pyrrolizidine alkaloids in herbal preparations ［J］.Neth J Med，2010，68（6）：252-260.

［8］陳哲，霍繼榮，朱洪怡，等.川芎嗪對土三七誘導的肝小靜脈閉塞病小鼠肝組織PAI-1表達的影響［J］.中國醫(yī)科大學學報，2012，41（8）：709-712.

［9］楊麗，霍繼榮，朱洪怡，等.丹參對土三七誘導小鼠肝小靜脈閉塞病預防治療效果的觀察［J］.肝臟，2013，18（2）：105-107.

（收稿：2015-10-05 修回：2015-12-18）

Effect of Ginkgo Biloba Tablets on Gynura Segetum-induced Hepatic Veno-occlusive Disease in Rats

XULijun,CHEN Saizhen,XU Hongyan,LIN Lifen,TIAN Ziyou,CAO Xuequan,CHEN Wenju.Department of Pharmacy,Taizhou Central Hospital,Taizhou(318000),China

ObjectiveTo investigate the effects of Ginkgo biloba tablets on Gynura segetum-induced hepatic veno-occlusive disease in rats.MethodsForty-two female SD rats were randomly divided into 4 groups:control group（n=10）,model group（n=12）,low-dose and high-dose Ginkgo prophylaxis groups（n=10）.Control group was given distilled water.Model group was given Gynura segetum water decoction（7mL·kg-1·d-1）.Ginkgo prophylaxis groups received a mixture of gynura segetum water decoction（7mL·kg-1·d-1）and ginkgo biloba（50 or 100mg·kg-1·d-1）. All rats were sacrificed 4 weeks later to collect blood and liver samples.Serum biochemistry parameters were measured,the liver collagen expression and fibrosis were evaluated by using eosin（HE）staining.ResultsGinkgo prophylaxis groups showed decreased TBIL,ALT,AST,HA,and PCIII compared with model group（TBILI:2.43± 1.00μmol/L,2.28±0.55μmol/L vs 6.02±1.26μmol/L;ALT:117.44±35.24U/L,98.13±13.50U/L vs 143.54±23.25U/L; AST:198.20±41.64U/L,220.44±48.13U/L vs 303.92±51.53U/L;HA:157.80±41.63ng/mL,162.63±13.48ng/mL vs 189.72±23.30ng/mL;PCIII:16.26±2.86ng/mL,14.40±1.73ng/mL vs 20.50±4.52ng/mL;all P＜0.05）.The level of ALB was higher in Ginkgo biloba prophylaxis group than that in model group（31.95±1.64g/L,32.48±1.33g/L vs 29.08± 3.62g/L,P＜0.05）.IV collagen in high-dose Ginkgo biloba prophylaxis group was lower than that in low-dose Ginkgo biloba prophylaxis group（2.58±0.36ng/mL vs 3.16±0.76ng/mL,P＜0.05）.The pathological examination showed liver fibrosis decreased in both Ginkgo biloba prophylaxis groups,especially in high-dose group.ConclusionGinkgo biloba tablets have effect on prevention of HVOD-induced by Gynura segetum in rats.

rats;hepatic veno-occlusive disease;Ginkgo biloba tablets;Gynura segetum

浙江臺州恩澤醫(yī)療中心集團課題立項（No.11EEC10）

浙江省臺州市中心醫(yī)院藥劑科（徐利君、陳賽貞、徐紅燕、林利芬、田自有）、病理科（曹學全）、檢驗科（陳文舉）（臺州 318000）

徐利君，Tel：（0516）88551679；E-mail：xulijun_1985@163.com