石刁柏雄性偏向核質(zhì)體DNA的克隆與分析

李書粉，李 旭，王冰肖，袁金紅，鄧傳良，高武軍

(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 河南新鄉(xiāng) 453007)

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石刁柏雄性偏向核質(zhì)體DNA的克隆與分析

李書粉，李 旭，王冰肖，袁金紅，鄧傳良，高武軍*

(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 河南新鄉(xiāng) 453007)

該研究以雌雄異株植物石刁柏為材料，利用基因組消減雜交技術(shù)對(duì)石刁柏雌雄核基因組中的性別差異核質(zhì)體DNA(nuclear plastid DNA，NUPTs)進(jìn)行了分離和分析。結(jié)果表明：(1)通過構(gòu)建消減雜交文庫共獲得了52個(gè)雄性偏向序列，序列長(zhǎng)度分布在63～297 bp之間，其中有19個(gè)差異序列屬于葉綠體來源序列(命名為Ao1～Ao19)，且這些序列與石刁柏葉綠體基因組的相似性均大于84%，Ao19與石刁柏葉綠體基因組相似性為100%。(2)利用基因組半定量PCR對(duì)19個(gè)NUPTs序列的性別差異分析表明，有4條序列為穩(wěn)定的雄性偏向NUPTs序列，分別為Ao1、Ao3、Ao10和Ao18。(3)序列比對(duì)表明，轉(zhuǎn)移到核基因組的NUPTs主要來源于葉綠體基因組的反向重復(fù)區(qū)(包含IRa和IRb區(qū))，說明石刁柏葉綠體基因組重復(fù)區(qū)序列更容易向核基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)移形成雄性偏向的NUPTs序列。

石刁柏；性別差異；核質(zhì)體DNA；雄性偏向

Cloning and Analysis of Male-biased Nuclear Integrants

植物細(xì)胞中存在細(xì)胞器基因組和細(xì)胞核基因組，細(xì)胞器DNA能夠轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核從而形成核質(zhì)體DNA(nuclear integrants of plastid DNA，NUPTs)和核線粒體DNA(nuclear integrants of mitochondria DNA，NUMTs)[1]。其中，NUPTs主要是葉綠體起源的DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并整合到核基因組中形成的[2]。目前，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[3]、水稻(Oryzasativa)[4]、煙草(Nicotianatabacum)[5-6]等多個(gè)植物基因組中均發(fā)現(xiàn)存在NUPTs序列。核質(zhì)體DNA的插入是真核生物基因組進(jìn)化的重要?jiǎng)恿7]。一些研究表明，葉綠體來源的大片段DNA序列的插入會(huì)通過逐步衰減[8-9]或擴(kuò)增來影響染色體的結(jié)構(gòu)及演化過程[10]。

被子植物性染色體相對(duì)于哺乳動(dòng)物來說在進(jìn)化上較為年輕，因此是研究性染色體起源和演化的重要模式材料。研究表明，NUPTs的插入也可能參與了植物性染色體的演化過程。對(duì)雌雄異株植物酸模(Rumexacetosa)和白麥瓶草(Silenelatifolia)葉綠體基因組序列進(jìn)行染色體定位發(fā)現(xiàn)，在這2個(gè)物種中核基因組中的葉綠體DNA主要累積在Y染色體上，甚至在酸模整條Y染色體上都散布有NUPTs序列[11]，而白麥瓶草Y染色體上的NUPTs主要分布于著絲粒位置[11]。這些有限的證據(jù)表明，NUPTs在Y染色體上并非隨機(jī)分布，尤其是在白麥瓶草Y染色體上NUPTs分布于不易發(fā)生重復(fù)的著絲粒及其側(cè)翼區(qū)域，說明NUPTs可能參與了XY性染色體之間重組抑制的形成。但是，目前由于該方面研究結(jié)果較少，且僅限于少數(shù)模式材料，因此NUPTs和植物性染色體之間的關(guān)系仍需要進(jìn)一步研究。

石刁柏是一種重要的多年生雌雄異株草本植物，具有2n=2x=20條染色體，其性染色體X和Y同型[12]，表明其性染色體仍處于進(jìn)化的早期階段，是研究性染色體起源較為理想的材料之一。但是，石刁柏性染色體上是否存在NUPTs序列，其分布特征如何等仍未見報(bào)道。因此，本研究采用雌雄基因組消減雜交方法，分離分析石刁柏核基因組中的性別差異NUPTs序列，為進(jìn)一步分析NUPTs與石刁柏性染色體起源和演化的關(guān)系提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

石刁柏(Asparagusofficinalis)品種“UC309”種植于河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地，植株性別通過花器官鑒定。

1.2 方 法

1.2.1 石刁柏DNA提取及檢測(cè) 石刁柏DNA用CTAB法進(jìn)行提取，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[10]。

1.2.2 石刁柏雌雄基因組消減雜交 基因組消減雜交是通過驅(qū)趕DNA(driver)和檢測(cè)DNA(tester)基因組之間的差異來分離不同基因型間差異序列的方法。在此，以過量的石刁柏雌性基因組DNA作為driver，適量的雄性基因組DNA作為tester，通過消減雜交以獲得石刁柏雄性特異或偏向序列。具體步驟參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。取25 μg雄株基因組DNA，加入MboI (10 U/μL) 2.5 μL，在金屬浴37 ℃條件下處理9 h進(jìn)行酶切，酶切后用純化試劑盒進(jìn)行回收。將酶切產(chǎn)物和125 μg雌性DNA(在沸水浴中放置60 min進(jìn)行破碎)混合煮沸15 min變性。反應(yīng)物室溫下混合振動(dòng)(100 r/min)復(fù)性72 h。將產(chǎn)物用氯仿抽提2次，乙醇沉淀。

將3×10-8μmol去磷酸化處理后的載體PUC119和3×10-7μmol消減產(chǎn)物進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化操作根據(jù)文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。挑取陽性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，篩選插入片段為120 bp以上單克隆進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.3 雌雄性別差異序列的斑點(diǎn)雜交 取1.5 μL菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別以雌雄基因組DNA為探針，根據(jù)文獻(xiàn)[15]方法進(jìn)行斑點(diǎn)雜交。探針的標(biāo)記按照Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2.0(Takara，大連，中國)和DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit試劑盒(Roche，Switzerland)說明書進(jìn)行。根據(jù)斑點(diǎn)雜交結(jié)果，篩選出雌雄信號(hào)差異顯著的單克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 NUPTs的鑒定及雌雄差異性驗(yàn)證 將測(cè)序得到的差異序列，用Blast進(jìn)行同源搜索，篩選出與葉綠體基因組有關(guān)的序列。采用Primer 6設(shè)計(jì)引物(表1)，分別以石刁柏雌雄基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證其性別差異性。

表1 引物序列匯總表

根據(jù)所得序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行基因組半定量分析，每對(duì)引物用3個(gè)雌性DNA模板和3個(gè)雄性DNA模板，以18S為內(nèi)參。擴(kuò)增總體系25 μL，分別加入模板DNA(質(zhì)量濃度30 ng/μL)1.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 1.5 μL，引物(10 μmol/L)各0.5 μL，Taq酶0.1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，不同退火溫度下1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 性別差異序列的基因組拷貝數(shù)分析 利用本實(shí)驗(yàn)室對(duì)石刁柏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)[16]，運(yùn)用bowtie2軟件[17]對(duì)所得雄性偏向NUPTs進(jìn)行拷貝數(shù)估計(jì)。

1.2.6 性別差異NUPTs序列的葉綠體基因組定位 采用DNAMAN軟件對(duì)性別差異NUPTs序列和石刁柏葉綠體基因組進(jìn)行序列比對(duì)，以確定這些性別差異NUPTs序列在石刁柏葉綠體基因組的定位，也即來源于葉綠體基因組的具體區(qū)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 石刁柏雌雄株基因組DNA酶切及破碎

石刁柏雄性基因組DNA在100 μL體系下，經(jīng)過MboI酶切9 h，電泳結(jié)果表明，酶切產(chǎn)物呈現(xiàn)均勻彌散狀(圖1，A)。說明酶切效果良好，可以用做Tester DNA。雌性基因組DNA經(jīng)沸水浴處理 60 min，電泳結(jié)果顯示，DNA破碎片段呈連續(xù)彌散，片段大小在250～1 000 bp之間，主亮帶集中在500 bp左右(圖1，B)，達(dá)到用做driver DNA的要求。

2.2 雌雄基因組DNA消減文庫克隆及篩選

處理后的雄性DNA與雌性DNA消減雜交后，將消減雜交液與酶切純化處理后的pUC119載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上篩選后，共獲得6 600個(gè)陽性克隆。用通用引物M13進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得2 600個(gè)片段長(zhǎng)度在120 bp及以上的單一克隆，片段大小在100～450 bp之間(圖2)。

2.3 陽性克隆的斑點(diǎn)雜交

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所獲得陽性克隆的性別特異性，將452個(gè)重組單克隆菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)在尼龍膜上，分別用雌雄基因組DNA為探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交。共獲得98個(gè)雄性特異陽性克隆(部分結(jié)果見圖3)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN軟件去掉載體、引物序列、低質(zhì)量序列和小于60 bp的序列后得到52條序列。其中，最長(zhǎng)序列片段長(zhǎng)度297 bp，最短序列片段長(zhǎng)度63 bp。在52條差異序列中，33條為非葉綠體來源序列，19條序列是葉綠體來源序列，命名為Ao1～Ao19。所有的NUPTs序列石刁柏葉綠體基因組序列相似性在84%以上。

2.4 NUPTs的篩選與驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所獲得的NUPTs是否是穩(wěn)定的性別差異序列，利用基因組半定量PCR技術(shù)對(duì)19個(gè)NUPTs進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中4個(gè)序列(Ao1、Ao3、Ao10、Ao18)是較為穩(wěn)定的雄性偏向序列(圖4)。

M. Trans2K marker；A. 1和2為酶切后的石刁柏雄性基因組DNA；B. 1和2為高溫破碎后的石刁柏雌性基因組DNA圖1 石刁柏雄性基因組DNA酶切(A)及雌性DNA破碎(B)電泳圖M. Trans2K marker； A. 1 and 2 represent the genomic DNA of male asparagus after enzyme digestion；B. 1 and 2 represent the genomic DNA of female asparagus after high temperature boilingFig.1 The electrophorogram of enzyme digested male genomic DNA (A) and high temperature broken female genomic DNA (B) of asparagus

M為Trans 2K marker, 1～96為隨機(jī)挑取的菌落圖2 部分重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增結(jié)果(以M13R和M13F為引物)M indicates Trans 2K marker；1-96 represent randomly selected coloniesFig.2 Partial results of PCR amplification for screening the positive recombinant clones (M13R and M13F as the primers)

A. 克隆與石刁柏雄性基因組DNA探針雜交；B. 克隆與石刁柏雌性基因組DNA探針雜交；箭頭所示為雄性基因組中顯著富集的克隆圖3 部分消減雜交克隆產(chǎn)物的斑點(diǎn)雜交檢測(cè)A. The results of clones hybridized with asparagus male genomic DNA probe; B. The results of clones hybridized with asparagus female genomic DNA probe; Arrows represent the clones with preference in male asparagus genomeFig.3 Dot blot hybridization of the clones screened by substractive hybridization (only partial results were shown)

2.5 NUPTs在基因組中的拷貝數(shù)估計(jì)

為了分析所獲得的4個(gè)雌雄基因組差異序列是否屬于重復(fù)序列，利用本實(shí)驗(yàn)室石刁柏基因組測(cè)序的數(shù)據(jù)進(jìn)行拷貝數(shù)估計(jì)后發(fā)現(xiàn)，Ao1、Ao3、Ao10和Ao18的每單倍基因組拷貝數(shù)分別為2 514、1 505、1 477和15(表2)，說明這些NUPTs屬于高度重復(fù)序列，這也說明核基因組中性別差異的NUPTs在其插入基因組后發(fā)生了復(fù)制。

M. Trans2K marker；1～3為石刁柏雌性單株基因組DNA；4～6為石刁柏雄性單株基因組DNA圖4 基因組半定量PCR擴(kuò)增結(jié)果M. Trans2K marker；1-3 represent the genomic DNA of female asparagus individuals；4-6 represent the genomic DNA of male asparagus individualsFig.4 Genomic semi-quantitative PCR amplification results

序列Sequence石刁柏基因組Ao?genome總拷貝數(shù)Totalcopies每單倍體基因組的拷貝數(shù)Copies/1CAo1162582514Ao396751505Ao1095721477Ao189715

2.6 NUPTs的葉綠體基因組定位分析

為了進(jìn)一步分析所獲得的NUPTs序列在石刁柏葉綠體基因組的位置特征，將所獲得的19個(gè)NUPTs在葉綠體基因組進(jìn)行定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)19個(gè)性別差異NUPTs在葉綠體基因組上的分布并不是隨機(jī)的，其中10個(gè)NUPTs都分布在葉綠體基因組的反向重復(fù)區(qū)(IR)(包含IRa和IRb區(qū))，而在短單拷貝序列(SSC)及長(zhǎng)單拷貝序列(LSC)區(qū)僅有5個(gè)NUPTs，說明葉綠體反向重復(fù)區(qū)序列更容易向核基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)移，可能和該區(qū)域序列高拷貝數(shù)有關(guān)。

3 討 論

研究表明，葉綠體基因組向核基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)移會(huì)引起染色體或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，且這些NUPTs在染色體上的分布具有位置特異性。在水稻中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)染色體上NUPTs多分布于著絲粒區(qū)域[18-19]，且多數(shù)長(zhǎng)序列NUPTs會(huì)隨著核基因組的膨脹和收縮而出現(xiàn)被復(fù)制或被淘汰現(xiàn)象[19]。本研究從石刁柏核基因組中所發(fā)現(xiàn)的19個(gè)雌雄差異葉綠體序列中有4個(gè)為高拷貝的重復(fù)序列，說明葉綠體DNA序列在核基因組中的插入頻率較高，且在NUPTs不斷插入演化過程中形成多拷貝重復(fù)序列，但是基因組的膨脹是NUPTs拷貝數(shù)增加的結(jié)果還是原因仍不清楚。從進(jìn)化上來說，石刁柏葉綠體許多基因也發(fā)生了向核基因組的遷移現(xiàn)象，而且這是一個(gè)伴隨物種進(jìn)化的持續(xù)過程。本研究通過NUPTs在葉綠體基因組上的位置分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移到核基因組上的DNA大部分來自于葉綠體反向重復(fù)區(qū)，表明石刁柏葉綠體基因組的重復(fù)區(qū)序列更容易發(fā)生細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)之間的轉(zhuǎn)移，這也可能是造成細(xì)胞核基因組中某些NUPTs高拷貝數(shù)的原因之一。

現(xiàn)代進(jìn)化理論認(rèn)為，原始性染色體的性別決定區(qū)的重組抑制是性染色體演化過程中最關(guān)鍵的一步[20-21]。正是這種重組抑制現(xiàn)象的出現(xiàn)加快了植物性染色體的演化過程，導(dǎo)致了異型性染色體的出現(xiàn)[22]。而一些反轉(zhuǎn)座子和NUPTs等高拷貝重復(fù)序列的插入可以引起性染色體的異染色質(zhì)化[23]?，F(xiàn)有研究證據(jù)表明，植物的性染色體上積累有大量的包括NUPTs在內(nèi)的重復(fù)序列[11, 24-25]，這些序列能夠?qū)е耏染色體異染色質(zhì)化及功能的喪失[25-27]，形成了兩條組成型異染色質(zhì)的Y染色體[28]。目前，從技術(shù)上證明NUPTs等重復(fù)序列在染色體上插入所引起的異染色質(zhì)化可以利用現(xiàn)代細(xì)胞學(xué)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。如利用高分辨率的DNA Fiber免疫熒光雜交技術(shù)來分析NUPTs鄰近區(qū)域染色質(zhì)的DNA甲基化及組蛋白修飾模式特征，并通過和同屬雌雄同株近緣種的同源染色體進(jìn)行比較能夠獲得更有價(jià)值的結(jié)果，為進(jìn)一步分析NUPTs在植物性染色體演化中的作用提供重要的理論資料。

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(編輯:宋亞珍)

of Plastid DNA fromAsparagusofficinalis

LI Shufen, LI Xu, WANG Bingxiao, YUAN Jinhong, DENG Chuanliang, GAO Wujun*

(College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang, He’nan 453007, China)

In this study, male-biased NUPTs (nuclear integrants of plastid DNA) were isolated and analyzed in the genome ofAsparagusofficinalis, a dioecious plant, by using genome substractive hybridization method. (1) 52 male-biased sequences with size ranged from 63 bp to 297 bp were obtained from the substractive hybridization library. Among these sequences, 19 were originated from chloroplast genome, which were designated as Ao1-Ao19. These sequences all showed high similarity (>84%) with the corresponding sequences in asparagus chloroplast genome, while Ao19 showed 100% similarity with the corresponding sequence in the asparagus chloroplast genome. (2) Genome semi-quantitative PCR revealed that four (Ao1, Ao3, Ao10, and Ao18) out the 19 sequences were stable male-biased NUPTs. (3) Sequence alignment showed the NUPTs were mainly derived from the inverted repeat region (IR) (containing IRa and IRb) of the asparagus chloroplast genome, indicating that the sequences of IR region of chloroplast genome were more preferred to transfer to nuclear genome to form male-biased NUPTs sequences.

Asparagusofficinalis; sex difference; NUPTs; male-biased

1000-4025(2016)12-2385-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2385

2016-10-12;修改稿收到日期:2016-12-02

國家自然科學(xué)基金(31470334)；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃(17IRTSTHN017)；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(13A180525)

李書粉(1983-)，女，博士，副教授，主要從事植物性別決定與分化機(jī)制研究。E-mail：lishufen83@163.com

*通信作者:高武軍，教授，主要從事植物性別決定與分化機(jī)制研究。E-mail：gaowujun1@163.com

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