在骨組織愈合中炎癥反應(yīng)聯(lián)合血管生成的研究進(jìn)展①

袁 翰 蔣逸秋 郭 楊 馬 勇 黃桂成

(南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所,南京210023)

在骨組織愈合中炎癥反應(yīng)聯(lián)合血管生成的研究進(jìn)展①

袁 翰 蔣逸秋 郭 楊 馬 勇 黃桂成

(南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所,南京210023)

延遲愈合與骨不連仍然是骨科臨床工作中較為棘手的問題。延遲愈合發(fā)生后，甚至需要重新顯露手術(shù)，進(jìn)而延長了患者在院時間，推遲了復(fù)健周期，增加治療經(jīng)費(fèi)負(fù)擔(dān)[1]。骨組織在愈合過程中不產(chǎn)生疤痕組織，這可能與骨組織獨(dú)特的愈合過程有關(guān)[2]。對骨組織愈合過程中炎癥反應(yīng)、血管生成與組織重建之間關(guān)系的交叉研究將有助于揭示骨組織修復(fù)過程的調(diào)控機(jī)理。

骨損傷的愈合過程存在一系列精確調(diào)控的交替過程。骨組織的愈合過程從炎癥反應(yīng)開始，免疫細(xì)胞初期釋放出炎癥因子，從而招募、富集間充質(zhì)干細(xì)胞并引導(dǎo)其分化[3]。這一關(guān)鍵過程也與血管再生和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和塑形相關(guān)[4]。尤其在骨折愈合過程中，肉芽組織的產(chǎn)生與成熟形成了軟性骨痂，提供骨組織重建過程中一定的力學(xué)穩(wěn)定性。進(jìn)而成纖維組織形成纖維軟骨組織并進(jìn)一步演變?yōu)橥该鬈浌恰＜?xì)胞外基質(zhì)初期包含Ⅱ型膠原，但隨即在礦化前期為X型膠原替代。骨愈合過程中的軟骨組織缺乏血管網(wǎng)覆蓋，但在礦化過程中逐漸血管化。伴隨著Ⅰ型膠原的沉積和交織型骨組織的出現(xiàn)，硬骨痂形成。進(jìn)而一系列的改建過程將持續(xù)數(shù)月到數(shù)年，這其中滋養(yǎng)血管網(wǎng)的改建也伴隨始終，直至達(dá)到骨組織的力學(xué)穩(wěn)定狀態(tài)[5]。

總之，現(xiàn)階段對于骨愈合過程中炎癥血管生成的研究主要集中于骨創(chuàng)傷后血管紊亂狀態(tài)的糾正過程以及骨礦化過程中軟骨內(nèi)血管網(wǎng)的形成過程。本文綜述了骨愈合過程中的炎癥反應(yīng)模式，以及炎癥反應(yīng)在骨愈合血管生成的作用機(jī)制。

1 骨修復(fù)過程中的炎癥反應(yīng)

免疫細(xì)胞與炎性細(xì)胞因子在骨修復(fù)過程中扮演著重要角色。由于對骨細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制認(rèn)識越來越深入，骨免疫學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。

1.1 破骨細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng) 在細(xì)胞來源上，破骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞來源于相同的祖細(xì)胞[6]。T淋巴細(xì)胞表達(dá)核因子受體活化因子配體(RANKL)刺激了破骨細(xì)胞的生成[7]。輔助性T細(xì)胞17(Th17)可以通過白介素17(IL-17)促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟[8,9]。

隨著研究的深入，更多的炎癥信號分子被證實參與破骨細(xì)胞的調(diào)控。T細(xì)胞可以通過細(xì)胞間信號交互或者表達(dá)分泌轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)[10]、IL-4[11]以及IL-10[12]，對破骨細(xì)胞的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。有多條信號通路參與了炎癥反應(yīng)對破骨細(xì)胞的調(diào)控。Th17細(xì)胞可通過細(xì)胞因子的共同作用，激活RANKL信號通路從而啟動破骨細(xì)胞的激活，并因此阻止破骨細(xì)胞分化[13]。類似的生物效應(yīng)通路主要有Th1細(xì)胞分泌的干擾素γ(IFN-γ)[13],可以啟動破骨細(xì)胞內(nèi)特定酶的表達(dá)。該細(xì)胞間信號存在反饋機(jī)制，在破骨細(xì)胞酶功能變化時，可反向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖功能。

1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞與炎癥反應(yīng)的調(diào)控 在骨組織損傷發(fā)生時，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)被細(xì)胞因子從外周富集到損傷部位，分化為成骨祖細(xì)胞，進(jìn)一步分化為成骨細(xì)胞[14,15]。MSC細(xì)胞具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，可下調(diào)局部的腫瘤壞死因子α(TNF-α)并上調(diào)抗炎因子IL-10[16,17]，從而影響了局部炎癥微環(huán)境。MSC細(xì)胞作為一種新的臨床細(xì)胞療法，有學(xué)者報道MSC可通過促使巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化進(jìn)而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能[18]。同時通過轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β )和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號通路，MSC細(xì)胞可以抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生，并促使調(diào)節(jié)型T細(xì)胞的產(chǎn)生[19]。因此除了細(xì)胞因子可以刺激MSC干細(xì)胞的增殖與分化，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間還存在信號反饋機(jī)制，并且通過多個信號通路調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增殖、凋亡和免疫功能。

1.3 炎癥反應(yīng)與成骨細(xì)胞生成 在炎癥反應(yīng)過程中，T淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞釋放一系列炎癥因子對局部成骨環(huán)境產(chǎn)生深刻影響。在炎性細(xì)胞因子如TNF-α和IL-1的存在下，NF-кB信號通路的激活，成骨細(xì)胞在骨創(chuàng)傷炎癥早期生成[20],然而NF-кB信號通路的持續(xù)激活進(jìn)一步可以導(dǎo)致MSC凋亡增加，以及成骨細(xì)胞的凋亡增多[19]。IL-4、IL-13等炎性因子則可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞的細(xì)胞遷移[21]，并通過STAT信號通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生并減少骨吸收。反之，文獻(xiàn)報道IL-10和IFNγ在體內(nèi)體外實驗以及臨床觀察中干預(yù)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[22]。

骨修復(fù)過程顯然需要穩(wěn)定的免疫系統(tǒng)支持。文獻(xiàn)報道在骨愈合初期，嚴(yán)密調(diào)控下的初始免疫應(yīng)答雖然短暫，但可以級聯(lián)式的引發(fā)骨修復(fù)過程[23]。然而也有研究團(tuán)隊報道了免疫反應(yīng)對骨愈合過程的負(fù)面影響[24]。免疫調(diào)控十分精密而復(fù)雜，TNF-α缺失會引起骨的延遲愈合，然而長時間過表達(dá)TNF-α則引起骨破壞[23]。因此相同免疫反應(yīng)既可以促進(jìn)骨愈合，也可以導(dǎo)致骨愈合障礙。

因此筆者認(rèn)為骨創(chuàng)傷發(fā)生后，炎癥反應(yīng)是一種組織損傷的保護(hù)機(jī)制，應(yīng)當(dāng)為后期修復(fù)和愈合的基礎(chǔ)。因此炎癥反應(yīng)應(yīng)當(dāng)具有較短的周期并且可以引發(fā)進(jìn)一步的愈合機(jī)制。反之，如果炎癥反應(yīng)遷延或過強(qiáng)，會對組織造成損傷。脈管系統(tǒng)在這些炎癥反應(yīng)中扮演重要角色，尤其是急慢性炎癥中各階段均有毛細(xì)系統(tǒng)參與，佐證了脈管系統(tǒng)對炎癥的支持作用。血管生成作用也從一個側(cè)面反應(yīng)炎癥的病程。如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病灶組織中，炎癥的病程常伴有血管大量生成。這種血管的過度生成往往表明骨愈合減緩。

在骨愈合初期，血流量與創(chuàng)傷前比較具有大幅減少。血流量在骨愈合過程中逐步提高，最終可以超過創(chuàng)傷發(fā)生前水平。在骨愈合過程中組織缺氧信號廣泛影響血管的生理或病理再生，其中缺氧轉(zhuǎn)錄因子(HIFs) 起到了介導(dǎo)血管生成的核心作用。有較多研究揭示HIF信號通路與其下游靶點(diǎn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在骨修復(fù)和軟骨修復(fù)中起到重要調(diào)節(jié)作用[25]。在動物模型和臨床實驗中通過對該信號通路的藥物干預(yù)，發(fā)現(xiàn)血管生成反應(yīng)與炎癥反應(yīng)一樣，需要控制在合理水平以利于組織修復(fù)。

2 血管生成與炎癥反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

盡管血管生成研究起步較早，但除血管內(nèi)皮細(xì)胞外，近年來免疫細(xì)胞的作用日益受到關(guān)注。

2.1 巨噬細(xì)胞系介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與血管化 巨噬細(xì)胞參與多種類型的免疫反應(yīng)，是炎性血管化和血管改建的細(xì)胞樞紐。局部組織的巨噬細(xì)胞與循環(huán)血中的巨噬細(xì)胞在局部缺血模型中可刺激動脈形成因而有助于增加血管系統(tǒng)生成[26]。眾多分泌性產(chǎn)物與這一過程相關(guān)，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)[27]，胰島素樣生長因子(IGF-1)、血小板源性生長因子(PDGF)、TGFα/β、成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)等，白細(xì)胞介素類物質(zhì)如TNF-α、IL-8、IL-1β等也有研究報道。

巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)可以深刻影響其對血管生成的促進(jìn)作用。巨噬細(xì)胞可以激活為M1、M2巨噬細(xì)胞，通過Th1和Th2細(xì)胞提呈；M1巨噬細(xì)胞也經(jīng)由經(jīng)典激活信號分子如TNF-α、IFN-γ、脂多糖(LPS)等促炎因子引發(fā)早期急性炎癥。相似的，在慢性炎癥中M2型巨噬細(xì)胞通過IL-4、IL-10和IL-13等炎癥抑制因子激活，并且激活反應(yīng)與血管生成或血管重塑相關(guān)[28]。而在腫瘤的血管化過程中，腫瘤巨噬細(xì)胞較M2型巨噬細(xì)胞有更明顯的極化，加速腫瘤血管化過程[29]。組織中血管的生成和重塑有顯著的關(guān)聯(lián)性，甚至有假說認(rèn)為M2型巨噬細(xì)胞可以分化為一類具有特定促血管生成作用的細(xì)胞亞型[30]。

巨噬細(xì)胞在IL-4與IL-13的作用下可以分化為M2a，或在免疫復(fù)合體與TLR/IL-1R拮抗劑的作用下分化為M2b[31]。然而僅有被IL-10誘導(dǎo)產(chǎn)生的M2c型細(xì)胞具有較強(qiáng)的促血管生成作用，與此同時抑制炎癥反應(yīng)并增加細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和重塑[32]。還有研究暗示M1、M2a以及M2c巨噬細(xì)胞在促進(jìn)血管生成方面均具有重要作用并且作用各不相同[33]。M1型巨噬細(xì)胞可潛在分泌如VEGF等的血管生成因子，而M2a細(xì)胞分泌了血小板源性生長因子(PDGF)將外膜細(xì)胞募集至局部，M2c則釋放金屬蛋白酶9(MMP9)參與血管的重塑過程[33]。

2.2 非巨噬細(xì)胞參與的炎性血管生成 其他免疫細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等均可能在血管生成與改建的過程中參與?？寡滓蜃尤绻腔蓟蚯傲邢偎谽可以激活樹突狀細(xì)胞分泌大量VEGF以及少量成纖維細(xì)胞生長因子[34]。此外肥大細(xì)胞也可以潛在分泌VEGF、PDGF、bFGF等[35]。近年來發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞在缺血組織中表達(dá)MMP-9，從而增強(qiáng)VEGF的血管生成效應(yīng)[32]。通過在腫瘤模型領(lǐng)域的研究，有團(tuán)隊報道了T細(xì)胞可直接參與血管再生過程，加速血管形成。出現(xiàn)血管損傷或缺氧的局部通過表達(dá)CCL28等可富集大量T細(xì)胞，進(jìn)而提高局部VEGF水平。通過免疫耗竭方式減少局部CD25、CD4雙陽性細(xì)胞可以顯著抑制局部VEGF水平，減少血管生長速度[36]。另外學(xué)者觀察自然殺傷細(xì)胞的數(shù)量與動脈生成有關(guān)。自然殺傷細(xì)胞在血管生成過程中的作用報道較少，可能機(jī)制為釋放IFN-γ促使T細(xì)胞分化[37]。體外實驗證實VEGF可以促進(jìn)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，且T細(xì)胞通過與單核細(xì)胞的直接接觸和旁分泌方式導(dǎo)致單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檠装Y狀態(tài)[38]。

3 炎癥反應(yīng)在血管生成與骨修復(fù)中的意義

骨愈合過程中，均需要經(jīng)歷炎癥反應(yīng)與血管生成過程。炎癥反應(yīng)與血管生成不僅是骨愈合的關(guān)鍵過程，而且在發(fā)生過程上受到精密調(diào)控。如果炎癥反應(yīng)和血管生成過程受到干擾，將導(dǎo)致骨愈合減緩或障礙。

3.1 血腫形成階段的調(diào)控 在骨損傷發(fā)生后，由于血管功能異常，局部形成血腫。在血腫結(jié)構(gòu)中，多種細(xì)胞類型共存，這與血液中的細(xì)胞類型相一致。血腫組織暫時填充了骨創(chuàng)傷的缺損部位，與骨組織斷端、骨髓腔、骨膜、內(nèi)皮和肌肉相接觸，這一環(huán)境給予了進(jìn)一步骨修復(fù)的空間。血腫初期常見到細(xì)胞比例的快速變化，主要是由于有核細(xì)胞，尤其是中性粒細(xì)胞的壽命較短。在綿羊骨損傷模型[23]中，該觀點(diǎn)已經(jīng)得到證實。血腫組織內(nèi)的細(xì)胞組分持續(xù)發(fā)生變化，細(xì)胞毒性T細(xì)胞數(shù)量在正常愈合過程中持續(xù)下降，輔助T細(xì)胞比例上升。與此過程相伴有多重細(xì)胞因子的表達(dá)，主要是在造模后24～36 h表達(dá)抗炎性因子如IL-10和TGF-β。炎癥反應(yīng)下調(diào)的同時，血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子同期開始表達(dá)，較有代表性的是HIF-1α、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)[23]。這一過程暗示血管生成和炎癥反應(yīng)在特定階段可以具有相互依存關(guān)系。

骨膜是血管新生的重要起源，在骨損傷60 h后，骨膜中HIF-1α、PDGF、和血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD34等表達(dá)上調(diào)，與炎癥信號的回落相呼應(yīng)。在骨修復(fù)中尤其是血管重建后與軟骨成骨發(fā)生過程中，髓細(xì)胞因子(SDF-1)在骨膜間充質(zhì)干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間均有表達(dá)，其表達(dá)水平亦與局部缺氧相關(guān)，其表達(dá)后不僅加速血管生成，且在骨膜組織中兼具有富集間充質(zhì)干細(xì)胞和加快軟骨內(nèi)成骨的作用[1]。SDF-1主要功能是與下游受體CXCR4結(jié)合，并激活JAK/STAT、PI3K/Akt 和ERK1/2等多條信號通路,廣泛調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞的增殖與遷移?？傊怯线^程和血管生成通過炎癥反應(yīng)引發(fā)，隨后炎癥水平的逐步下降又是血管生成反應(yīng)乃至骨修復(fù)的啟動因素。

3.2 炎癥反應(yīng)失調(diào)推遲血管生成 在炎癥反應(yīng)失調(diào)模型中，延長了炎癥過程并觀察到血管生成發(fā)育明顯滯后。在炎癥反應(yīng)延長模型中，第21天時血管假性血友病因子(vWF)在模型組骨膜中表達(dá)依然較少，而在血腫組織中血管生成相關(guān)因子包括VEGF、vWF、PDGF等均表達(dá)較少[39]。而對比正常組可以發(fā)現(xiàn)，正常組由于血供恢復(fù)快，因此傷后7 d可見HIF-1α表達(dá)顯著減少[23]，標(biāo)志著局部供氧水平提高，血管已經(jīng)再生改善局部血運(yùn)。在正常組中，組織學(xué)觀察能在7 d左右見到血管形成。長期實驗觀察到血管生成速度以及骨愈合速度在炎癥反應(yīng)失調(diào)動物中明顯減慢。

上述研究結(jié)果通過動物模型系統(tǒng)分析了炎癥反應(yīng)在引發(fā)血管生成和進(jìn)一步骨愈合的重要性。尤其是在傷后60 h局部愈合過程已經(jīng)完全開始。然而臨床環(huán)境下骨創(chuàng)傷發(fā)生后需要等待較長時間接受手術(shù)，術(shù)中又往往切除血腫部分，從而損失了早期愈合過程中積累的細(xì)胞與生長因子。術(shù)后產(chǎn)生的新血腫和周圍組織又將處于不同的階段，從而導(dǎo)致骨組織愈合過程的紊亂。因此在現(xiàn)階段手術(shù)中如何能保存血腫組織或保存細(xì)胞環(huán)境乃是外科技術(shù)的發(fā)展方向。

4 總結(jié)與展望

骨外科領(lǐng)域已經(jīng)廣泛認(rèn)識到骨創(chuàng)傷后血管再通的重要性，可以增加骨愈合和重建的成功率。然而骨愈合過程中免疫系統(tǒng)的作用價值仍然常被忽視。國內(nèi)相關(guān)研究報道尚少，有多位學(xué)者通過文獻(xiàn)報道形式關(guān)注了這一研究方向[40,41]。在動物研究實驗方面，張靈芝等[42]對大鼠牙槽骨組織中的炎癥反應(yīng)進(jìn)行了研究，并觀察到過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)使拔牙后損傷的牙槽骨組織高度下降，牙槽骨組織的損傷恢復(fù)減慢。免疫細(xì)胞與免疫信號與血管化之間具有直接而緊密的聯(lián)系，進(jìn)一步調(diào)控骨修復(fù)中的炎癥反應(yīng)將有助于骨愈合過程。過強(qiáng)的免疫反應(yīng)或是失調(diào)的血管生成反應(yīng)均將導(dǎo)致骨重建失敗。三大系統(tǒng)之間的平衡與分階段調(diào)控將成為骨修復(fù)領(lǐng)域的重要研究方向與治療手段。

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[收稿2016-01-13 修回2016-03-23]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.028

①本文受國家自然科學(xué)基金項目(No.81573997)、江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項目(No.15KJD360001)和江蘇省高校研究生創(chuàng)新計劃項目(No.KYZZ16-0409) 資助。

袁 翰(1988年-)，男，主要從事骨組織工程和骨創(chuàng)傷修復(fù)方面研究，E-mail:hanyuan@njucm.edu.cn。

及指導(dǎo)教師：黃桂成(1958年-)，男，教授,主任醫(yī)師,博士生導(dǎo)師,南京中醫(yī)藥大學(xué)副校長，主要從事脊柱病和脊髓損傷與修復(fù)方面研究，E-mail:hgc@njucm.edu.cn。

R363.2

A

1000-484X(2016)12-1850-05