利用AhMITEI轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記鑒定栽培花生雜交F₁代種子真?zhèn)?/h1>

2016-02-05 09:31尹亮任艷石延茂李雙鈴?fù)踺x袁美

山東農(nóng)業(yè)科學(xué)訂閱 2015年12期 收藏

關(guān)鍵詞：分子標(biāo)記花生種子

尹亮++任艷++石延茂++李雙鈴++王輝++袁美

摘要：雜交育種是花生品種改良的主要方法之一，鑒定F₁代雜交種子真?zhèn)尾⑷コ匐s種是雜交育種成功的前提。本研究建立起一套在不影響花生種子活力前提下提取花生F₁代雜交種子子葉DNA，并結(jié)合Ah-MITE1分子標(biāo)記鑒定技術(shù)，在播種前對(duì)花生F₁代雜交種子真?zhèn)芜M(jìn)行鑒定的技術(shù)，顯著提高了去除假雜種的準(zhǔn)確性，將有助于提高花生品種選育的效率。

關(guān)鍵詞：花生；種子；雜種鑒定；轉(zhuǎn)座子；AhMITE1；分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S565.203.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2015）12-0001-05

花生常規(guī)育種方法主要包括引種、系統(tǒng)育種、雜交育種和誘變育種等，其中雜交育種是目前最重要、最有效的育種方法。為培育適宜不同地區(qū)種植的優(yōu)良花生品種，需要采用雜交轉(zhuǎn)育的方法使一些種質(zhì)的優(yōu)異性狀更加有效地得以利用。理論上講，通過現(xiàn)有的人工去雄授粉雜交技術(shù)獲得品種間真雜種F₁的概率應(yīng)該很大，但在實(shí)際操作過程中，由于花生花器結(jié)構(gòu)較小、母本去雄不徹底以及自交花未摘除完全等原因?qū)е履副咀越恍纬蓚坞s種的情況難以避免。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，利用分子標(biāo)記對(duì)雜種F₁代進(jìn)行鑒定的技術(shù)已在花生育種及遺傳群體構(gòu)建中得到廣泛應(yīng)用，提高了育種效率。

微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件（Miniature Inverted-repeat Transposable Element， MITE）最早由Bureau等在玉米基因組中發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究證實(shí)其廣泛分布于單子葉及雙子葉植物基因附近或內(nèi)部。MITE結(jié)構(gòu)與非自主元件相似，具有TIR或TSD結(jié)構(gòu)，但又具有反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件的高拷貝性。研究發(fā)現(xiàn)MITE主要包括Tourist和Stowaway兩種類型，通過相應(yīng)的自主轉(zhuǎn)座元件編碼的反轉(zhuǎn)錄酶識(shí)別TIR序列完成擴(kuò)張。它插入位點(diǎn)的傾向性以及高度重復(fù)性，使其在植物基因表達(dá)調(diào)控以及遺傳進(jìn)化等方面發(fā)揮了重要的作用。MITE元件是在基因組中廣泛分布的高度重復(fù)序列，其序列本身的多態(tài)性也在一定程度上反映基因組的多態(tài)性。目前，利用MITE轉(zhuǎn)座元件作為遺傳標(biāo)記，已在水稻、煙草、大麥以及剪股穎等植物的遺傳分析中得到應(yīng)用。在花生方面，Shirasawa等研究了AhMITE1的特征，根據(jù)其兩端序列開發(fā)了一系列AhMITE1引物，并構(gòu)建了花生高密度遺傳圖譜。王潔等利用13對(duì)AhMITE1分子標(biāo)記對(duì)6個(gè)花生雜交組合F.代植株進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果與表型鑒定結(jié)果完全符合，證實(shí)AhMITE1分子標(biāo)記用于花生雜種鑒定的可靠性。王輝等利用33對(duì)AhMITE1分子標(biāo)記對(duì)115份花生栽培種及高世代材料進(jìn)行分析，其中31對(duì)引物獲得較好的擴(kuò)增效果，每對(duì)引物可擴(kuò)增1～3條帶，在所有分析材料中共擴(kuò)增產(chǎn)生57條帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)為54，多態(tài)性條帶比率為96.49%。這些研究結(jié)果均表明AhMITE1分子標(biāo)記作為一種新型的分子標(biāo)記，具有操作性強(qiáng)、多態(tài)性高、帶型簡單穩(wěn)定等其它標(biāo)記無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于花生品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建以及分子標(biāo)記輔助育種等方面的研究。

目前報(bào)道的利用分子標(biāo)記檢測花生雜交F₁代真?zhèn)坞s種的方法均是利用F₁代植株葉片DNA進(jìn)行檢測，這就要求必須將全部F₁代雜交種種植，并待出苗后方能夠進(jìn)行檢測。本研究旨在建立起一套在不影響花生種子活力的前提下提取花生F₁代雜交種子子葉DNA，并結(jié)合AhMITE1分子標(biāo)記鑒定技術(shù)，在播種前對(duì)花生F₁代雜交種子真?zhèn)芜M(jìn)行鑒定的技術(shù)，以提升花生品種的選育效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究共選用12份花生材料及以其作為親本雜交收獲的F₁代種子（表1）。上述親本及F₁代種子均收獲于山東省花生研究所萊西實(shí)驗(yàn)農(nóng)場。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取將12份花生親本及Fi代種子編號(hào)后，在保證不破壞種子結(jié)構(gòu)的情況下用刀片分別從每個(gè)種子遠(yuǎn)胚端切取約0.5mm厚子葉，置于對(duì)應(yīng)編號(hào)的2mL離心管中，加入液氮后用研磨棒研磨成粉末?；蚪MDNA提取采用改良小量CTAB法。向每個(gè)裝有花生子葉粉末的離心管中加入400μL已經(jīng)預(yù)熱到65℃的CTAB提取液，充分混勻后65℃水浴20min。然后加入400μL體積比為25： 24：1的酚一氯仿一異戊醇溶液或體積比為24：1的氯仿一異戊醇溶液（比較其純化效果），顛倒混勻，12000r/min離心10min后，轉(zhuǎn)移上清液到新的1.5mL離心管中。加入-20C預(yù)冷的異丙醇400μL，混勻后- 20℃沉淀20min。12000r/min離心10min后，用70%乙醇清洗，室溫干燥DNA后加入TE溶液50μL，并置于-20℃保存待用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增體系及程序 AhMITEl-PCR反應(yīng)體系為10μL，含2×Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]5μL、正向和反向引物（10μmol/L）各0.4μL、DNA 20ng。PCR程序?yàn)?40C預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s.72℃延伸45s，共38個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸10min。檢測所使用的10對(duì)AhMITE1分子標(biāo)記引物（表2）均來自Shirasawa等。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測 PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳（電泳緩沖液0.5×TBE，電壓120V，時(shí)間45min），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）觀察并拍照。

1.3 真?zhèn)坞s種鑒定標(biāo)準(zhǔn)

在分子鑒定中，表現(xiàn)父母本雜合帶型的F₁代種子為真雜種，僅表現(xiàn)母本帶型的為偽雜種。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量檢測

本試驗(yàn)提取花生種子基因組DNA采用改良小量CTAB法，純化過程分別使用酚一氯仿一異戊醇（25： 24：1）和氯仿一異戊醇（24：1）進(jìn)行純化。前者上清液加入異丙醇后析出少量沉淀，70%乙醇漂洗晾干加入TE溶液后完全溶解；而后者上清液加入異丙醇后析出大量沉淀，加入TE溶液后沉淀無法完全溶解。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示，酚一氯仿一異戊醇純化的DNA雜質(zhì)較少，而氯仿一異戊醇純化的DNA中含有大量的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。后續(xù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用前者DNA為模板可以成功地進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，而用后者DNA作為模板無法進(jìn)行PCR檢測，將后者DNA樣品用酚一氯仿一異戊醇重新抽提沉淀并溶解后作為模板可以正常進(jìn)行PCR檢測。這是由于花生子葉中含有大量的蛋白質(zhì)及脂肪等物質(zhì)，單純使用氯仿一異戊醇抽提得到的DNA樣品中含有大量雜質(zhì)，抑制Taq酶活性導(dǎo)致PCR擴(kuò)增受阻，因此沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，而酚一氯仿一異戊醇去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的能力更強(qiáng)，因此在提取花生種子DNA的過程中必須使用酚一氯仿一異戊醇進(jìn)行純化。

2.2 親本間AhMITE1標(biāo)記多態(tài)性分析

利用12個(gè)親本材料對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已合成的部分AhMITE1標(biāo)記引物進(jìn)行篩選（圖2），選取擴(kuò)增條帶清晰、片段大小在100～500bp之間、父母本間存在明顯差異的共顯性標(biāo)記用于F₁代雜種鑒定。分子標(biāo)記篩選結(jié)果見表1。

2.3 F₁代雜交種AhMITE1標(biāo)記分析

按表1所示，利用不同的AhMITE1標(biāo)記引物分別對(duì)11個(gè)雜交組合的F₁代種子進(jìn)行鑒定，部分鑒定圖譜見圖3。對(duì)各雜交組合的鑒定圖譜進(jìn)行分析，僅表現(xiàn)為母本帶型的為偽雜種，表現(xiàn)出父母本雜合帶型的為真雜種，計(jì)算得到各雜交組合的真雜種率（表3）。其中A1、A2、A6、A8真雜種率較高，達(dá)到50%以上，其余組合真雜種率均在50%以下，A10組合真雜種率最低，僅為3.2%。本研究還對(duì)同一雙仁果中的不同籽仁進(jìn)行比較，A1、A4、A6、A8、A10、A11組合雙仁果中的兩個(gè)Fi種子均表現(xiàn)為同樣的帶型，即同為真雜種或偽雜種；而A3、A5組合及A2、A7、A9組合分別有1個(gè)或2個(gè)雙仁果中的兩個(gè)Fi種子帶型不相同，即一個(gè)為真雜種另一個(gè)為偽雜種。這種結(jié)果可能是由于雜交前母本去雄不徹底造成的。

3 結(jié)論與討論

雜交技術(shù)在現(xiàn)今的花生育種以及遺傳群體構(gòu)建過程中已廣泛使用，但由于各種因素影響，花生Fi代雜交種真雜種率較低。目前對(duì)花生F₁代雜交種進(jìn)行鑒定的方法均使用F₁代植株葉片DNA，需要將所有雜交種子種植，待出苗后方能進(jìn)行檢測。本研究采用小量CTAB法從花生種子子葉中提取DNA，在不影響種子活力的前提下提取F₁代雜交種子DNA，并結(jié)合AhMITE1分子標(biāo)記鑒定技術(shù)，在播種前對(duì)雜交種子真?zhèn)芜M(jìn)行鑒定，可以提前去除假雜種，顯著提高F₁代去雜的準(zhǔn)確率，大大降低花生材料的取樣及種植成本。

花生子房內(nèi)有一至數(shù)個(gè)胚珠，胚珠橫生。史春艷等通過對(duì)四粒紅花生雙受精過程進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，胚珠受精的順序是從上到下，不是同時(shí)受精。這說明花生同一子房中的不同胚珠受精過程是相互獨(dú)立的。本研究重點(diǎn)針對(duì)同一雙仁果中不同籽仁進(jìn)行分析，其中大部分雙仁果中的兩個(gè)F₁代雜交種子均同為真雜種或偽雜種，但仍有小部分雙仁果中兩個(gè)F₁代雜交種子一真一偽。這種情況可能是由于授粉前去雄不徹底等原因造成母本與父本花粉同時(shí)結(jié)合在母本柱頭上，進(jìn)入子房，并分別進(jìn)入不同的胚珠。因此，在對(duì)花生F₁代雜交種子進(jìn)行真?zhèn)舞b定時(shí)，應(yīng)對(duì)每一個(gè)F₁代雜交種子進(jìn)行編號(hào)檢測。endprint

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