石河子墾區(qū)鹽堿地土壤嗜(耐)鹽菌的分離與鑒定

趙 路，李木子，冉茂雙，雷勇輝，孫燕飛*(.石河子大學 生命科學學院，新疆 石河子 83003； .石河子大學 農學院，新疆 石河子 83003)

石河子墾區(qū)鹽堿地土壤嗜(耐)鹽菌的分離與鑒定

趙 路1，李木子1，冉茂雙1，雷勇輝2，孫燕飛1*
(1.石河子大學 生命科學學院，新疆 石河子 832003； 2.石河子大學 農學院，新疆 石河子 832003)

為了開發(fā)利用石河子墾區(qū)鹽堿地的嗜(耐)鹽菌資源，從該區(qū)鹽堿地土樣及池底泥樣中分離篩選嗜(耐)鹽菌，并從形態(tài)特征、生理生化特性、16S rRNA序列3個方面進行分析鑒定。結果表明，從土樣及泥樣中共分離獲得6 株嗜(耐)鹽菌。其中，SYJ-7是球菌，為革蘭氏陽性；其余5株是桿菌，均為革蘭氏陰性。在耐鹽、堿試驗中，6株菌均在NaCl質量濃度≤200 g/L、pH值≤9條件下生長，6株菌均為中度嗜鹽菌。SYJ-9耐鹽、堿程度最高，可耐受的最高NaCl質量濃度為280 g/L，最高pH值為13。在功能酶篩選試驗中，SYJ-3、SYJ-5、SYJ-7、SYJ-9產淀粉酶，SYJ-7產纖維素酶，SYJ-9產蛋白酶。16S rRNA序列分析表明，SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5屬于瑪納斯海洋芽孢桿菌(Oceanobacillusmanasiensis)，SYJ-7屬于玫瑰色鹽水球菌(Salinicoccusroseus)，SYJ-9屬于鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)。其中，SYJ-9可能為新種。

石河子墾區(qū)； 嗜(耐)鹽菌； 分離純化； 菌種鑒定

新疆石河子墾區(qū)地處天山北麓中段(84°58′～86°30′E、43°27′～45°20′N)[1]。在古生代以前，該地區(qū)地表風化殼及其析出的鹽類隨水由陸臺向地槽遷移，形成現(xiàn)在山系的含鹽底層(包括鹽山、鹽巖、鹽礦和石膏礦等)，在蒸發(fā)量大、降水稀少的高溫干旱氣候作用下，該區(qū)四周環(huán)繞的山地巖石和成土母質中的鈉鹽土通過微弱的季節(jié)性淋溶或地下水升降及潛水蒸發(fā)，在低平部位形成大面積的鹽土和堿土[2]。這種高鹽、高堿的土壤中蘊藏著豐富多樣的嗜(耐)鹽菌類群。嗜鹽菌是只在含鹽的環(huán)境才能生長的微生物，一般生長在鹽湖、鹽堿湖、死海、鹽場和海洋中[3]。根據對鹽的耐受程度和范圍，將鹽生生物分為6類：非嗜鹽菌，其最適生長鹽(NaCl)濃度<0.2 mol/L，主要是淡水微生物；輕度嗜鹽菌，其最適生長鹽濃度為0.2～0.5 mol/L，多數海洋微生物屬于這個類群；中度嗜鹽菌，其最適生長鹽濃度為0.5～2.5 mol/L；邊緣極端嗜鹽菌，其最適生長鹽濃度在1.5～4.0 mol/L；極端嗜鹽菌，其最適生長鹽濃度為2.5～5.2 mol /L；耐鹽菌，其生長對NaCl濃度沒有要求，其中對鹽分的耐受濃度超過2.5 mol/L的稱為極端耐鹽菌[4]。中度嗜鹽菌基本上是真細菌，極端嗜鹽菌屬于古細菌[5]。需要指出的是，一個中度嗜鹽菌菌株，其耐受鹽濃度范圍會隨著環(huán)境條件(如溫度、營養(yǎng)狀況等)的改變而不同。另外，也有人傾向于將中度嗜鹽菌的最佳生長NaCl質量濃度定為50～200 g/L[6]。

由于嗜(耐)鹽菌具有獨特的環(huán)境適應模式和特殊的生理機制，在高鹽生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，是極為寶貴的極端微生物資源，具有重要的研究和開發(fā)利用價值[7]。大量研究表明，嗜(耐)鹽菌既可用于環(huán)境治理，如高鹽廢水的處理[8-12]，也可用于鹽堿土的修復[13-15]。張桂玲[13]在中性偏堿的棉田中施用中度嗜鹽菌，發(fā)現(xiàn)短時間內土壤中細菌數量增加，真菌數量隨土壤pH值降低而增多。劉彩霞[14]從新疆、江蘇地區(qū)鹽堿土樣品中分離篩選獲得耐鹽堿分解秸稈和產胞外多糖的細菌，該細菌與外源有機物相互作用可改善植物根際環(huán)境、增加土壤酶活性、提高保水性能、促進鹽堿土團聚體的形成，從而改良鹽堿地土壤并提高植物的耐鹽性。Rao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，通過耐鹽堿微生物作用改善植物根際環(huán)境，可減輕鹽分對作物生長的抑制作用，并改良鹽堿地。新疆蘊含有豐富的嗜(耐)鹽菌資源，目前，已經從新疆眾多地區(qū)分離鑒定了很多嗜(耐)鹽菌，顧曉穎等[16]從巴里坤湖和瑪納斯湖水樣共分離得到51株嗜鹽菌；王建明等[17]從塔里木盆地荒漠鹽堿生境中分離到120株嗜(耐)鹽堿細菌，其中33株為嗜鹽堿細菌；迪麗拜爾等[18]從新疆艾丁湖及鄰近地區(qū)獲得嗜鹽菌61株，其中3株為新種；劉會強等[19]從新疆達坂城鹽湖中分離得到17株中度嗜鹽菌。但對于石河子墾區(qū)鹽堿地土壤嗜(耐)鹽菌的分離、鑒定研究罕有報道。為此，從石河子墾區(qū)鹽堿地土樣及附近即將干涸的池底泥樣中分離篩選嗜(耐)鹽菌，并對其進行鑒定，以期為鹽堿地土壤的微生物修復及高鹽廢水的治理提供菌種資源。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

取石河子墾區(qū)鹽堿地土樣及附近即將干涸的池底泥樣置于塑料袋中運回實驗室，用于菌株培養(yǎng)分析。

1.2 培養(yǎng)基

基礎培養(yǎng)基：酸性酪蛋白5.0 g/L、檸檬酸鈉3.0 g/L 、酵母浸粉10.0 g/L、KCl 2.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、MgSO4·7H2O 2.0 g/L、NaCl 150 g/L、瓊脂20.0 g/L，調節(jié)pH值為7.5。

Gibbions改良培養(yǎng)基：酸性酪蛋白5.0 g/L、檸檬酸鈉3.0 g/L、酵母浸粉10.0 g/L、KCl 2.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、MgSO4·7H2O 2.0 g/L、NaCl 200 g/L、瓊脂20.0 g/L，調節(jié)pH值為7.5。

淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶篩選培養(yǎng)基見文獻[4,20]。

1.3 菌株的分離

采用Gibbions改良培養(yǎng)基，以微生物能夠在200 g/L NaCl分離平板上生長作為嗜(耐)鹽菌的分離依據，通過稀釋涂布法和畫線法分離純化嗜(耐)鹽菌。待菌落長出后，根據菌落大小、形態(tài)、顏色不同進行初步分類，反復劃線分離，純化菌株冷藏保存。

1.4 菌株形態(tài)和生理生化特性分析

1.4.1 菌株形態(tài)分析 取少量菌體，接種在Gibbions改良培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)。于37 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3～4 d，記錄平板表面單菌落特征(形態(tài)、大小、顏色、透明程度、邊緣和凸起等)。并經2%乙酸固定脫鹽后采用常規(guī)革蘭氏染色法在光鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.4.2 菌株生理生化特性分析 對菌落進行革蘭氏染色，并進行產酶試驗，淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶初篩方法見文獻[21-22]。

耐鹽性試驗：在基礎培養(yǎng)基中，加入NaCl，使其質量濃度分別為100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300 g/L。在含有不同質量濃度NaCl的培養(yǎng)基平板上接種菌株，37 ℃培養(yǎng)7～15 d，觀察并記載生長情況。

耐堿性試驗：將基礎培養(yǎng)基(NaCl加入量為150 g/L)的初始pH值分別調至7、8、9、10、11、12、13，然后接種菌種，37 ℃培養(yǎng)7～15 d，觀察并記載生長情況。

1.5 基于16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

采用CTAB法提取細菌DNA，菌株16S rRNA基因片段的PCR擴增引物采用細菌通用引物27F和1492R。PCR擴增體系為25 μL：10×buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL、MgCl21.5 μL、27F 1 μL、1492R 1 μL、DNA模板 1 μL、Taq酶 0.25 μL、ddH2O 15.75 μL。PCR程序為：94 ℃ 5 min(預變性)；95 ℃ 30 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 75 s，34個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR產物送測序公司(上海生工)測序。將測得的16S rRNA序列在GenBank中進行BLAST比對，并采用MEGA 6.0軟件中的Clustal W刪除序列匹配排列中出現(xiàn)的插入和缺失。通過序列數據計算矩陣距離，然后使用Neighbor-joining方法構建系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 嗜(耐)鹽菌的菌株形態(tài)及生理生化特性

根據分離平板NaCl質量濃度以及菌落形態(tài)差異去掉部分冗余菌株，最終從14個分離物中確定了6個表型特征不同的菌株，對6株嗜(耐)鹽菌的菌落形態(tài)、菌體形態(tài)及一些生理生化特性研究(表1、圖1、表2)發(fā)現(xiàn):SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5、SYJ-9均為桿菌，革蘭氏染色均為陰性，但SYJ-9菌體長寬比較小，菌體形狀呈短桿狀；SYJ-7為球菌，革蘭氏染色為陽性，菌落為橙紅色，表面凸起；SYJ-9菌落形態(tài)與SYJ-7相似，但SYJ-9菌落顏色為白色，表面微凸；其余4株菌的菌落形態(tài)相似。單從菌落及菌體形態(tài)上看，SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5可能為同一類，SYJ-7為一類，SYJ-9為一類。6株嗜(耐)鹽菌的產酶結果(表2)表明，4株 可以產淀粉酶，分別為SYJ-3、SYJ-5、SYJ-7、SYJ-9；6株均不產木聚糖酶； 1株可以產纖維素酶，為SYJ-7；1株可以產纖蛋白酶，為SYJ-9。

表1 6株嗜(耐)鹽菌的菌落形態(tài)

A、C、E、G、I、K分別為SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5、SYJ-7、SYJ-9菌株的菌體形態(tài)； B、D、F、H、J、L分別為SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5、SYJ-7、SYJ-9菌株的菌落形態(tài)

項目SYJ-1SYJ-2SYJ-3SYJ-5SYJ-7SYJ-9項目SYJ-1SYJ-2SYJ-3SYJ-5SYJ-7SYJ-9菌體形態(tài)長桿狀長桿狀長桿狀長桿狀球形短桿狀木聚糖酶------革蘭氏染色----+-纖維素酶----+-淀粉酶--++++蛋白酶-----+

注： +表示陽性；-表示陰性。

2.2 嗜(耐)鹽菌的耐鹽性生長狀況

耐鹽試驗結果(表3)表明，6株嗜(耐)鹽菌均能在含≤200 g/L NaCl的培養(yǎng)基中生長，SYJ-1與SYJ-2可耐受的最高NaCl質量濃度為200 g/L；SYJ-3、SYJ-5、SYJ-7可耐受的最高NaCl質量濃度為220 g/L；SYJ-9可耐受的最高NaCl質量濃度為280 g/L。其中，SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3在含≤140 g/L NaCl的培養(yǎng)基中均能夠旺盛生長，SYJ-5、SYJ-7、SYJ-9在含≤180 g/L NaCl的培養(yǎng)基中均能夠旺盛生長。綜上，SYJ-9的耐鹽性最高，其次是SYJ-3、SYJ-5、SYJ-7，SYJ-1、SYJ-2的耐鹽性較低。由于SYJ-1能在含≤140 g/L NaCl的環(huán)境中旺盛生長，SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5、SYJ-7均能在含≤180 g/L NaCl的環(huán)境中良好生長，SYJ-9能在含≤200 g/L NaCl的環(huán)境中良好生長，各菌株超過上述NaCl質量濃度則生長不佳，甚至不能生長。因此，6株菌不屬于邊緣極端嗜鹽菌和極端嗜鹽菌，可初步鑒定為中度嗜鹽菌，且其生長的最佳鹽濃度可能與培養(yǎng)溫度、營養(yǎng)狀況有關[6]。

表3 6株嗜(耐)鹽菌的耐鹽性生長狀況

注：+++表示生長旺盛；++表示生長良好；+表示能生長；-表示不能生長。下同。

2.3 嗜(耐)鹽菌的耐堿性生長狀況

耐堿試驗結果(表4)表明，SYJ-1可耐受的最高pH值為9，SYJ-2可耐受的最高pH值為10，SYJ-3與SYJ-5可耐受的最高pH值為11，SYJ-7可耐受的最高pH值為12，SYJ-9可耐受的最高pH值為13。其中，SYJ-7在pH值≤10的培養(yǎng)基上均能夠旺盛生長，SYJ-9在pH值≤11的培養(yǎng)基上均能夠旺盛生長，其他菌株總體上不能夠達到旺盛生長的狀態(tài)，最多只是良好生長。綜上，SYJ-9的耐堿性最高，其次為SYJ-7，SYJ-1的耐堿性最低。

表4 6株嗜(耐)鹽菌的耐堿性生長狀況

2.4 基于16S rRNA序列的嗜(耐)鹽菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

研究表明，當菌株16S rRNA序列同源性≥97%時可以認為屬于一個屬，當序列同源性≥98%時則可以認為屬于一個種[23]。對6株嗜(耐)鹽菌的16S rRNA序列進行BLAST比對并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖2)發(fā)現(xiàn)，SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5的16S rRNA序列與瑪納斯海洋芽孢桿菌(Oceanobacillusmanasiensis)的16S rRNA序列相似性為99%～100%，因此SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5屬于瑪納斯海洋芽孢桿菌(Oceanobacillusmanasiensis)；SYJ-7的16S rRNA序列與玫瑰色鹽水球菌(Salinicoccusroseus)的16S rRNA序列有98%的相似性，因此初步判斷SYJ-7屬于玫瑰色鹽水球菌(Salinicoccusroseus)；SYJ-9的16S rRNA序列與鹽芽孢桿菌(Halobacillus)的16S rRNA序列有97%的相似性，故判斷其屬于鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)，具體種還需進一步鑒定，暫且命名為Halobacillussp.SYJ-9。

3 結論與討論

從石河子墾區(qū)鹽堿地土樣及泥樣中分離出6株嗜(耐)鹽細菌，分別命名為SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5、SYJ-7、SYJ-9。SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5菌落形態(tài)及菌體形態(tài)相似，但生理生化特性存在差異。其中，SYJ-1、SYJ-2的耐鹽及耐堿性較SYJ-3、SYJ-5低，且SYJ-3、SYJ-5為產淀粉酶菌株。經16S rRNA序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，SYJ-1、 SYJ-2、 SYJ-3、SYJ-5屬于瑪納斯海洋芽孢桿菌(Oceanobacillusmanasiensis)，SYJ-1、SYJ-2與SYJ-3、SYJ-5可能分屬2個不同亞種，還需做進一步鑒定。SYJ-7為革蘭氏陽性菌且菌體為球狀，能產淀粉酶和纖維素酶，屬于玫瑰色鹽水球菌(Salinicoccusroseus)。SYJ-9為革蘭氏陰性菌且菌體為短桿狀，能產淀粉酶和蛋白酶，屬于鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)，暫且命名為Halobacillussp.SYJ-9。李新等[24]研究表明，Halobacillussp.LY6屬于高產蛋白酶中度嗜鹽菌，本研究中的Halobacillussp.SYJ-9蛋白酶活性強度還需進一步測定。

圖2 基于16S rRNA序列構建的菌株系統(tǒng)發(fā)育進化樹

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Isolation and Identification of Halophilic(Halotolerant) Microorganisms from Saline-alkaline Soils in Shihezi

ZHAO Lu1,LI Muzi1,RAN Maoshuang1,LEI Yonghui2,SUN Yanfei1*
(1.College of Life Sciences,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2.College of Agriculture,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

In order to explore and utilize the resources of halophilic(halotolerant) microorganisms from saline-alkaline soils in Shihezi,the saline-alkaline soil mud samples were separated and purified in Shihezi,and the strains were identified through the morphological characteristics,physiological and biochemical characteristics,the 16S rRNA sequences.The experiment result showed that 6 halophilic(halotolerant) strains were obtained,SYJ-7 was coccus,Gram positive;the rest of the 5 strains were bacillus,Gram negative.Six strains could grow under the conditions of NaCl concentration≥200 g/L and pH value≥9,belonged to moderate halophytic bacteria.Among them,SYJ-9 had high levels of salt and alkali resistance,with the highest pH value of 13 and NaCl concentration of 280 g/L.SYJ-3,SYJ-5,SYJ-7,SYJ-9 produced amylase,SYJ-7 produced cellulose enzyme,SYJ-9 produced protease.16S rRNA sequences analysis showed that SYJ-1,SYJ-2,SYJ-3 and SYJ-5 belonged toOceanobacillusmanasiensis,SYJ-7 belonged toSalinicoccusroseus,SYJ-9 belonged toHalobacillus.SYJ-9 may be the potential novel species.

reclamation area of Shihezi; halophilic(halotolerant) microorganisms; separation and purification; identification of strains

2015-12-10

石河子大學第13期SRP項目(SRP2015092)；石河子大學高層次人才啟動項目(RCZX201427)

趙 路(1995-)，女，河南鶴壁人，在讀本科生，研究方向：微生物學。E-mail:1270541716@qq.com

*通訊作者：孫燕飛(1976-)，女，新疆石河子人，副教授，博士，主要從事微生物學研究。E-mail：syfei@shzu.edu.cn

S154.3

A

1004-3268(2016)06-0051-05