在制備尖吻蝮蛇毒出血毒素抗血清中不同凝膠染色方法的比較①

韋傳寶 曹佳敏

(皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，六安237012)

在制備尖吻蝮蛇毒出血毒素抗血清中不同凝膠染色方法的比較①

韋傳寶 曹佳敏

(皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，六安237012)

目的：尋找在制備出血毒素抗血清中電泳后染色凝膠的好方法。方法：按照前人的方法從皖南產(chǎn)尖吻蝮蛇毒中初步分離3種出血毒素:AaH Ⅰ、AaH Ⅱ和AaH Ⅳ并獲得3種粗提取的出血毒素，用制備電泳的方法進(jìn)一步純化AaHⅠ、AaH Ⅱ和AaH Ⅳ，對(duì)每種出血毒素，配制6塊制備電泳板并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，用6種不同的染色方法分別染色，將含出血毒素的凝膠切下，磨細(xì)后直接免疫注射小鼠并獲得抗血清，用ELISA檢測(cè)和中和出血毒素出血活性?xún)煞N方法檢測(cè)抗血清的質(zhì)量。結(jié)果：不同染色方法制備的抗血清中有效IgG濃度不同，用無(wú)毒型蛋白質(zhì)快速染色試劑盒染色制備的抗血清有效IgG濃度最高。結(jié)論：用無(wú)毒型蛋白質(zhì)快速染色試劑盒染色是制備抗血清最好的染色方法。

尖吻蝮蛇；出血毒素；抗血清制備；染色法；質(zhì)量檢測(cè)

尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus) 俗稱(chēng)五步蛇，屬于蝮亞科、蝮屬，分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)(包括臺(tái)灣)，是我國(guó)特有的劇毒蛇。該蛇毒為血循環(huán)型蛇毒,其主要毒素為出血毒素。Xu等[1]最先從皖南產(chǎn)尖吻蝮蛇毒中分離出3種低分子量出血毒素，分別命名為出血毒素Ⅰ(AaH Ⅰ)、出血毒素 Ⅱ(AaH Ⅱ)和出血毒素 Ⅲ(AaH Ⅲ)；隨后Zhu等[2]從皖南尖吻蝮蛇毒中純化出1種中等分子量的出血毒素，命名為出血毒素Ⅳ(AaH Ⅳ)。在分離的4種出血毒素中，AaH Ⅰ、AaH Ⅱ和AaH Ⅳ屬于酸性蛋白，AaH Ⅲ屬于堿性蛋白，AaH Ⅰ、AaH Ⅱ、AaH Ⅳ的出血活性強(qiáng)，最小出血?jiǎng)┝?MHD)分別為0.4 μg、1.5 μg和0.4 μg，AaH Ⅲ出血活性弱，最小出血?jiǎng)┝繛?0.0 μg，該毒素還具有凝聚白細(xì)胞的功能[3]。

研究這些蛋白的性質(zhì)需要對(duì)應(yīng)的抗血清，對(duì)于蛇毒出血毒素而言，制備優(yōu)質(zhì)出血毒素抗血清是研究出血毒素性質(zhì)的基礎(chǔ)。要想獲得優(yōu)質(zhì)抗出血毒素血清，必須先獲得純的出血毒素。離子交換層析和分子篩層析純化的出血毒素通常情況下還含有少量的其他雜質(zhì)蛋白，制備的抗血清含有抗雜蛋白的抗體，因此，抗血清的質(zhì)量不高。制備電泳的方法是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法分離蛋白質(zhì)，分離的蛋白質(zhì)純度高，但缺點(diǎn)是分離的蛋白質(zhì)量少，而且包含在聚丙烯酰胺凝膠中，去除凝膠比較困難。本研究先通過(guò)離子交換層析和分子篩層析將尖吻蝮蛇三種酸性出血毒素進(jìn)行初步分離純化，然后通過(guò)制備電泳進(jìn)一步純化，用不同的染色方法對(duì)凝膠進(jìn)行染色，切出含出血毒素的蛋白質(zhì)凝膠條帶，直接將凝膠加生理鹽水磨細(xì)后免疫注射小鼠，通過(guò)比較幾種染色方法切出的凝膠制備的抗血清質(zhì)量，為制備優(yōu)質(zhì)抗出血毒素血清尋找一種方便、可靠的凝膠染色方法。

1 材料與方法

1.1 材料 尖吻蝮蛇毒購(gòu)自安徽省祁門(mén)縣祁門(mén)蛇傷研究所；DEAE-Sephadex A-50、CM-Sephadex C-25、Sephadex G-75、DE52、羊抗鼠IgG-堿性磷酸酶購(gòu)自Sigma公司；可逆型鋅染試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)：C510019)、可逆型銅染試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)：C510017)、高靈敏快速考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)：C510041)和無(wú)毒型蛋白質(zhì)快速染色試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)：C503011)、考馬斯亮藍(lán)R250、SDS購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；小鼠購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)，規(guī)格18～22 g；蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(GE公司)；層析柜(普析通用公司)；酶標(biāo)儀(伯樂(lè)公司)；電泳儀、電泳槽(百晶科技公司)等。

1.2 方法

1.2.1 三種酸性出血毒素的初步分離純化 按照Xu等[1]的方法初步純化出血毒素Ⅰ(AaHⅠ)和出血毒素 Ⅱ(AaH Ⅱ)；按照Z(yǔ)hu等[2]的方法從皖南尖吻蝮蛇毒中初步純化出血毒素Ⅳ(AaH Ⅳ)。

1.2.2 出血活性的檢測(cè) 傳統(tǒng)的出血活性檢測(cè)是用家兔皮內(nèi)注射的方法，最小出血?jiǎng)┝繛楫a(chǎn)生直徑10 mm出血斑點(diǎn)的出血毒素量[4]。本研究用18～22 g小鼠檢測(cè)出血活性。小鼠有出血敏感、試驗(yàn)方便、成本低的優(yōu)點(diǎn)。采用1 ml的注射器，將待測(cè)樣品總量控制在0.12 ml，如果少于0.12 ml用生理鹽水補(bǔ)齊。將樣品注射到小鼠腹部皮下，每只小鼠腹部注射4個(gè)點(diǎn)。30 min后處死小鼠并解剖，出血明顯且出血點(diǎn)直徑10 mm以上確定為有出血活性。對(duì)于每一種出血毒素，通過(guò)注射不同量出血毒素確定最小出血?jiǎng)┝?MHD)。

1.2.3 制備電泳膠的配制與制備電泳純化出血毒素 制備電泳與檢測(cè)電泳區(qū)別在于前者濃縮膠里不插梳子，12%PAGE制備電泳膠的配制見(jiàn)表1。將初步純化的AaHⅠ、AaH Ⅱ和AaH Ⅳ配制成20 mg/ml，每種毒素制備6塊制備電泳凝膠板，每個(gè)電泳槽加1.0 ml出血毒素溶液，電泳結(jié)束取下凝膠，放塑料盒中待染色。

1.2.4 染色與脫色 將每種毒素電泳后的6塊凝膠分別放置不同的塑料盒中，分別用6種方法染色，第1塊膠用可逆型鋅染試劑盒；第2塊膠用可逆型銅染色試劑盒；第3塊膠用高靈敏快速考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒；第4塊膠用無(wú)毒型蛋白質(zhì)快速染色試劑盒；均按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色與脫色；第5塊膠用實(shí)驗(yàn)室配制的常用的考馬斯亮藍(lán)染色液(甲醇∶水∶冰乙酸=45∶45∶10，100 ml含0.26 g 考馬斯亮藍(lán)R250)染色，用配制的常用脫色液(甲醇∶冰乙酸∶水=300∶100∶600)脫色。第6塊膠先用含SDS的電泳緩沖液(1 000 ml含5.0 g Tris,14.4 g Gly,1 g SDS)浸泡30 min，然后用預(yù)先冷卻4℃的0.25 mol/L KCl染色，蛋白質(zhì)條帶為乳白色。

表1 12% PAGE制備電泳配制表

Tab.1 12% PAGE preparation electrophoresis compon-ent table

ReagentsSeparationgel(12%)36mlConcentrationgel(5%)10mlddH2O118868030%acrylamide144017015mol/LTris?HCl(pH88)90000010mol/LTris?HCl(pH68)00012510%Ammoniumammoniumsulfate036010TEMED0015001

1.2.5 抗血清的制備 每種毒素每個(gè)染色組免疫1組小鼠(4只)，共4次免疫注射，二次注射間隔7 d。具體方法為：取1份含出血毒素的膠體，加2 ml生理鹽水，于研缽內(nèi)充分磨細(xì)，將凝膠懸浮液吸入到5 ml規(guī)格的一次性注射器中，免疫注射18～22 g的小鼠，共免疫注射4次，每次每只小鼠注射0.5 ml樣品，第一次注射每只小鼠皮下注射0.25 ml,腹腔注射0.25 ml，第二、第三、第四次免疫均為腹腔注射，每只小鼠腹腔注射0.5 ml，第四次注射后第3天斷頭取血，6 h后離心獲得抗血清，冷凍保存。

1.2.6 抗血清質(zhì)量的ELISA檢測(cè)[5]將步驟1.2.1中制備的粗提的各種出血毒素用包被液配成5 mg/ml濃度，作為抗原包被液，制備的相應(yīng)抗血清作為一抗，空白對(duì)照為無(wú)抗原的包被液，陰性對(duì)照為未免疫的小鼠血清，二抗用1/10 000的羊抗鼠IgG-堿性磷酸酶，顯色30 min后在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD405nm。加制備的抗血清組的吸收光值如果大于陰性對(duì)照組吸收光值2.1倍，說(shuō)明血清中含抗該種毒素的IgG，并與毒素結(jié)合，抗血清合格，否則不合格。

1.2.7 抗血清中和出血活性檢測(cè) ELISA檢測(cè)呈陽(yáng)性從理論上說(shuō)明抗血清中有對(duì)應(yīng)的IgG，抗血清如果能夠中和對(duì)應(yīng)的出血毒素的出血活性將是對(duì)抗血清質(zhì)量的直接證明。對(duì)每種毒素，取最小出血?jiǎng)┝糠謩e與6種染色方法制備的抗血清混合，30 min后13 000 r/min離心6 min，將上清液注射小鼠腹部皮下，抗血清的用量均為100 μl。30 min后解剖，確定抗血清是否能夠中和出血活性，中和出血活性強(qiáng)弱直接說(shuō)明抗血清的質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 3種酸性出血毒素的初步純化 依據(jù)前人的方法成功分離出四種出血毒素，每種出血毒素純度都較高(圖略)，而且具有出血活性(圖1)。AaH Ⅰ、AaH Ⅱ和AaH Ⅳ的最小出血?jiǎng)┝?MHD)分別為0.5、1.3和0.45 μg，與前人的研究結(jié)果基本一致[1,2]。

2.2 染色和脫色后毒素的獲得 因?yàn)殡娪镜臉悠肥谴痔岬某鲅舅?，雜質(zhì)很少，所有的主條帶(粗條帶)都是出血毒素，因此用手術(shù)刀切下出血毒素蛋白條帶(粗條帶)，將含出血毒素的膠條平分成4份，冷凍保存。每種出血毒素獲得6種制備電泳純化后不同染色的凝膠。

圖1 分離的3種出血毒素出血活性檢測(cè)Fig.1 Hemorrhagic activities test to purified three kinds of hemorrhagins

2.3 抗血清的制備 經(jīng)過(guò)4次免疫，每種出血毒素每組獲得約2.8 ml的小鼠抗血清。

2.4 抗血清質(zhì)量的ELISA檢測(cè)結(jié)果 3種出血毒素與對(duì)應(yīng)的6組抗血清反應(yīng)的ELISA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，第4組用無(wú)毒型蛋白質(zhì)快速染色試劑盒染色制備的抗血清質(zhì)量比較高，其他抗對(duì)應(yīng)出血毒素血清IgG含量比較低。

2.5 抗血清中和出血活性檢測(cè)結(jié)果 3種出血毒素與對(duì)應(yīng)的6組抗血清中和出血毒素出血活性試驗(yàn)結(jié)果表3。從表3可以看出，第4組用無(wú)毒型蛋白質(zhì)快速染色試劑盒染色制備的抗血清能夠完全中和對(duì)應(yīng)出血毒素出血活性，其他組制備的抗血清只能部分中和對(duì)應(yīng)出血毒素的出血活性，與ELISA檢測(cè)結(jié)果相吻合。

3 討論

6組試驗(yàn)都是同樣的制備電泳，區(qū)別的是染色不同，由于染色劑和脫色劑的成分不同，對(duì)出血毒素蛋白的影響也不同。第4組無(wú)毒型蛋白質(zhì)快速染色試劑盒含有單一考馬斯亮藍(lán)G-250染色液，膠體狀染色液不含有刺激性的甲醇和冰醋酸，安全無(wú)毒，該染色液只與蛋白結(jié)合，與膠的結(jié)合程度低，不需要固定和脫色，蛋白量大于200 ng 時(shí)可以清楚地出現(xiàn)染色條帶，本試劑盒只需要簡(jiǎn)單的水洗步驟，不用可能引起蛋白質(zhì)變性的脫色液。該染色劑染色后出血毒素的蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)基本未變，抗原性完全保留，因此抗血清效價(jià)也相對(duì)較高。可逆型銅染試劑盒用銅離子與蛋白質(zhì)結(jié)合的方法使蛋白質(zhì)呈現(xiàn)淡藍(lán)色，可逆型鋅染試劑盒用鋅離子結(jié)合蛋白質(zhì)染色，由于過(guò)量的銅離子或者鋅離子對(duì)小鼠有毒，在免疫注射時(shí)凝膠用量少小鼠才不會(huì)死亡，抗原少產(chǎn)生的抗體也少，因此中和出血活性的能力弱。高靈敏快速考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒的脫色液含甲醇和乙酸，脫色后出血毒素變性，抗原決定簇發(fā)生變化，免疫產(chǎn)生的抗體含量也少，與檢測(cè)結(jié)果相符合。常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色組使用的染色液和脫色液都含甲醇和乙酸，染色后考馬斯亮藍(lán)與出血毒素緊密結(jié)合，抗原發(fā)生了變化，因此產(chǎn)生的抗體也少，KCl染色組在進(jìn)行染色前用含SDS的電泳緩沖液浸泡了30 min，出血毒素蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合，出血毒素的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化并失去活性，抗原性也發(fā)生了變化，可以預(yù)期產(chǎn)生的抗體也少。

表2 3種出血毒素分別與6組對(duì)應(yīng)抗血清反應(yīng)的ELISA檢測(cè)結(jié)果

Tab.2 ELISA test results between three kinds of hemorrhagins with its antiserums

HemorrhaginGroupone(ProteinStainsZn)OD405nmGrouptwo(ProteinStainsCu)OD405nmGroupthree(ProteinStainsH)OD405nmGroupfour(ProteinStainsL)OD405nmGroupfive(commonCoomassiebrilliantblue)OD405nmGroupsix(KCldyeing)OD405nmAaHⅠ134013501457240013001489AaHⅡ143313351309214912801567AaHⅣ140213501240249011301245

表3 6組抗血清中和3種出血毒素出血活性結(jié)果

Tab.3 Results of neutralization of hemorrhagic activities by its antiserums

HemorrhaginNeutralizationofhemorrhagicactivityabilityofGroupone(ProteinStainsZn)NeutralizationofhemorrhagicactivityabilityofGrouptwo(ProteinStainsCu)NeutralizationofhemorrhagicactivityabilityofGroupthree(ProteinStainsH)NeutralizationofhemorrhagicactivityabilityofGroupfour(ProteinStainsL)NeutralizationofhemorrhagicactivityabilityofGroupfive(commonCoomassiebrilliantblue)NeutralizationofhemorrhagicactivityabilityofGroupsix(KCldyeing)AaHⅠ+++++++++++AaHⅡ+++++++++++AaHⅣ+++++++++++

制備電泳分離的出血毒素包埋在網(wǎng)狀的聚丙烯酰胺凝膠中，免疫注射后，出血毒素從網(wǎng)狀的聚丙烯酰胺凝膠中緩慢釋放到動(dòng)物體內(nèi)，抗原不但在動(dòng)物體內(nèi)停留時(shí)間長(zhǎng)，充分刺激免疫系統(tǒng)，聚丙烯酰胺凝膠也替代了昂貴的弗氏佐劑。

綜上所述，在6種染色方法中，無(wú)毒型蛋白質(zhì)快速染色試劑盒染色制備的蛋白質(zhì)抗原性保留最完整，免疫小鼠制備的抗血清質(zhì)量最好，該染色試劑盒可以推廣到其他蛋白質(zhì)抗血清的制備中。

[1] Xu X，Wang C，Liu J，etal.purification and characterization of hemorrhagic components from Agkistrodon acutus (hundred pace snake) venom[J].Toxicon,1981,19(5):633-644.

[2] Zhu ZL,Gong WM,Zhu XY,etal.Purification,characterization and conformational analysis of a haemorrhagin from the venom of Agkistrodon acutus[J].Toxicon,1997,35(2):283-292.

[3] Wei CB,Chen J，Li JH.Acutolysin C,a weak hemorrhagic toxin from the venom of Agkistrodon acutus with leucoagglutination activity[J].J Venom Anim Toxins Incl Trop Dis，2011，17(1):34-41.

[4] Kondo H,Kondo SI,kezawa H,etal.Studies on the quantitative method for determination of hemorrhagic activity of Habu snake venom[J].Japan J Med Sci Biol，1960，13:43-51.

[5] 徐宜為編著.免疫檢測(cè)技術(shù)[M].第3版.北京：科學(xué)出版社，1991：158-183.

[收稿2016-08-12 修回2016-09-28]

(編輯 倪 鵬)

Comparative studies by different dyeing methods on antiserum preparation against hemorrhagins from Agkistrodon acutus venom

WEI Chuan-Bao,CAO Jia-Min.

Biological and Pharmaceutical Engineering College,West Anhui University,Liuan 237012,China

Objective:In order to look for a good method for preparation of hemorrhagin antiserum.Methods: Three kinds of hemorrhagins including AaH Ⅰ, AaH Ⅱ, and AaH Ⅳ were purified from Agkistrodon acutus venom according to predecessors′s methods and crude AaH Ⅰ, AaH Ⅱ and AaH Ⅳ were obtained. Preparation electrophoresis was used to purify AaH Ⅰ，AaH Ⅱand AaH Ⅳ further. As for an hemorrhagin, six different dyeing methods were used to dye PAGE gel and the gel contained hemorrhagin was obtained respectively. The ground gel contained hemorrhagin was used to immune mice and its antiserum was obtained. Antiserums quality was tested through ELISA test and neutralization of the hemorrhagic activities of corresponding hemorrhagin. Results: Effective IgG concentration in different antiserum was different and effective IgG made through non toxic type protein fast stain reagent kit was higher than others. Conclusion: Non toxic type protein fast stain reagent kit is the best dyeing method among the six dyeing methods.

Agkistrodon acutus;Hemorrhagin;Antiserum preparation;Dyeing;Quality test

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.015

①本文為安徽自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1408085MC43)和安徽省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2015A454，KJ2013A264)。

韋傳寶(1961年-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事蛇毒蛋白方面的研究，同時(shí)就職于皖西學(xué)院抗體制備及其質(zhì)量檢測(cè)中心，E-mail:weichuanbao@sina.com。

R991

A

1000-484X(2016)12-1793-04