低氧通氣對(duì)發(fā)芽粟谷中γ-氨基丁酸含量的影響

白青云，曾 波，顧振新,*

(1.淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

低氧通氣對(duì)發(fā)芽粟谷中γ-氨基丁酸含量的影響

白青云1,2，曾 波2，顧振新2,*

(1.淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

通過分析粟谷發(fā)芽期間主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和γ-氨基丁酸(GABA)含量變化，探討粟谷中GABA富集情況。采用低氧通氣的方法對(duì)發(fā)芽粟谷中游離氨基酸、可溶性蛋白、谷氨酸、GABA含量和谷氨酸脫羧酶(GAD)活性的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究。結(jié)果表明：低氧通氣條件下，發(fā)芽粟谷芽長(zhǎng)增長(zhǎng)，但低于對(duì)照；游離氨基酸含量急劇增長(zhǎng)并高于對(duì)照；可溶性蛋白含量先升高后下降但低于對(duì)照；谷氨酸含量在處理24h內(nèi)升高，隨后下降；GAD活性呈先升高后下降趨勢(shì)，并顯著高于對(duì)照；GABA含量隨處理時(shí)間顯著增加，處理48h時(shí)，GABA含量達(dá)到24.32mg/100g，是未處理的4.78倍，比同期對(duì)照提高87.51%。由此表明，低氧通氣顯著提高了發(fā)芽粟谷中GABA含量，且與游離氨基酸含量和GAD活性顯著正相關(guān)。

發(fā)芽粟谷； 低氧通氣；γ-氨基丁酸； 主要物質(zhì)

粟谷胚乳具有較高的粉質(zhì)特性并且不易脫皮，故經(jīng)常以全粒(帶種皮)的形式消費(fèi)，因此，粟谷中不但含有對(duì)人體具有營(yíng)養(yǎng)作用的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪，而且還含有大量維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維[1]。長(zhǎng)期以來，以白米和面粉為主食的人群因過分考慮口感而忽視營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，導(dǎo)致亞健康人群不斷增多，粟谷等雜糧由于其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值重新受到消費(fèi)者的關(guān)注。發(fā)芽是改善谷物營(yíng)養(yǎng)成分和降低抗?fàn)I養(yǎng)因子的方法之一。尤為突出的是，發(fā)芽能提高谷物功能成分的含量，如糙米發(fā)芽后γ-氨基丁酸(GABA）等功能成分明顯提高[2]。GABA是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，是哺乳動(dòng)物大腦抑制性神經(jīng)傳遞物質(zhì)，具有降血壓、利尿、鎮(zhèn)定神經(jīng)等生理功能[3]。植物組織中GABA含量很低(每克鮮植物組織中GABA含量為0.03～2.00 μ mol)，因此提高食物GABA含量的方法受到廣泛關(guān)注。GABA由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶(GAD)催化脫羧而成。植物在熱激、冷激、機(jī)械損傷、低氧等逆境條件下，均能顯著地促進(jìn)GABA的合成[4]。體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)證明，胞質(zhì)pH值的降低刺激GAD活性，導(dǎo)致GABA積累[5]。目前，關(guān)于食物富集GABA的方法屢見報(bào)道，如厭氧處理富集茶葉中GABA[6]等。植物在浸泡條件下通以適量的空氣形成了低氧環(huán)境，由于所需的O2濃度低于正常值，影響了正常的生理代謝和生長(zhǎng)發(fā)育，刺激植物產(chǎn)生特殊的代謝途徑。低氧脅迫下，植物細(xì)胞發(fā)酵，產(chǎn)生乳酸、丁酸、丙酸等游離酸，細(xì)胞中H+濃度提高，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)酸化[7]，促進(jìn)了GABA的合成。目前，對(duì)粟谷的研究主要集中在發(fā)芽過程中植酸和礦物質(zhì)的變化，有關(guān)粟谷發(fā)芽過程中GABA形成機(jī)理與富集技術(shù)的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以粟谷為試材，研究低氧通氣條件下發(fā)芽粟谷主要物質(zhì)及GABA等含量的變化，旨在探索低氧通氣條件下粟谷發(fā)芽期間主要物質(zhì)及GABA含量的變化規(guī)律，為富含功能成分的發(fā)芽粟谷工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

表1 粟谷主要營(yíng)養(yǎng)成分分析Table 1 Analysis of major nutritional components in foxtail millet g/100g

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粟谷為晉谷34號(hào)，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物遺傳研究所提供，原料于2006年秋季收獲后貯藏于0～4℃密封環(huán)境中，備用。

GABA標(biāo)準(zhǔn)品和PITC(分析純) 美國(guó)Sigma 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200 Series 高效液相色譜儀 Agilent公司；DZF-6020型真空干燥器 上海一恒科技有限公司；UV-2802型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；H1650-W 臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀公司。

1.3 粟谷培養(yǎng)與處理

稱取20g粟谷種子，用去離子水清洗后，除去雜質(zhì)和懸浮的癟粒；用1%的次氯酸鈉消毒30min，再用去離子水洗凈后，于去離子水中25℃浸泡8h。種子浸泡后置于帶蓋的培養(yǎng)瓶中，加入100mL 10mmol/L檸檬酸緩沖液(pH5.8)于33℃黑暗條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)液中通入1.9L/min空氣，通氣量由空氣流量計(jì)控制。粟谷培養(yǎng)期間，每隔24h更換1次培養(yǎng)液，直至培養(yǎng)結(jié)束。以浸泡后的種子在培養(yǎng)皿中用去離子水浸漬培養(yǎng)作為對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后取出發(fā)芽粟谷，用液氮速凍后于－20℃儲(chǔ)藏，直至測(cè)定。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

芽長(zhǎng)：隨機(jī)選取20粒發(fā)芽粟谷種子，用游標(biāo)卡尺測(cè)定其芽長(zhǎng)；總糖：采用蒽酮比色法[8]；粗蛋白：采用凱氏定氮法測(cè)定，計(jì)算系數(shù)為5.83[8]；粗脂肪：采用索氏抽提法測(cè)定[8]；還原糖：采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定[8]；游離氨基酸：采用水合茚三酮顯色法測(cè)定[8]；可溶性蛋白質(zhì)：采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定[8]；GABA含量(以發(fā)芽粟谷鮮質(zhì)量計(jì))、谷氨酸含量和GAD活性：參照Bai等[9]的方法測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 粟谷主要營(yíng)養(yǎng)成分

粟谷的主要化學(xué)成分見表1。粟谷中主要成分是總糖，其次是粗蛋白、水分和粗脂肪含量，其余成分含量較低。粟谷中粗蛋白含量明顯高于大米(8.4%)[10]，與小麥粉(11.89%)相差不大[11]，粗脂肪含量分別比大米、小麥高1倍左右；總糖含量與玉米相當(dāng)，但低于大米和小麥粉含量[10]。粟谷中含有5.21mg/100g GABA，與糙米中的含量相當(dāng)[12]，提示粟谷可以作為富集GABA的食品原料。

表 2 粟谷中氨基酸組成及含量Table 2 Amino acid compositions and contents in foxtail millet

粟谷中氨基酸組成及含量見表2。粟谷含有17種氨基酸，其中谷氫酸含量最高，為2.871%，賴氨酸和胱氨酸含量較低，分別為0.250%和0.206%。由此表明，粟谷是一種對(duì)人體具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的食物。

2.2 發(fā)芽粟谷芽長(zhǎng)的變化

圖 1 通氣處理?xiàng)l件下粟谷發(fā)芽期間芽長(zhǎng)的變化Fig.1 Change in sprout length of millet during germination under hypoxic ventilation

如圖1所示，通氣處理期間，粟谷芽呈不斷增長(zhǎng)趨勢(shì)，處理60h時(shí)，粟谷芽長(zhǎng)為2.43mm，通氣處理?xiàng)l件下粟谷芽的生長(zhǎng)顯著低于浸漬培養(yǎng)，培養(yǎng)60h，通氣處理?xiàng)l件下粟谷的芽長(zhǎng)僅為浸漬培養(yǎng)下芽長(zhǎng)的16.77%。由此說明，通氣處理顯著抑制了粟谷芽的生長(zhǎng)，減緩了粟谷芽生長(zhǎng)速度。

2.3 發(fā)芽粟谷中游離氨基酸和可溶性蛋白含量的變化

圖 2 通氣處理?xiàng)l件下粟谷發(fā)芽期間游離氨基酸和可溶性蛋白含量的變化Fig.2 Change in free amino acids and soluble proteins of millet during germination under hypoxic ventilation

由圖2可知，隨著通氣處理時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)芽粟谷中游離氨基酸含量呈增加趨勢(shì)，而可溶性蛋白含量呈先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)。處理48h時(shí)，通氣處理?xiàng)l件下發(fā)芽粟谷中游離氨基酸含量達(dá)到最大(207.91μg/g)，是處理前的2.94倍，比浸漬培養(yǎng)提高28.90%；處理12h內(nèi)發(fā)芽粟谷中可溶性蛋白含量增長(zhǎng)，隨后下降，通氣處理?xiàng)l件下發(fā)芽粟谷中可溶性蛋白含量低于對(duì)照?？梢?，發(fā)芽改善了粟谷蛋白質(zhì)品質(zhì)，增加了游離氨基酸含量。2.4 發(fā)芽粟谷中谷氨酸含量的變化

圖3 通氣處理?xiàng)l件下粟谷發(fā)芽期間谷氨酸含量的變化Fig.3 Change in glutamic acid of millet during germination under hypoxic ventilation

由圖3可見，通氣處理?xiàng)l件下發(fā)芽粟谷中谷氨酸含量顯著高于對(duì)照，通氣處理24h時(shí)發(fā)芽粟谷中谷氨酸含量最大，比處理前增加97.24%，是同期對(duì)照處理的1.6倍。由此表明，通氣處理顯著提高了發(fā)芽粟谷中谷氨酸含量。2.5 發(fā)芽粟谷中GAD活性和GABA含量的變化

圖4 通氣處理?xiàng)l件下粟谷發(fā)芽期間GAD活性、GABA含量的變化Fig.4 Change in GAD activity and GABA content of millet during germination under hypoxic ventilation

由圖4可知，通氣處理?xiàng)l件下粟谷發(fā)芽期間GAD活性隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，處理36h時(shí)，GAD活性達(dá)最高值，為7.74U/g，分別比處理前和對(duì)照提高94.96%和42.54%，隨后活力下降，但仍比處理前活性高；發(fā)芽粟谷中GABA含量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而增加，通氣處理48h時(shí)，發(fā)芽粟谷中GABA含量達(dá)到24.32mg/100g，是發(fā)芽前的4.78倍，比同期對(duì)照提高87.51%，隨后GABA含量無顯著變化。通氣處理?xiàng)l件下，谷氨酸含量最大值出現(xiàn)時(shí)間比GABA含量最大值提前(圖3、4)，這為GABA的合成提供了充足的底物。進(jìn)一步推出，通氣處理?xiàng)l件下發(fā)芽粟谷中GAD活性和游離谷氨酸含量增加促進(jìn)了GABA的合成，正是由于GABA的合成導(dǎo)致了谷氨酸含量的下降，而谷氨酸含量的下降限制了GABA的繼續(xù)合成。

2.6 發(fā)芽粟谷GABA含量與其他指標(biāo)相關(guān)性分析

對(duì)通氣處理下粟谷發(fā)芽期間GABA含量與芽長(zhǎng)、游離氨基酸、可溶性蛋白質(zhì)、谷氨酸和GAD活性之間進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。

表3 通氣處理?xiàng)l件下發(fā)芽粟谷中GABA含量與其他指標(biāo)相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of GABA content and other parameters in germinated millet under hypoxic ventilation

由表3可見，發(fā)芽粟谷中GABA含量與芽長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，與游離氨基酸和GAD活性呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，與可溶性蛋白和谷氨酸含量呈正相關(guān)性但不顯著(P＞0.05)。由此說明，粟谷發(fā)芽期間GABA的富集與粟谷生長(zhǎng)狀況有關(guān)，游離氨基酸和谷氨酸含量的增加及GAD活性的提高均有利于GABA的富集。

3 討 論

植物受到低氧、冷激、熱激、干旱、鹽脅迫和機(jī)械傷害等逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)GABA含量顯著增加，其中以低氧逆境脅迫誘導(dǎo)植物積累GABA量最大[13]。低氧脅迫引起植物細(xì)胞質(zhì)酸化[7]，Kurkdjian等[14]報(bào)道證實(shí)，低氧可使細(xì)胞質(zhì)pH值下降0.4～0.8個(gè)單位，胞質(zhì)pH值的降低刺激GAD活性，導(dǎo)致GABA積累[5]。低氧脅迫下，植物通過磷酸戊糖途徑減少有毒物質(zhì)的積累，生成谷氨酸和GABA以抵御逆境脅迫，調(diào)節(jié)細(xì)胞酸度[15]。逆境條件下，由于谷氨酸濃度的增加使GABA富集量增多。Snedden等[16]通過14C標(biāo)記的谷氨酸處理蘆筍葉肉細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)植物組織中存在著H+與谷氨酸協(xié)同運(yùn)輸?shù)耐ǖ?，這個(gè)通道依賴于GAD活力，谷氨酸由此通道自由穿過細(xì)胞質(zhì)膜，以維持細(xì)胞內(nèi)外的動(dòng)態(tài)平衡。本研究結(jié)果顯示，低氧通氣處理下，粟谷中的谷氨酸含量顯著增加，這為GABA合成提供了底物，低氧通氣刺激了粟谷GAD活性，從而促進(jìn)GABA的合成。

植物體內(nèi)蛋白質(zhì)等含氮化合物的變化是反映環(huán)境脅迫下植物代謝變化較為敏感的生理指標(biāo)之一。植物體內(nèi)的可溶性蛋白大部分是參與各種代謝的酶類，其含量是了解植物體代謝水平的一個(gè)重要指標(biāo)。低氧脅迫下，植物根系蛋白質(zhì)合成被抑制。本研究表明，低氧條件下粟谷中可溶性蛋白質(zhì)含量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)降低，這與高洪波等[17]研究結(jié)果一致。研究表明，低氧逆境下植物體內(nèi)氮代謝途徑發(fā)生改變，硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量的提高對(duì)增強(qiáng)其抗性起重要的作用。薛崧等[18]研究表明，水分脅迫下山黧豆種子總游離氨基酸含量隨著萌發(fā)逐漸增加，根芽脯氨酸、谷氨酸和絲氨酸含量最高，這些氨基酸通過蛋白水解后在子葉中以游離態(tài)存在，為根芽生長(zhǎng)提供了含氮化合物。本研究中通氣處理下，發(fā)芽粟谷游離氨基酸含量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)增加，這與前人的研究結(jié)果一致。

姚森等[19]證實(shí)，發(fā)芽糙米中GABA含量與其芽長(zhǎng)和GAD活性有顯著正相關(guān)性?？当虮虻萚20]實(shí)驗(yàn)表明，發(fā)芽糙米中GABA含量與原料中氨基酸、必需氨基酸和谷氨酸含量正相關(guān)。本研究表明，粟谷發(fā)芽期間GABA含量與芽長(zhǎng)、游離氨基酸含量和GAD活性呈顯著正相關(guān)。氨基酸含量的增加為粟谷富集GABA提供了充足的底物，因而促進(jìn)GABA積累。由此推測(cè)，粟谷發(fā)芽期間激活了與GABA合成相關(guān)的酶和底物，從而促進(jìn)了GABA富集。

4 結(jié) 論

粟谷中粗蛋白質(zhì)含量高，氨基酸種類齊全，其中以谷氨酸含量最多，并且含有一定量的GABA。采用通氣處理后，粟谷在發(fā)芽期間芽長(zhǎng)增長(zhǎng)，可溶性蛋白含量先升高后下降，游離氨基酸含量迅速增加，谷氨酸含量先上升后下降，GAD活性顯著提高，GABA含量顯著增加。相關(guān)性分析表明，通氣處理下發(fā)芽粟谷中GABA含量與芽長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)、游離氨基酸含量和GAD活性呈極顯著正相關(guān)，與可溶性蛋白和谷氨酸含量呈正相關(guān)性。

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Effect of Hypoxic Ventilation onγ-Aminobutyric Acid Content in Germinated Foxtail Millet

BAI Qing-yun1,2，ZENG Bo2，GU Zhen-xin2,*
(1. School of Life Science and Chemical Engineering, Huaiyin Institute of Technology, Huai’an 223003, China；2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to provide theoretical references for the deep development of millet, γ-Aminobutyric acid (GABA)accumulation in foxtail millet was explored through analyzing the change of major nutritional components and GABA content during the germination of millet. Dynamic changes of free amino acids, soluble proteins, glutamic acid, GABA content and glutamate decarboxylase (GAD) activity in germinated millet were investigated by the treatment of hypoxic ventilation. Results showed that sprout length of germinated millet were increased under hypoxic ventilation, however, the sprout length was still lower than that of the control; the content of free amino acids exhibited a rapid increase and higher than that of the control; the content of soluble proteins exhibited an initial increase and then a decrease, and lower than that of the control; an increase in glutamic acid content during first 24 h treatment of hypoxic ventilation and a following decrease were observed; GAD activity revealed a trend of initial increase and following reduction, and markedly higher than that of the control; GABA content revealed an increase during 48 h treatment of hypoxic ventilation and following decline. The maximal content of GABA was 24.32 mg/100g FW, which were 4.78 folds compared with pre-treatment, and higher 87.51% than the control at the same treatment time. These investigations indicated that hypoxic ventilation significantly improved GABA content of germinated millet, and GABA content exhibited a significantly positive correlation with free amino acids and GAD activity.

germinated foxtail millet；hypoxic ventilation；γ-aminobutyric acid；essential substance

TS210.2

A

1002-6630(2010)09-0049-05

2009-09-21

江蘇省高新技術(shù)項(xiàng)目(BG2004323)

白青云(1973—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：baiqy@hyit.edu.cn

顧振新(1956—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：guzx@njau.edu.cn