冬棗采后病害拮抗菌的篩選和鑒定

耿海峰，張麗珍*，牛 偉

(1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西 太原 030006；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山西 太原 030006)

冬棗采后病害拮抗菌的篩選和鑒定

耿海峰1，張麗珍2,*，牛 偉3

(1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西 太原 030006；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山西 太原 030006)

從采集的土樣中分離篩選11株對(duì)冬棗細(xì)交鏈格孢病菌、多隔鐮孢霉和美澳核果褐腐串珠霉具有較好抑制作用的拮抗菌。通過平板對(duì)峙生長(zhǎng)法測(cè)抑菌半徑。結(jié)果表明：其中B26的抑菌效果最顯著，對(duì)細(xì)交鏈格孢的平均抑菌圈半徑為15.8mm，抑制率達(dá)78.8%，對(duì)冬棗多隔鐮孢霉和美澳核果褐腐串珠霉的平均抑菌圈半徑分別為14.3mm和12.8mm，抑制率分別達(dá)71.3%和63.8%。通過在PDA生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)以及PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果綜合分析，初步鑒定B26為枯草芽孢桿菌。

冬棗；病害；拮抗菌；篩選；鑒定

冬棗是我國稀有的優(yōu)質(zhì)晚熟鮮食品種，由于它含有19種氨基酸及多種維生素，VC含量高達(dá)3.5～6.5g/kg[1]，果實(shí)清脆可口，素有“百果王”、“活維生素丸”之稱，深受人們的青睞。近年來，隨著冬棗栽培面積的不斷擴(kuò)大和集約化栽培的發(fā)展，冬棗產(chǎn)量也逐年遞增。據(jù)2001年秋季不完全統(tǒng)計(jì)，目前全國冬棗栽培的面積已經(jīng)有53萬畝左右，其中，結(jié)果面積9000畝，總產(chǎn)量約7000t以上[2]。冬棗采后在常溫下放置10d，腐爛率高達(dá)80%，低溫貯藏60d左右，果實(shí)腐爛嚴(yán)重，喪失食用價(jià)值和商品價(jià)值[3]，由細(xì)交鏈格孢(Alternaria alternata)、多隔鐮孢霉(Fusarium decemcellulare Brick)和美澳核果褐腐串珠霉(Monilia fructicola)引起的黑斑病和腐爛病對(duì)采后冬棗的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生重大影響，危害嚴(yán)重，在實(shí)際生產(chǎn)中仍未有合適的耐貯藏的優(yōu)良品種。為減輕貯藏期和貨架期病害損失，防治上大多采用化學(xué)殺菌劑[4]，由于對(duì)食品安全性的要求越來越高，使得水果采后病害防治不宜采用有殘留的化學(xué)試劑。因此，迫切需要尋求一些新的、無毒高效的防腐防病新技術(shù)，以逐步取代化學(xué)殺菌劑在采后果蔬上的使用。

借鑒采前作物病害生物防治的思路，人們提出了果

蔬采后病害生物防治的設(shè)想。Wilson等[5]提出果蔬采后病害生物防治的主要途徑之一就是利用拮抗菌的拮抗作用來控制病原菌，而拮抗作用的主要機(jī)理是利用拮抗菌與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)和生存空間[6-9]，此外通過拮抗菌產(chǎn)生抗生素、拮抗菌直接吸附于病原菌導(dǎo)致病菌死亡、誘導(dǎo)水果產(chǎn)生抗性抵御病原菌的侵害是另外幾種研究較多的拮抗菌的拮抗機(jī)理[10-12]。國內(nèi)外已有拮抗菌用于水果采后病害研究的報(bào)道，F(xiàn)an等[13]從桃果實(shí)的傷口處成功地分離到了能有效防治核果類果實(shí)軟腐病的酵母菌(Pichia membranefaciens)，該生物治防菌可以防治桃果實(shí)的軟腐病。宋聰?shù)萚14]從水果、葉片表面及果園土壤中分離篩選到1株細(xì)菌和2株酵母菌，對(duì)梨黑斑病菌(Alternaria kik uchiana)、柑橘青霉病菌(Penicillium italicum)都表現(xiàn)出顯著的拮抗效果。在冬棗的采后腐爛病的生物防治研究中，有利用梅奇酵母菌(Metschnikowia)的報(bào)道[15]，但尚未見從土壤中定向篩選芽孢桿菌作為冬棗采后病害生防因子的報(bào)道，由于芽孢桿菌能產(chǎn)生耐熱、抗逆的芽孢，有利于菌劑的生產(chǎn)，劑型的加工及在環(huán)境中存活和定殖與繁殖[16]。為了開展冬棗采后貯藏期各種病害的侵染、發(fā)生規(guī)律及防治方法的研究，更好的利用微生物資源進(jìn)行水果采后病害的防治，本實(shí)驗(yàn)通過從采集的土樣中選擇性分離和篩選具有較好拮抗作用的拮抗菌，對(duì)它們進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化分析及16S rDNA序列比對(duì)研究和鑒定，以期對(duì)冬棗的采后病害防治提供新的生防菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

1.1.1 供試病原菌

細(xì)交鏈格孢(Alternaria al ternata)、多隔鐮孢霉(Fusarium decemcellulare Brick)和美澳核果褐腐串珠霉(Monilia fructicola)由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院保鮮所薛夢(mèng)林老師惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基

用于PCR反應(yīng)菌種制備的LB培養(yǎng)基，用于分離和篩選拮抗菌及培養(yǎng)病原菌PDA培養(yǎng)基和各種生理生化反應(yīng)的培養(yǎng)基參照陳天壽[17]的方法制備。

1.2 試劑與儀器

細(xì)菌基因組提取試劑盒 寶生物(大連)有限公司。

DYY-8C電泳儀、DYCP-31系列水平電泳槽 北京市六一儀器廠；TC-25/H基因擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋、BS-S恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；HH.BⅡ.600電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠；YXQ-LS-50壓力蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái) 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TGL-16G-C高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 拮抗菌的分離

參考張曉舟等[18]采集森林和不同菜園的耕作層下5～10cm的土壤，帶回實(shí)驗(yàn)室風(fēng)干、過篩、混勻，每份土樣取10g，加入90mL無菌水中，在150r/min搖床上振蕩30min后用無菌水進(jìn)行梯度稀釋到10-6、10-7后涂布PDA平板，于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h左右，并記錄菌株的生長(zhǎng)情況，然后挑取菌落形態(tài)差異明顯的單菌落用PDA培養(yǎng)基初篩。

1.3.2 拮抗菌的初篩和復(fù)篩

以細(xì)交鏈格孢為指示菌，采用十字交叉法將進(jìn)入初篩的菌株點(diǎn)接在距平板中央3cm處的4個(gè)角點(diǎn)上(圖1)，平板中央同時(shí)移入直徑3mm的長(zhǎng)有細(xì)交鏈格孢的瓊脂塊，28℃恒溫培養(yǎng)5d后，選出被抑病原菌絲邊緣平齊且拮抗作用持久的菌株進(jìn)入復(fù)篩，測(cè)量、記錄抑菌圈半徑(細(xì)菌菌落中心至病原菌菌絲邊緣)的大小并計(jì)算抑制率。

1.3.3 對(duì)不同病原真菌的拮抗能力測(cè)定

采用平板對(duì)峙生長(zhǎng)法在平板正中間用接種環(huán)劃線，培養(yǎng)12～18h后將病菌瓊脂塊接種于離平板中央2cm處，重復(fù)3次，以無菌水作對(duì)照，28℃培養(yǎng)5d后觀察并記錄抑菌圈半徑的大小。抑制率的計(jì)算同1.3.2節(jié)公式。

1.3.4 拮抗菌的初步鑒定

1.3.4.1 拮抗菌的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征

參考沈萍等[19]觀察拮抗菌在PDA平板上培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)特征和顯微觀察形態(tài)特征。

1.3.4.2 拮抗菌的生理生化特征

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[20]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[21]對(duì)抑菌效果較好的拮抗菌B26進(jìn)行了部分代表性的生理生化實(shí)驗(yàn)。

1.3.4.3 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

16S rDNA的PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定：以細(xì)菌基因組提取試劑盒提取的基因組DNA為模板，以引物1(5′-A T C C T T G T T A C G A C T T G A-3′)和引物2(5′-AGTTTGATCCTGGCTCA-3′)為引物，擴(kuò)增B26的16S rDNA。PCR的反應(yīng)體系按照寶生物工程(大連)有限公司Premix Taq(Ex TaqTMVersion)使用說明書配制為(50μL)：Premix Taq 25μL，模板DNA 2μL，引物1和引物2各1μL，滅菌雙蒸水21μL。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)探索PCR擴(kuò)增的條件是：95℃初始變性5min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃復(fù)性15min。

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果送交寶生物(大連)有限公司進(jìn)行純化測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交到NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比較，下載相關(guān)序列，利用軟件Clustal2.0和MEGA4.1進(jìn)行多序列比對(duì)，并繪制進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離篩選及初步鑒定結(jié)果

2.1.1 拮抗菌的分離和篩選

通過稀釋采集的土壤懸液，涂布平板，共分離112個(gè)差異明顯的細(xì)菌菌落進(jìn)入復(fù)篩實(shí)驗(yàn)階段。

2.1.2 拮抗菌的復(fù)篩結(jié)果

圖 1 拮抗菌對(duì)病原真菌的拮抗作用Fig.1 Antagonistic effects of antagonistic bacteria on pathogenic fungi

通過十字交叉法共從112個(gè)經(jīng)過初篩篩選出的差異明顯的菌落中，分離出11株對(duì)指示菌株細(xì)交鏈格孢病菌具有抑制作用的拮抗菌，占所分離細(xì)菌總數(shù)的9.8%。圖1是其中8株拮抗菌復(fù)篩結(jié)果(復(fù)篩選后將具有拮抗作用的細(xì)菌培養(yǎng)于同一平皿中)，從圖1可以看出，經(jīng)過初篩所篩選的拮抗菌具有不同的拮抗性能。

2.2 不同拮抗菌的拮抗性能

表 1 不同拮抗菌株對(duì)美澳核果褐腐串珠霉病原菌的抑制效果Table 1 Antibacterial effects of different antagonistic bacterial strains onMonilia fructicola

實(shí)驗(yàn)中篩選出11株拮抗菌，對(duì)其對(duì)不同的病原菌的拮抗效果進(jìn)行拮抗實(shí)驗(yàn)(拮抗效果最好的菌株見第一列)，如表1所示，表中101-B1對(duì)美澳核果褐腐串珠霉病原菌的抑菌圈半徑最大可達(dá)到14.1mm，抑制率可達(dá)66.3%。而B26對(duì)美澳核果褐腐串珠霉病原菌的平均抑菌圈半徑是12.8mm，抑制率為63.8%，相對(duì)于其他篩選的拮抗菌具有較好的抑制美澳核果褐腐串珠霉病原菌的能力。

同樣通過實(shí)驗(yàn)測(cè)得結(jié)果可知，所篩選的11株拮抗菌對(duì)多隔鐮孢霉病原菌具有不同的拮抗性能。表2是11株拮抗菌對(duì)多隔鐮孢霉的抑制效果，可以看出B26對(duì)多隔鐮孢霉病原菌的抑制效果抑菌圈半徑最大可達(dá)到15.0mm，平均抑菌圈半徑達(dá)到14.3mm，抑制率為71.3%，實(shí)驗(yàn)顯示B26具有較好的抑制多隔鐮孢霉病原菌的拮抗能力。

表 2 不同拮抗菌株對(duì)多隔鐮孢霉病原菌的抑制效果Table 2 Antibacterial effects of different antagonistic bacterial strains onFusarium decemcellulareBrick

表3是11種拮抗菌對(duì)細(xì)交鏈格孢的抑制效果，可以看出B26對(duì)細(xì)交鏈格孢病原菌的平均抑菌圈半徑最大，可達(dá)到15.8mm，抑制率可達(dá)78.8%，拮抗效果明顯優(yōu)于其他拮抗菌，而且各個(gè)數(shù)值之間的變異系數(shù)較小，拮抗效果比較穩(wěn)定。

表 3 不同拮抗菌株對(duì)細(xì)交鏈格孢病原菌的抑制效果Table 3 Antibacterial effects of different antagonistic bacterial strains onAlternaria alternata

從表1～3中綜合分析B26對(duì)美澳核果褐腐串珠霉、

多隔鐮孢霉和細(xì)交鏈格孢的抑制效果都在60%以上，抑制率分別是63.8%、71.3%、78.8%，其中對(duì)細(xì)交鏈格孢的抑制率最大。B26對(duì)多隔鐮孢霉病菌的抑制作用相對(duì)較好，抑菌圈的平均半徑在14.3mm，B26對(duì)細(xì)交鏈格孢的抑制作用最好，抑菌圈的半徑為15.8mm；對(duì)峙培養(yǎng)72 h后，可觀察到在拮抗菌四周有明顯的透明圈，越靠近拮抗菌抑菌圈周圍的病原菌，菌落越小，這說明這些拮抗菌產(chǎn)生了一些能在培養(yǎng)基中向四周擴(kuò)散的抗菌物質(zhì)。由于拮抗菌B26具有廣譜的抗菌活性和抑菌效果，具有很好的應(yīng)用與發(fā)展的前景，因此將側(cè)重于對(duì)目的菌株B26的一些理化性質(zhì)和分子生物學(xué)的鑒定。

表 4 拮抗菌的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果Table 4 Morphological features of antagonistic bacteria

圖 2 拮抗菌對(duì)不同病菌的抑制率Fig.2 Inhibition rates of antagonistic bacterial strains against different pathogenic fungi

圖2是實(shí)驗(yàn)中11株拮抗菌對(duì)不同種病菌拮抗綜合效果圖，拮抗菌B26具有較強(qiáng)的拮抗病菌能力，具有抗菌廣譜性，圖3是實(shí)驗(yàn)中拮抗菌對(duì)3種病菌的拮抗圖。

2.3 拮抗菌的形態(tài)學(xué)觀察和革蘭氏染色

拮抗菌B26在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)特征見表4，B26外形為圓形，邊緣波浪狀，菌落不透明，深灰色，隨著培養(yǎng)時(shí)間出現(xiàn)鋸齒狀邊緣，菌落中間出現(xiàn)皺褶突起，革蘭氏染色為陽性，芽孢染色不著色，根據(jù)以上特性初步鑒定拮抗菌B26為芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)。菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，菌株為生長(zhǎng)溫度10～50℃生長(zhǎng)的pH5.0～9.0能夠耐受含10g/100mL的氯化鈉，參照文獻(xiàn)[21]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[20]，初步鑒定該拮抗菌為枯草芽孢桿菌。

表 5 B26菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Physical and biochemical properties of strain B26

圖 3 拮抗菌B26對(duì)細(xì)交鏈格孢(A)、多隔鐮孢霉(B)和美澳核果褐腐串珠霉(C)的拮抗作用Fig.3 Antagonistic effects of strain B26 onAlternaria alternate,Fusarium decemcellulareBrick andMonilia fructicola

2.4 PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳

經(jīng)部分測(cè)序分析B26擴(kuò)增16S rDNA序列長(zhǎng)為780bp (圖4)，將B26的16S rDNA在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST，選取相似性較高的15條序列，利用軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)其16S rDNA序列與Bacillus subtilis的序列相似性達(dá)98%，初步將其判斷為枯草芽孢桿菌，圖5為系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

圖 4 B26的16SrDNA序列PCR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.4 Electrophoresis of 16SrDNA for strain B26

圖5 基于16SrDNA序列同源性的15株細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of 15 homologous strains based on 16SrDNA sequences

3 討 論

在冬棗采后病害拮抗菌篩選中，已有從冬棗果實(shí)表面的病健交界處篩選酵母菌防治采后病害取得較好防效的報(bào)道，澳大利亞的Huang等[22]從柑橘果實(shí)表面分離獲得的Bacillus pumilus用于防治茯苓夏橙的綠霉病，表現(xiàn)出和殺菌劑抑霉哇相仿的防效，用于華臍和里斯本檸檬的綠霉病防效也較好。因此，在篩選水果采后病害拮抗菌的過程中，不僅可以從病害發(fā)生的自然微生態(tài)環(huán)境-水果表面附生菌或水果內(nèi)生菌中篩選，還可以從更廣泛的不同生境中篩選，以適應(yīng)商品化生產(chǎn)時(shí)不同需求。基于此，本實(shí)驗(yàn)選取不同類型的菜園土及森林土作為拮抗菌篩選源，也是利用土壤細(xì)菌防治冬棗采后病害的一種新探索。但是在篩選過程中，篩選方法多參照前人的，缺乏創(chuàng)新性和選擇性，培養(yǎng)基的種類及篩選方式缺乏針對(duì)性，因此在以后的分離篩選實(shí)驗(yàn)中，可以使用特殊的具有高度選擇性的分離條件，并使用相應(yīng)的培養(yǎng)基及篩選方式，以增加發(fā)現(xiàn)新拮抗菌的概率。

在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，一些菌株在平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)中有較好的抑菌活性，但其代謝產(chǎn)物卻沒有表現(xiàn)出相應(yīng)的活性，而菌株B26在平板對(duì)峙法和離心提取上清液實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)一定的拮抗效果，對(duì)細(xì)交鏈格孢抑制作用明顯。在實(shí)驗(yàn)中拮抗菌B26對(duì)細(xì)交鏈格孢的抑制率達(dá)78.8%、對(duì)多隔鐮孢霉的抑制率達(dá)71.3%、對(duì)美澳核果褐腐串珠霉的抑制率達(dá)63.8%，顯示出較好的抑菌作用，具有廣譜的抗菌活性。通過該菌株在實(shí)驗(yàn)中的防治效果以及抑菌的廣譜性可以推測(cè)其具有很好的發(fā)展前景，具有很大的開發(fā)和應(yīng)用潛力，值得深入研究。篩選和鑒定拮抗菌株只是本課題的一部分，有關(guān)拮抗菌最佳培養(yǎng)條件、活性物質(zhì)的理化性質(zhì)以及田間防效需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和研究。

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Screening and Identification of Antagonistic Bacteria against Post-harvest Diseases of Jujube Fruits

GENG Hai-feng1，ZHANG Li-zhen2,*，NIU Wei3
(1. College of Biological Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2. College of Life Science and Technology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；3. Shanxi Academy of Agricultural Science, Taiyuan 030006, China)

Eleven strains of antagonistic bacteria were isolated from soil samples and exhibited an excellent antagonistic effect on Alternaria alternate, Fusarium decemcellulare Brick and Monilia fructicola. Results showed strain B26 had the strongest inhibition effect on three selected fungal pathogens. The average radius of inhibition zone was 15.8 mm in plate inhibition test and inhibition rate against Alternaria alternate was 78.8%. Similarly, strain B26 also exhibited inhibition effect on Fusarium decemcellulare Brick and Monilia fructicola with average radius of 14.3 mm and 12.8 mm, and inhibition rate of 71.3 % and 63.8%, respectively. Strain B26 was primarily identified as Bacillus subtilis through the characterization of morphological features, cultural characteristic observation PDA, physiological and biochemical measurements and 16S rDNA sequence analysis of PCR products.

Jujube fruit；post-harvest diseases；antagonistic bacteria；screening；identification

Q939.92

A

1002-6630(2010)09-0150-06

2009-08-31

“十一五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD01A16)；山西省青年基金項(xiàng)目(2008021036-1)；山西省留學(xué)人員科研項(xiàng)目(2008-119)；太原市科技局項(xiàng)目(2008)

耿海峰(1983—)，男，碩士研究生，主要從事微生物的資源利用研究。E-mail：ghf030483@163.com

*通信作者：張麗珍(1977—)，女，副教授，博士，主要從事微生物生態(tài)學(xué)研究。E-mail：lizhen@sxu.edu.cn