點(diǎn)免疫金滲濾法篩選膠體金標(biāo)記抗人IgG的研究①

房彬彬 齊新偉 王 黎 馮曉輝

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院,烏魯木齊830054)

點(diǎn)免疫金滲濾法篩選膠體金標(biāo)記抗人IgG的研究①

房彬彬 齊新偉②王 黎 馮曉輝

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院,烏魯木齊830054)

目的：應(yīng)用點(diǎn)免疫金滲濾法篩選適宜膠體金標(biāo)記的抗人IgG(以下簡(jiǎn)稱二抗)，并運(yùn)用多個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行比較和分析。方法：選擇三個(gè)不同公司的二抗用膠體金標(biāo)記，根據(jù)棋盤滴定法確定最佳標(biāo)記條件；運(yùn)用點(diǎn)免疫金滲濾法對(duì)三種二抗的膠體金標(biāo)記后檢測(cè)效能進(jìn)行比較，采用包蟲病人和健康對(duì)照血清，用包蟲病特異性抗原檢測(cè)包蟲病患者血清中的特異性抗體，評(píng)價(jià)最優(yōu)的二抗，并與酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法進(jìn)行比較。結(jié)果：A、B、C三種二抗標(biāo)記的最佳標(biāo)記條件為：pH均為8.5，加入量分別為38.4、24、19.2 μg/ml，綜合評(píng)價(jià)二抗B檢測(cè)效能最優(yōu)。將其與酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)效能進(jìn)行比較，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的Kappa=0.895(P<0.05)，吻合度較強(qiáng)。結(jié)論：應(yīng)用點(diǎn)免疫金滲濾法，以及本文提出的評(píng)價(jià)指標(biāo)，能夠篩選出最佳二抗，對(duì)檢測(cè)試劑盒中二抗的選擇具有重要的參考價(jià)值。

包蟲??；篩選；膠體金標(biāo)記；抗人IgG

膠體金作為快速簡(jiǎn)便的示蹤劑，近年來在疾病的快速檢測(cè)和床邊檢測(cè)顯示出其優(yōu)勢(shì)，尤其是在臨床免疫學(xué)檢測(cè)中，如早早孕試紙條、艾滋病快速檢測(cè)卡等。我單位研制并成功注冊(cè)的包蟲病特異性抗體檢測(cè)試劑盒(膠體金法)，就是以膠體金標(biāo)記的抗人IgG作為二抗，采用點(diǎn)免疫金滲濾法(Dot immunogo-ld filtration assay,DIGFA)檢測(cè)針對(duì)4種不同抗原的包蟲病患者血清中特異性抗體[1，2]。

目前膠體金標(biāo)記抗體的方法已有研究報(bào)道[3，4]，但大部分都是以特定抗體進(jìn)行膠體金標(biāo)記條件的篩選。然而，近年來國(guó)內(nèi)外抗體種類及品牌不斷增加，對(duì)于如何篩選合適的抗體進(jìn)行標(biāo)記，用于檢測(cè)試劑盒研制的研究較少。本試驗(yàn)選擇了三個(gè)國(guó)內(nèi)外不同公司的二抗，運(yùn)用多個(gè)指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，最終篩選出適用于包蟲病特異性抗體檢測(cè)試劑盒的最佳二抗。該篩選模式提出了篩選抗體時(shí)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，為其他檢測(cè)試劑盒中膠體金標(biāo)記二抗的選擇提供了重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 三種二抗標(biāo)記后檢測(cè)效能比較時(shí)，選取新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)手術(shù)確診的20例包蟲病患者血清(15例囊型包蟲病，5例泡型包蟲病)作為標(biāo)準(zhǔn)陽性樣本；健康人血清20例作為標(biāo)準(zhǔn)陰性樣本。DIGFA和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)效能比較時(shí)，選取新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)手術(shù)確診的90例包蟲病患者血清(71例囊型包蟲病，19例泡型包蟲病)作為標(biāo)準(zhǔn)陽性樣本；健康人血清122例作為標(biāo)準(zhǔn)陰性樣本。以上樣本均由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院標(biāo)本庫提供。

1.1.2 試劑和儀器 DIGFA反應(yīng)板由新疆貝斯明生物技術(shù)發(fā)展有限公司提供；膠體金及主要檢測(cè)用包蟲病抗原(頭節(jié)抗原、粗囊液抗原)均為實(shí)驗(yàn)室自制[5]；HRP標(biāo)記的羊抗人IgG、明膠購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；待標(biāo)記二抗購(gòu)自國(guó)內(nèi)外三個(gè)廠家，以A、B、C表示；其他試劑均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。酶標(biāo)儀為Bio-Rad公司xMark全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 二抗的膠體金標(biāo)記方法 取膠體金5 ml，用四硼酸鈉調(diào)pH至最佳，分別加入三種二抗的最佳加入量，混勻，放置4℃充分反應(yīng)50 min，加入適量含有聚乙二醇、明膠和飽和蔗糖溶液的Tris-HCl進(jìn)行封閉，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 二抗標(biāo)記條件篩選 由1.2.1可知，影響膠體金標(biāo)記二抗的主要因素有pH值，標(biāo)記時(shí)二抗加入量。根據(jù)棋盤滴定法以及膠體金遇鹽沉淀的特性，設(shè)計(jì)不同二抗的用量和pH的梯度實(shí)驗(yàn)，觀察顯色情況，即可得出理論二抗加入量，最佳二抗加入量為理論二抗加入量的120%，同時(shí)相應(yīng)的pH值/四硼酸鈉加入量則為最佳pH值/四硼酸鈉加入量。

1.2.3 三種二抗標(biāo)記后檢測(cè)效能比較 效能檢測(cè)采用DIGFA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)陽性樣本和標(biāo)準(zhǔn)陰性樣本各20份來評(píng)價(jià)。先將頭節(jié)抗原、粗囊液抗原溶液分別點(diǎn)樣包被于反應(yīng)板硝酸纖維素膜孔內(nèi)不同位置，37℃干燥備用；相應(yīng)的樣品稀釋液及洗滌液的 pH值調(diào)節(jié)至二抗標(biāo)記時(shí)的最佳pH。待測(cè)血清1∶10稀釋，加100 μl至包被好的反應(yīng)板上，待其滲濾完全，洗滌液洗滌后，分別加入3種膠體金標(biāo)記的二抗溶液，再次洗滌，觀察顯色結(jié)果，兩種抗原任意一種抗原陽性即視為包蟲病抗體陽性。分別計(jì)算三種標(biāo)記二抗在DIGFA實(shí)驗(yàn)中的敏感性、特異性、符合率、精密度和最低檢出限[6，7]，評(píng)價(jià)各自的檢測(cè)效能。其中精密度及最低檢出限參照新疆貝斯明生物技術(shù)發(fā)展有限公司包蟲病特異性抗體檢測(cè)試劑盒(膠體金法)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)及計(jì)算。

1.2.4 DIGFA和ELISA檢測(cè)效能的比較 選取1.2.3標(biāo)記效能最優(yōu)的抗體，與ELISA檢測(cè)包蟲病特異性抗體進(jìn)行比較。分別包被兩種抗原于酶標(biāo)板上，4℃過夜，封閉后，待測(cè)樣本按照1∶100稀釋，進(jìn)行常規(guī)間接ELISA檢測(cè)包蟲病特異性抗體，450 nm吸光度值測(cè)定。結(jié)果判讀根據(jù)各抗原的CUT OFF值判定為陽性或陰性，以兩種抗原任意一種抗原陽性即視為包蟲病抗體陽性，比較DIGFA與ELISA方法的陽性符合率、陰性符合率和總符合率[8,9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究所有數(shù)據(jù)均使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理分析，應(yīng)用多個(gè)獨(dú)立樣本率的χ2檢驗(yàn)，比較三種二抗標(biāo)記后的檢測(cè)效能，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)比較兩種檢測(cè)方法結(jié)果的吻合度，Kappa≥0.7，表示吻合度較強(qiáng)；0.7>Kappa≥0.4，表示吻合度一般；Kappa<0.4，表示吻合度較弱，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二抗標(biāo)記條件篩選 pH梯度是以不同量的四硼酸鈉與1 ml膠體金溶液混合來創(chuàng)建的，四硼酸鈉加入量梯度為20、40、60、80、100、120、140、160 μl，由此產(chǎn)生的pH值范圍約從6.0到9.0。三種二抗稀釋液的初始濃度均為1 mg/ml，二抗加入量梯度為1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6 μl。運(yùn)用酶標(biāo)板，A-H行加入不同pH梯度的膠體金溶液100 μl,則 A行具有最低pH值，H行有最高pH值。1～7列加入不同梯度二抗加入量，1列具有最低二抗加入量，7列具有最高二抗加入量。靜置10 min，每孔加入100 μl氯化鈉。觀察顯色反應(yīng)，膠體金與二抗結(jié)合成功，則溶液保持紅色,二抗量不足以穩(wěn)定膠體金的則呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象。選取溶液保持紅色，二抗及四硼酸鈉用量最少者為最佳。通過棋盤滴定法，得到A、B、C三種抗體標(biāo)記時(shí)的最佳四硼酸鈉加入量均為100 μl，即pH=8.5，理論二抗加入量為32、20和16 μg/ml，最佳二抗加入量分別為38.4、24和19.2 μg/ml。

表1 三種二抗標(biāo)記后檢測(cè)效能比較

Tab.1 Comparison of diagnostic effects with three kinds of IgG

DetectionitemsSecondaryantibodyABCχ2PSensitivity95%(19/20)100%(20/20)95%(19/20)10170601Specificity90%(18/20)90%(18/20)70%(14/20)37760151Consistencerate925(37/40)95(38/40)825(33/40)38560145Minimumdetectability1∶321∶641∶16--

表2 DIGFA和ELISA檢測(cè)效能的比較

Tab.2 Comparison of diagnostic effect by DIGFA and ELISA

DIGFAELISA+-Total+871097-1114115Total88124212Kappa0895P0000

2.2 三種二抗標(biāo)記后檢測(cè)效能比較 運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)陽性樣本20份和標(biāo)準(zhǔn)陰性樣本20份，對(duì)三種膠體金標(biāo)記的二抗平行檢測(cè)，并計(jì)算敏感性、特異性、符合率、精密度和最低檢出限，敏感性方面，B的敏感性最好，達(dá)到100%；特異性方面，A與B的特異性為90%；符合率方面，B符合率最高，為95%；精密度方面，三種二抗均為100%；最低檢出限方面，B優(yōu)于A和C；三種二抗敏感性、特異性和符合率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。綜上所述，二抗B綜合評(píng)價(jià)最優(yōu)，故選擇該抗體為適用于包蟲病特異性抗體檢測(cè)試劑盒的最佳抗體。結(jié)果見表1。

2.3 DIGFA和ELISA檢測(cè)效能的比較 通過對(duì)DIGFA和ELISA兩種方法檢測(cè)包蟲病特異性抗體，檢測(cè)結(jié)果顯示：陽性符合率為98.86%；陰性符合率為91.94%；總符合率為94.81%；兩種方法吻合度評(píng)價(jià)采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa=0.895>0.7，吻合度較強(qiáng)，Kappa 系數(shù)檢驗(yàn)，P=0.000，兩種方法的吻合度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表2。

3 討論

免疫膠體金技術(shù)是繼免疫酶標(biāo)技術(shù)、免疫熒光技術(shù)和放射免疫技術(shù)之后的第四大免疫標(biāo)記技術(shù)[10]，目前已基本成熟并得到廣泛應(yīng)用，作為一種免疫檢測(cè)技術(shù)與其他方法相比，在許多方面都具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)。多項(xiàng)研究表明,膠體金法在檢測(cè)多種疾病時(shí)具有較好的診斷價(jià)值，且與ELISA比較時(shí)，具有較好的一致性[11,12]，而且操作簡(jiǎn)便、快速，無需特殊儀器設(shè)備，可單份檢測(cè)，適合基層各種疾病的臨床檢驗(yàn)和疾病流行區(qū)的現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查。所以，篩選出合適的二抗進(jìn)行膠體金標(biāo)記，能夠在各種疾病的早期診斷和初步篩查中發(fā)揮重要的作用。

本文中所選取的樣本為手術(shù)確診的囊型包蟲病患者血清以及泡型包蟲病患者血清，故陽性率較高，若在其他實(shí)驗(yàn)中，樣本為非手術(shù)確診樣本，則應(yīng)相應(yīng)降低篩選要求，且本文旨在提供篩選標(biāo)記二抗的方法，未對(duì)大量樣本進(jìn)行檢測(cè)及相應(yīng)的效能比較，若為研制試劑盒進(jìn)行膠體金標(biāo)記二抗的篩選時(shí)，則需增大樣本量，以獲得更為可靠的數(shù)據(jù)。

膠體金標(biāo)記后檢測(cè)效能比較時(shí)，敏感性、特異性、符合率差異雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在實(shí)際試劑盒成品質(zhì)檢過程中，此類試劑盒合格與否的判定標(biāo)準(zhǔn)為：10份標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中不得超過1份假陰性，20份標(biāo)準(zhǔn)陰性血清中不得超過2份假陽性，故二抗C的特異性不符合要求，已可排除。二抗B因其最低檢出限最優(yōu)，而選擇為適用于包蟲病特異性抗體檢測(cè)試劑盒的最佳二抗。

本文的比較方法以及評(píng)價(jià)指標(biāo)暫無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，填補(bǔ)了膠體金標(biāo)記的最佳二抗篩選模式的空缺，促進(jìn)了醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，為更多科學(xué)研究轉(zhuǎn)化的臨床檢測(cè)、診斷手段奠定了基礎(chǔ)。

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[收稿2016-09-08 修回2016-10-09]

(編輯 許四平)

Screening anti-human IgG for colloidal gold conjugate with dot immunogold filtration assay

FANG Bin-Bin,QI Xin-Wei,WANG Li,FENG Xiao-Hui.

Clinical Medical Research Institute of the First Affiliated Hospital,Xinjiang Medical University,Urumqi 830054，China

Objective:To screen the appropriate anti-human IgG (secondary antibody) for conjugating with colloidal gold by dot immunogold filtration assay,and put forward the method of using multiple evaluation indicators for secondary antibody comparing and analyzing.Methods:Three different secondary antibodies A,B and C from three different companies were screened.Firstly the titration was used to determine the optimal reaction conditions.Then three secondary antibodies were conjugated to the colloidal gold,tested with a dot immunogold filtration assay for hydatidosis specific antibody detection.The optimal conjugated secondary antibody were compared with the standard indirect enzyme-linked immunosorbent assay.Results:The optimal pH of three secondary antibodies were 8.5,the binding capacity were 38.4,24 and 19.2 μg /ml colloidal gold.According to the comprehensive evaluation,the diagnostic effects of secondary antibody B was better than others.Its diagnostic effects in dot immunogold filtration assay was compared with enzyme-linked immunosorbent assay.The Kappa was 0.895(P<0.05) and showed the two methods were in good agreement.Conclusion:The appropriate secondary antibody for conjugating with colloidal gold could be screened by dot immunogold filtration assay and the evaluation indicators which put forward by this study,the screening method would have an important reference value for all kinds of colloidal gold test kit to screen the suitable secondary antibody.

Hydatidosis;Screen;Colloidal gold conjugate;Anti-human IgG

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.014

房彬彬(1989年-)，女，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事寄生蟲病免疫學(xué)標(biāo)志物研究，E-mail:xj_binbin5515@sina.com。

及指導(dǎo)教師：馮曉輝(1971年-)，女，博士，研究員，主要從事寄生蟲病免疫學(xué)標(biāo)志物研究，E-mail：feng_xh_cn@aliyun.com。

R446.61

A

1000-484X(2016)12-1790-04

①本文為新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研獎(jiǎng)勵(lì)基金(2011YFY16)。

②并列第一作者。