Th17及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及相關(guān)因子在頸動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過(guò)程中的作用及其機(jī)制

郭三強(qiáng)　韓升波　李　敏

(鄭州市中醫(yī)院心內(nèi)科，河南　鄭州　450007)

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Th17及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及相關(guān)因子在頸動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過(guò)程中的作用及其機(jī)制

郭三強(qiáng)韓升波1李敏2

(鄭州市中醫(yī)院心內(nèi)科，河南鄭州450007)

〔摘要〕目的探討T輔助性17(Th17)細(xì)胞及CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞及相關(guān)因子在頸動(dòng)脈粥樣硬化(AS)患者外周血中的表達(dá)水平及Th17細(xì)胞影響AS發(fā)病的機(jī)制。方法選取2012年7月至2014年7月來(lái)該院治療的AS患者(60例)為研究組，選取同期來(lái)該院體檢的健康人群為對(duì)照組(40例)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AS患者及正常人外周血中Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞水平，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)兩組人群外周血中白介素(IL)-17以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β的水平；采用RT-PCR法檢測(cè)兩組人群外周血中轉(zhuǎn)錄因子RORγT及Foxp3的mRNA水平。結(jié)果AS患者中Th17細(xì)胞比例，血清IL-17水平及外周血RORγT mRNA水平顯著高于A(yíng)S對(duì)照組；Treg細(xì)胞比例、血清TGF-β水平及外周血Foxp3 mRNA水平顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論Th17細(xì)胞及相關(guān)因子可能參與促進(jìn)AS的產(chǎn)生，Treg細(xì)胞及相關(guān)因子可能參與抑制AS的產(chǎn)生，阻斷AS患者體內(nèi)的IL-17可能作為治療AS的潛在手段。

〔關(guān)鍵詞〕Th17；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；IL-17；TGF-β；頸動(dòng)脈粥樣硬化

1鄭州市中醫(yī)院消毒供應(yīng)室2鄭州市中醫(yī)院檢驗(yàn)科

第一作者：郭三強(qiáng)(1972-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事冠心病方面的研究。

目前，在動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)病過(guò)程中的細(xì)胞學(xué)機(jī)制尚未完全清楚。CD4+T細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)中的一種重要免疫細(xì)胞，在抗原與抗原提呈細(xì)胞(APC)存在時(shí)可以分化為不同亞群，包括Th1、Th2、Th17及Treg細(xì)胞〔1~3〕。Th17與Treg功能上的失衡可能在A(yíng)S的形成發(fā)展中起著重要的作用：Th17細(xì)胞是一群在TCR通路和細(xì)胞因子白介素(IL)-6及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β的刺激下分化的細(xì)胞亞群〔4〕，該細(xì)胞群參與AS的慢性炎癥病理過(guò)程〔5〕；Treg細(xì)胞則是一類(lèi)調(diào)控機(jī)體免疫功能的細(xì)胞群，能維持免疫系統(tǒng)對(duì)自身成分的耐受，使機(jī)體保持免疫穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，Apoe-/-小鼠體內(nèi)Treg細(xì)胞能夠通過(guò)產(chǎn)生IL-10水平來(lái)減輕病理免疫反應(yīng)，減慢AS的形成〔6〕。目前，對(duì)于Th17/Treg在A(yíng)S形成的具體作用及機(jī)制尚不完全明了，本研究旨在探討Th17及Treg細(xì)胞與AS的聯(lián)系。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇2012年7月至2014年7月入住我院的60 例AS患者為研究組，同時(shí)選取同期40例健康體檢者作為對(duì)照組。研究組通過(guò)頸動(dòng)脈彩超證實(shí)有AS，其中男25例，女35例，年齡42~68歲(55.26±8.32)歲；對(duì)照組男14例，女26例，年齡44～67歲，平均(54.51±9.17)歲。兩組患者的性別、年齡等一般資料方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞流式染色兩組患者均在早晨空腹采集外周血5 ml，加入EDTA抗凝劑和紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后，以完全1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)濃度至1×106/ml。Th17細(xì)胞染色：離心并重懸于100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加入CD3-APC(eBioscience，0.2 mg/ml)和CD4-FITC(eBioscience，0.25 mg/ml)抗體，混勻后室溫避光孵育40 min，以PBS沖洗，加入破膜固定工作液1 ml后4℃避光孵育30 min，離心后，重懸于100 μl permeabilization buffer中，加入IL-17-PE(BioLegend，0.25 mg/ml)，4℃避光孵育30 min，以PBS緩沖液洗2遍后，以500 μl緩沖液重懸細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，美國(guó)BD公司)檢測(cè)。Treg細(xì)胞染色：離心并重懸于100 μl PBS中，加入CD25-APC(eBioscience，0.25 mg/ml)和CD4-FITC(eBioscience，0.25 mg/ml)抗體，混勻后室溫避光孵育40 min。以PBS洗1遍，加入破膜固定工作液1 ml后4℃避光孵育40 min，離心后，重懸于100 μl permeabilization buffer中，加入2 μl Fc受體阻斷劑(eBioscience)，4℃避光孵育20 min，加入抗FoxP3-PE(eBioscience，0.15 mg/ml)抗體，置4℃避光孵育40 min，以PBS緩沖液沖洗后，以500 μl緩沖液重懸細(xì)胞后用流式檢測(cè)。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)血清中IL-17及TGF-β水平所有試劑盒均購(gòu)自達(dá)科為科技有限公司，檢測(cè)流程嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3采用RT-PCR法檢測(cè)外周血中轉(zhuǎn)錄因子RORγT及Foxp3的mRNA水平外周血離心后提取上層血漿150 μl，加入到1 ml Trizol充分勻漿，按照說(shuō)明書(shū)的要求抽提總RNA，所得RNA溶于25 μl DEPC處理水中。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析，然后再采用Femantes逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆?。本?shí)驗(yàn)PCR反應(yīng)條件：95℃變性20 s，然后60℃ 20 s和70℃ 1 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。RORγT引物序列：正義：5′-GCAGCGCTCCAACATCTTCT-3′，反義：5′-ACGTACTGAATGGCCTCGGT-3′； Foxp3引物序列：正義：5′-CACCTGGCTGGGAAAATGG-3′，反義：5′-GGAGCCCTTGTCGGATGA-3′； 內(nèi)參GAPDH引物序列：正義：5′-GCATGGGTCAGAAGGATTCCTc-3′，反義：5′-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3′。使用ABI公司的7900型號(hào)Real-Time PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增，所得結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析〔7〕。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1兩組外周血Th17及Treg水平比較對(duì)照組人群外周血中Th17細(xì)胞比例〔(0.57±0.41)%〕顯著低于研究組〔(1.87±0.31)%〕(t=18.03,P<0.01)；對(duì)照組人群外周血中Treg細(xì)胞比例〔(1.52±0.47)%〕顯著高于研究組〔(0.81±0.38)%〕(t=8.32,P<0.01)。

2.2兩組外周血中血清中IL-17及TGF-β水平研究組血清中IL-17水平〔(33.21±8.41)pg/ml〕顯著高于對(duì)照組〔(17.12±8.80)pg/ml〕(t=9.20，P<0.01)；研究組血清中TGF-β水平〔(17.21±8.73)pg/ml〕顯著低于對(duì)照組〔(27.21±9.27)pg/ml〕(t=5.47，P<0.01)。

2.3兩組外周血中轉(zhuǎn)錄因子RORγT及Foxp3的水平研究組外周血RORγT mRNA水平(3.23±0.25)顯著高于對(duì)照組(1.00±0.09)(t=63.222，P=0.000)；研究組外周血Foxp3 mRNA的表達(dá)水平(0.28±0.06)顯著低于對(duì)照組(1.06±0.13)(t=35.510,P=0.000)。

3討論

AS是一種主要累及主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈、腦動(dòng)脈、腎動(dòng)脈和大、中型肌彈力型動(dòng)脈，從而導(dǎo)致管腔狹窄以至完全堵塞，使這些重要器官缺血缺氧、功能障礙導(dǎo)致機(jī)體死亡。AS的主要臨床表現(xiàn)為血脂水平的升高，同時(shí)伴有炎癥和自身免疫系統(tǒng)病變的發(fā)生〔8〕。炎癥是介導(dǎo)AS發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中重要的啟動(dòng)因素，隨著炎癥的發(fā)展，AS患者體內(nèi)活化的白細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等釋放出多種細(xì)胞因子，如纖維生長(zhǎng)因子(FGF)、TGF-β以及表皮生長(zhǎng)因子(EGF樣因子)等，從而刺激成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖及遷移，最終形成內(nèi)膜纖維肌性增殖性病變，使得AS逐漸加重〔9〕。

Th17及Treg 細(xì)胞是CD4+T淋巴細(xì)胞兩大類(lèi)重要的亞群。其中，Th17是一群在IL-6、TGF-β等因子誘導(dǎo)下產(chǎn)生的T細(xì)胞亞群，該細(xì)胞能夠通過(guò)分泌IL-17參與自身免疫性疾病的機(jī)體防御〔10,11〕。Treg細(xì)胞是一群具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，可在存在IL-10和TGF-β等細(xì)胞因子的條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生，該細(xì)胞能夠通過(guò)分泌TGF-β等因子參與機(jī)體多種自身免疫疾病的發(fā)生及發(fā)展，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、再生障礙性貧血、Ⅰ型糖尿病等〔11，12〕。

Th17及Treg細(xì)胞在A(yíng)S中也日益受到人們的廣泛關(guān)注。Zhu等〔13〕認(rèn)為，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者中，Th17及Treg細(xì)胞的失衡能夠顯著增加AS的發(fā)病率。Liu等〔14〕發(fā)現(xiàn)，在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的AS小鼠模型中，Th17能夠促進(jìn)AS的發(fā)生。Rosario Espinoza Mora等〔15〕發(fā)現(xiàn)，在心源性休克患者體內(nèi)Th17細(xì)胞數(shù)量顯著增加，被認(rèn)為是該病的一個(gè)危險(xiǎn)因素。在小鼠肝損傷模型中，在雷公藤誘導(dǎo)肝臟損傷的同時(shí)，Th17/Treg細(xì)胞亦發(fā)生失衡，偏向Th17分化〔16〕。本研究結(jié)果提示Th17/Treg 細(xì)胞的失衡參與了AS患者的免疫應(yīng)答，這與以往研究認(rèn)為的Th17可能具有潛在的促進(jìn)AS的功能相一致〔6,17〕。此外，AS患者中Th17/Treg細(xì)胞的失衡可能通過(guò)影響分泌的因子來(lái)參與調(diào)節(jié)AS的進(jìn)程。

Subramanian等〔18〕認(rèn)為，Treg細(xì)胞介導(dǎo)的抑制AS過(guò)程主要依賴(lài)于Myd88信號(hào)途徑。而Wasserman等〔19〕發(fā)現(xiàn)，IL-33可以通過(guò)增加Treg細(xì)胞水平來(lái)抑制AS的發(fā)展。本研究提示了IL-17可能參與并促進(jìn)AS發(fā)病的過(guò)程。

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〔2015-10-08修回〕

(編輯滕欣航)

通訊作者：李敏(1978-)，女，主管護(hù)師，主要從事職業(yè)防護(hù)方面的研究。

基金項(xiàng)目：鄭州市2014年市級(jí)指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.20140526)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R743.3

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)03-0590-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.033