植物B12D基因克隆研究進(jìn)展

周延清，王向楠，張永華，張 喻，王慧娜，段紅英(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453007)

植物B12D基因克隆研究進(jìn)展

周延清，王向楠，張永華，張 喻，王慧娜，段紅英
(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453007)

綜述了植物B12D基因的克隆、特性、時(shí)空表達(dá)、亞細(xì)胞定位、異源表達(dá)、過(guò)表達(dá)、生物和非生物脅迫應(yīng)答、響應(yīng)脫落酸與赤霉素等激素調(diào)節(jié)等方面的研究進(jìn)展，展望了采用分子生物學(xué)新技術(shù)研究其調(diào)節(jié)植物脅迫應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制和改良作物品質(zhì)的發(fā)展趨勢(shì)，為利用其進(jìn)行植物耐脅迫和品質(zhì)改良提供參考。

植物; B12D基因; 生物脅迫; 非生物脅迫; 基因功能

植物B12D基因首次在大麥中發(fā)現(xiàn)，是一類與大麥糊粉粒和胚發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)基因[1]。之后，從苔蘚植物、裸子植物以及擬南芥[2]、木欖木[3]和水稻[4]等被子植物中克隆得到多種B12D基因。前人已經(jīng)對(duì)此類基因的克隆、序列、所編碼蛋白質(zhì)的理化特性、空間結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位[5]、非生物脅迫和生物脅迫應(yīng)答機(jī)制等進(jìn)行了研究[6-9]，發(fā)現(xiàn)其與植物對(duì)多種生物脅迫和非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)，受脫落酸和赤霉素等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的調(diào)節(jié),參與脂肪酸β-氧化、能量代謝和糖代謝?；谥参顱12D基因在植物界分布的廣泛性和功能的多樣性，綜述了植物B12D基因的克隆、表達(dá)和脅迫應(yīng)答等方面的研究進(jìn)展，旨在為深入研究其功能和在植物品種定向改良方面的應(yīng)用提供參考。

1 B12D基因的克隆與特性研究

自從Aalen 等[1]首次從大麥中分離獲得有關(guān)灌漿和胚發(fā)育的B12D基因以來(lái)，一些學(xué)者從小立碗蘚(PHYPADRAFT_223334)等苔蘚植物、北美云杉(ABK24106)等裸子植物以及擬南芥[2]、水稻和地黃等被子植物中分離獲得B12D基因。用于分離該基因的技術(shù)方法有逆轉(zhuǎn)錄PCR[1，10]、cDNA文庫(kù)[11]、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[12]、基因芯片[13]、差異顯示[14]、抑制差減雜交、表達(dá)序列標(biāo)簽和數(shù)量性狀位點(diǎn)作圖[15]、鳥(niǎo)槍法亞克隆和測(cè)序[16]、精細(xì)作圖[17]、cDNA-限制性長(zhǎng)度多態(tài)性[18]、全基因組分析[19]、蛋白質(zhì)組學(xué)[20]、抑制差減雜交和微陣列[21]等。已經(jīng)克隆的植物B12D基因多為cDNA，少數(shù)為基因組DNA[20]，全長(zhǎng)cDNA包括ORF、3′-非翻譯區(qū)和5′-非翻譯區(qū)[10]，而在基因組中B12D基因包括大小可變性內(nèi)含子、2～3個(gè)外顯子、3′-非翻譯區(qū)和5′-非翻譯區(qū)。有些植物種的B12D基因有多個(gè)成員，例如，水稻OsB12Ds基因有6個(gè)成員[20]，大麥B12D基因可能有8～9個(gè)成員[6]。B12D基因編碼的蛋白質(zhì)多為由76～134個(gè)氨基酸殘基組成的低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)[20]，具有疏水N-端的膜錨定蛋白[22]，彼此間具有相當(dāng)高的同源性，如地黃B12D蛋白與其他38種植物的B12D蛋白具有54%～88%的氨基酸同源性(表1)。

表1 地黃與其他植物的B12D蛋白同源性

注：AAH代表氨基酸序列的同源性。

2 植物B12D基因的表達(dá)研究

目前，植物B12D基因的時(shí)空表達(dá)、瞬時(shí)表達(dá)(亞細(xì)胞定位)、異源表達(dá)和過(guò)表達(dá)研究均有一些報(bào)道。在植物B12D基因的時(shí)空表達(dá)方面，利用Nor-thern blot技術(shù)檢測(cè)到大麥花不同發(fā)育時(shí)間胚乳中均有B12D基因的轉(zhuǎn)錄本，用引物延伸分析技術(shù)檢測(cè)到B12D基因在成熟大麥種子和不成熟大麥種子中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA，用基因槍法將該B12D基因的啟動(dòng)子和gus基因轉(zhuǎn)入未成熟大麥種子細(xì)胞，gus基因在其未成熟糊粉層和胚中表達(dá)，而且甘露醇抑制啟動(dòng)子啟動(dòng)gus基因表達(dá)[6]；采用Reverse Northern分析證明，番木瓜根B12D基因(Cp27-2)在番木瓜根、葉、花、果實(shí)和下胚軸中均表達(dá)，而且其葉和果實(shí)中的表達(dá)量均低于其他3種組織中的表達(dá)量[23]；熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，甘蔗B12D基因(ScB12D)[11]、水稻B12D基因(OsB12D1)[20]和地黃B12D基因(RghBNG)[10]分別在其各自同一發(fā)育階段的不同組織中不同程度地表達(dá)，在其不同發(fā)育階段的不同組織中不同程度地表達(dá)，產(chǎn)生mRNA。這些結(jié)果表明，植物B12D基因與植物生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。

在植物B12D基因瞬時(shí)表達(dá)方面，與植物衰老相關(guān)的B12D基因編碼一類存在于植物葉過(guò)氧物酶體蛋白組中的靶信號(hào)受體蛋白質(zhì)，其C-端與綠色熒光蛋白的融合蛋白定位于過(guò)氧物酶體[5]；生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，甘蔗ScB12D蛋白定位于質(zhì)膜或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜[11]，擬南芥B12D蛋白定位于線粒體中[5]或者過(guò)氧物酶體中[21]，水稻OsB12D蛋白定位于過(guò)氧物酶體中[21]或者線粒體中[20]，地黃RghBNG蛋白定位在細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)中[24]。其中，3項(xiàng)研究[5，11,25]結(jié)果表明，B12D蛋白參與能量代謝。這些結(jié)果表明，不同植物B12D蛋白位于不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。但是，“B12D蛋白是線粒體膜中NADH-輔酶還原酶復(fù)合體1-MLRQ 亞基中的一種”[4]的觀點(diǎn)支持B12D蛋白定位于線粒體的結(jié)果。

在植物B12D基因異源表達(dá)方面，把地黃RghBNG基因克隆到原核表達(dá)載體pET-32a，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-32a-RghBNG，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，成功地誘導(dǎo)表達(dá)出RghBNG蛋白[26]。

在植物B12D基因過(guò)表達(dá)方面，把水稻OsB12D1基因的全長(zhǎng)cDNA克隆入改良載體PUC1301中，形成過(guò)表達(dá)載體pUbi-OsB12D1-FLAG，經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)入水稻，獲得PCR鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因水稻T0和經(jīng)過(guò)qRT-PCR和Western blot鑒定為陽(yáng)性的T2代品系，可以提高水稻在種子萌發(fā)和早期苗生長(zhǎng)階段的耐淹性[20]。

3 植物B12D基因的脅迫應(yīng)答反應(yīng)研究

植物的脅迫應(yīng)答反應(yīng)可以通過(guò)其特定基因的誘導(dǎo)表達(dá)得以實(shí)現(xiàn)。植物B12D基因?qū)ι锖头巧锩{迫均有應(yīng)答反應(yīng)。

在生物脅迫方面，差示篩選分析表明，B12D類基因FC325315在長(zhǎng)喙殼從頭螨侵染的美國(guó)榆樹(shù)愈傷組織中上調(diào)表達(dá)[15]；用地毯草黃單胞菌接種木薯7 d，其莖中B12D類基因的cDNA(CK646830)表達(dá)上調(diào)5.5倍[27]；B12D基因在真菌誘導(dǎo)子處理的水稻懸浮培養(yǎng)物中上調(diào)表達(dá)[28]；大豆銹菌感染大豆使B12D基因Gma.6327.1.S1s＿at上調(diào)表達(dá)[18]；根結(jié)線蟲(chóng)感染使花生根中B12D類基因Contig7的轉(zhuǎn)錄上調(diào)3.99倍[13]。另一方面，有些生物脅迫使B12D基因下調(diào)表達(dá)，例如，煙草脆裂病毒侵染抗番茄黃曲葉病毒的番茄，導(dǎo)致B12D類基因SGN-U576939的有限表達(dá)[29]；黑森癭蚊侵害具有黑麥第2號(hào)染色體長(zhǎng)臂(賦予對(duì)L型黑森癭蚊的抗性)的小麥近等基因系，導(dǎo)致B12D類基因差異表達(dá)[19]；黑穗病脅迫下甘蔗ScB12D基因表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)[11]。

在非生物脅迫方面，實(shí)時(shí)定量PCR表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，除草劑莠去津處理水稻使其根中B12D基因Os07g41340上調(diào)表達(dá)[4]；NaCl脅迫使甘蔗ScB12D基因[11]、紅樹(shù)植物木欖根中B12D類基因Bg04-08_B20[3]和地黃RghBNG基因[10]表達(dá)量增加；重金屬鉻和汞誘導(dǎo)地黃RghBNG基因[10]表達(dá)；斑點(diǎn)雜交和諾瑟斑點(diǎn)雜交表明，汽油脅迫使狗牙根根中B12D類基因CdR311上調(diào)表達(dá)[16]；在水稻衰老過(guò)程中B12D基因上調(diào)表達(dá)[28]；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，B12D基因Bvb12d在17 ℃和28/26 ℃下的甜菜儲(chǔ)藏根中上調(diào)表達(dá)[17]；高溫處理促進(jìn)水稻 OsB12Ds表達(dá)，水稻B12D基因OsB12D1對(duì)缺氧、淹水和洪水反應(yīng)積極，水稻基因Os07g17330受鹽和疊氮鈉誘導(dǎo)表達(dá)[20]。另一方面，4個(gè)水稻OsB12Ds的表達(dá)被甘露醇顯著抑制，對(duì)低濃度過(guò)氧化氫不敏感，對(duì)鹽、溫度、水楊基氧污酸、疊氮鈉和淹漬有不同程度的反應(yīng)，LOC_Os07g41340被甘露醇、高濃度過(guò)氧化氫、水楊基氧污酸和水淹漬抑制[20]；擬南芥FUSCA3轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)種子成熟和休眠，在32 ℃下抑制種子萌發(fā)，轉(zhuǎn)該轉(zhuǎn)錄因子基因(FUS3)的擬南芥種子在32 ℃下一定時(shí)間內(nèi)下調(diào)其B12D類基因At3g48140[12]。大麥糊粉層的B12D類基因HV_CEa0011J09r2_at在大麥制麥過(guò)程中表達(dá)，降低麥芽膏的含量，提高麥芽β-葡聚糖含量[19]。因?yàn)槔硐氲钠【瀑|(zhì)量特征要求高麥芽膏量和低麥芽β-葡聚糖含量[30]，所以該基因在大麥品系中的表達(dá)影響大麥這2個(gè)啤酒質(zhì)量性狀[19]。

在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)植物B12D基因表達(dá)方面，脫落酸誘導(dǎo)甘蔗ScB12D基因[11]、大麥B12D基因[7]和一些水稻OsB12Ds基因表達(dá)量升高[20]。因?yàn)槊撀渌崮軌蛟诜N子萌發(fā)與休眠、低溫、氣孔關(guān)閉、離子滲透和干旱等非生物脅迫應(yīng)答和生物脅迫應(yīng)答中起重要的調(diào)控作用[11]，所以，B12D 基因與植物響應(yīng)脅迫的應(yīng)答機(jī)制有關(guān)。赤霉素誘導(dǎo)大麥[7]、有些水稻OsB12Ds基因[20]和地黃B12D類基因RghBNG[10]上調(diào)表達(dá)。NAA和6-BA上調(diào)地黃B12D類基因RghBNG[10]表達(dá)。

4 展望

迄今，學(xué)者對(duì)植物B12D基因的克隆、特性、表達(dá)和脅迫應(yīng)答反應(yīng)等進(jìn)行了多項(xiàng)研究，發(fā)現(xiàn)植物B12D基因廣泛分布于苔蘚植物、裸子植物和被子植物中，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，對(duì)多種生物脅迫和非生物脅迫產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)。因此，B12D基因?qū)χ参锷L(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答反應(yīng)具有重要作用。但是，對(duì)B12D基因的研究仍然存在一些缺陷，譬如，對(duì)植物B12D基因作用的分子機(jī)制及其應(yīng)用研究比較少。對(duì)已經(jīng)研究的B12D基因而言，能夠確定其功能和作用機(jī)制的研究也不夠深入。所以，將來(lái)隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)(尤其是omics技術(shù))的不斷發(fā)展和廣泛應(yīng)用，必將采取RNAi技術(shù)、基因敲除技術(shù)、酵母雙雜交技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等技術(shù)有效而全面地探索B12D基因作用的分子機(jī)制，驗(yàn)證其功能，了解其調(diào)控植物抵抗生物脅迫和非生物脅迫的作用機(jī)制，通過(guò)基因工程技術(shù)培育抗逆植物新品種。另外，最近研究發(fā)現(xiàn)，B12D蛋白參與脂肪酸β-氧化過(guò)程[31],這對(duì)改良作物品質(zhì)具有重要價(jià)值。

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Research Progress on Cloning of Plant B12D Genes

ZHOU Yanqing,WANG Xiangnan,ZHANG Yonghua,ZHANG Yu,WANG Huina,DUAN Hongying
(College of Life Sciences，Henan Normal University,Xinxiang 453007，China)

The research progresses on the cloning,characteristics,temporal and spatial expression,subcellular localization,prokaryotic expression,overexpression,biotic and abiotic stress responses,response to ABA,GA3 and other plant growth regulators of plant B12D genes were reviewed,and the trends in the stress response mechanisms and the plant qualities improvement with B12D genes using molecular techniques were put forward.This paper provides some references for the plant improvement of quanlity and stress tolerance with B12D genes in the future.

plants; B12D gene; biotic stress; abiotic stress; gene function

2016-01-04

NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金項(xiàng)目(U1304304)；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(14B180028)

周延清(1963-)，男，河南鄧州人，教授，主要從事遺傳學(xué)教學(xué)、遺傳與生物技術(shù)研究。E-mail:yqzhou@htu.cn

S336;Q943.2

A

1004-3268(2016)06-0001-05