乙?；揎楄坭蕉嗵羌捌淇寡趸?、抗腫瘤活性研究

彭天元，劉家水，顏紅專

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥　230032；2.安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽 安慶　246052)

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乙?；揎楄坭蕉嗵羌捌淇寡趸?、抗腫瘤活性研究

彭天元1，劉家水2，顏紅專2

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥230032；2.安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽 安慶246052)

[摘要]目的觀察分子結(jié)構(gòu)乙?；揎棇?duì)枸杞多糖(Lycium barbarum L.polysaccharide，LBP)體內(nèi)抗氧化、抗腫瘤活性的影響。方法通過(guò)分子結(jié)構(gòu)乙?；揎椀玫借坭蕉嗵且阴；苌風(fēng)BPa；將昆明種小鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組(維生素C)，LBP高、低劑量組及LBPa高、低劑量組，測(cè)定小鼠血清和肝臟丙二醛(malondialdehyde，MDA)、肝臟總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)。復(fù)制H22荷瘤小鼠模型，灌胃給藥LBP，考察LBPa和LBP對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白介素-2(interleukin，IL-2)含量的影響。結(jié)果LBPa可以顯著提高正常小鼠肝組織CAT活力及T-AOC，降低小鼠血清及肝臟MDA含量，其抗氧化效果優(yōu)于維生素C及LBP，LBPa及LBP抗氧化活性均與劑量具有正相關(guān)性。LBPa可顯著抑制H22腫瘤細(xì)胞增殖，提高免疫器官指數(shù)，提高血清IL-2及TNF-α含量；除IL-2含量外，對(duì)其他指標(biāo)的影響均有劑量依賴性；LBPa抗腫瘤活性明顯優(yōu)于LBP。結(jié)論乙?；揎椏娠@著提高LBP的抗氧化及抗腫瘤活性。

[關(guān)鍵詞]枸杞多糖；乙酰化修飾；抗氧化；抗腫瘤

枸杞多糖(LyciumbarbarumL.polysaccharide，LBP)，存在于茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.干燥成熟果實(shí)中[1-2]。大量研究表明LBP具有抗腫瘤[3]、降血糖[4]、抗氧化[5]及抗?jié)僛6]等活性。

天然來(lái)源的多糖具有低毒、無(wú)不良反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)，但也存在一些不足：①有些天然多糖并不具有生物學(xué)活性[7]；②有些多糖因?yàn)槠淅砘再|(zhì)或空間結(jié)構(gòu)等問(wèn)題，限制了其藥理活性；③一些多糖生物學(xué)活性較弱，還需要進(jìn)一步改善[8]。目前國(guó)內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于分子修飾多糖從而獲得理想的活性多糖。分子修飾方法主要分為化學(xué)修飾、物理修飾及生物修飾，其中化學(xué)修飾運(yùn)用最廣?；瘜W(xué)修飾方法主要通過(guò)嫁接其他基團(tuán)或者元素，以達(dá)到多糖改性的目的[9]。研究指出分子修飾后的多糖不僅可以提高原有的生物學(xué)活性，有些甚至可以產(chǎn)生新的藥理作用。例如天然茯苓多糖僅有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，但經(jīng)硫酸酯化后具有顯著的抗S180腫瘤活性[10]。纖維素因不溶于水，對(duì)其分子直接修飾難度較大，首先需乙?；揎椧栽黾悠淙芙庑?，之后再進(jìn)行硫酸酯化修飾，得到的乙?；?硫酸酯化纖維素具有顯著的抗HIV活性[11]。然而對(duì)于LBP乙酰化修飾尚無(wú)研究報(bào)道，從其他關(guān)于多糖乙?；难芯繄?bào)道可以推測(cè)，乙?；墒苟嗵歉淖兌ㄏ蛐约皺M向次序，從而改變多糖的空間排布，增加其水溶性，改善其活性。因此本研究采用乙?；揎桳BP得到其乙?；苌風(fēng)BPa，通過(guò)體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LBPa抗氧化及抗腫瘤活性，為L(zhǎng)BP相關(guān)藥品及功能保健品的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與儀器

1.1試藥與試劑LBP：實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)水提醇沉法[12]獲得粗多糖后采用Superdex-G 200分離得到純化LBP，Sevag法測(cè)得多糖純度為97.3%；過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒：南京建成生物工程研究所；三氯乙酸、吡啶、甲酰胺、乙酸酐、無(wú)水乙醇均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)KM小鼠及SD大鼠，中科院上海動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2003-0003，體質(zhì)量分別為(20±2)g及(220±20)g。

1.3儀器DL-5000B離心機(jī)：上海飛鴿科學(xué)儀器廠；RE52-4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：江蘇省常州金壇儀器有限公司；FA2004電子天平：上海菁華儀器有限公司；501型恒溫水浴鍋：上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；UV-360紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司。

2方法

2.1LBP乙?；苌镏苽浒次墨I(xiàn)[13]方法，稱取400 mg LBP溶于10 mL蒸餾水中，充分溶解，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至9.0，然后緩慢滴加5 mL甲酰胺，同時(shí)滴加NaOH溶液以維持反應(yīng)體系的pH值在8.0～8.4之間，反應(yīng)過(guò)程中持續(xù)攪拌，反應(yīng)結(jié)束后滴加鹽酸至溶液呈中性，乙醇沉淀反應(yīng)體系，沉淀物用95%乙醇洗滌，冷凍干燥后溶于100 mL去蒸餾水中，3 000 Da透析袋透析72 h，濃縮，醇沉，冷凍干燥即得LBP乙?；苌風(fēng)BPa。采用IR檢測(cè)乙?；晒εc否[13]。

2.2LBPa對(duì)正常小鼠抗氧化能力的影響將60只KM小鼠隨機(jī)分成6組，雌雄各半。分別為空白對(duì)照組(每天灌胃0.9%生理鹽水)、陽(yáng)性對(duì)照組(維生素C 500 mg/kg，用前新鮮配制)、LBP低劑量組(100 mg/kg)、LBP高劑量組(300 mg/kg)、LBPa低劑量組(100 mg/kg)和LBPa高劑量組(300 mg/kg)。連續(xù)灌胃給藥15 d，末次給藥后眼眶取血，收集后離心取血清。麻醉處死小鼠，剖取肝臟，按試劑盒指導(dǎo)方法檢測(cè)小鼠血清和肝臟MDA、肝臟T-AOC和肝臟CAT。

2.3LBPa體內(nèi)抑制H22腫瘤細(xì)胞增殖作用從H22荷瘤小鼠腹腔中抽取瘤液，生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×106/mL，臺(tái)酚藍(lán)染色，鏡檢，細(xì)胞存活率不小于95%。取無(wú)菌潔凈級(jí)BALB/c雄性小鼠(20±2)g，右腹股溝皮下植入0.1 mL瘤細(xì)胞懸液。接種后，小鼠自由飲食。24 h后，將小鼠隨機(jī)分為模型組(0.9% NaCl)，陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺，30 mg/kg)，LBP及LBPa高、低劑量組(分別為300、100 mg/kg)，每組各10只。每天灌胃給藥1次相應(yīng)藥物，10 d后稱質(zhì)量，處死小鼠，各組小鼠眼眶靜脈叢取血，離心，分離血清，按試劑盒說(shuō)明書指導(dǎo)操作，計(jì)算血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白介素-2(interleukin，IL-2)含量。同時(shí)稱量腫瘤、脾臟及胸腺質(zhì)量。計(jì)算腫瘤抑制率、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。

式中Wc為對(duì)照組平均腫瘤質(zhì)量，Wt為實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤質(zhì)量。

3結(jié)果

3.2LBPa對(duì)正常小鼠抗氧化能力的影響MDA是細(xì)胞導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝產(chǎn)物，因此MDA濃度越低，則脂質(zhì)過(guò)氧化程度越低，表明機(jī)體抗氧化能力就越強(qiáng)[14]。CAT可促使體內(nèi)積聚的H2O2分解為氧和水，從而使細(xì)胞免于H2O2的氧化損傷[15]。

空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，LBPa高、低劑量組血清MDA、肝臟MDA、肝臟T-AOC和肝臟CAT活力比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(血清MDA：F(3，36)=72.80，P=0.000；肝臟MDA：F(3，36)=151.07，P=0.000；肝臟T-AOC：F(3，36)=89.94，P=0.000；肝臟CAT：F(3，36)=103.76，P=0.000)，LBPa高、低劑量組血清和肝臟MDA水平顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，而肝臟T-AOC和肝臟CAT活力顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)果說(shuō)明LBPa在提高正常小鼠抗氧化能力方面明顯優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥維生素C。見(jiàn)表1。

表1　LBPa對(duì)正常小鼠抗氧化能力的影響±s)

注：同列具有不同右上標(biāo)符號(hào)的組別比較，P<0.05。

3.3乙?；揎椧蛩睾蛣┝恳蛩貙?duì)正常小鼠抗氧化能力的影響兩因素方差分析結(jié)果顯示，乙?；揎椧蛩睾蛣┝恳蛩貙?duì)血清MDA、肝臟MDA、肝臟T-AOC和肝臟CAT活力的主效應(yīng)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩者的交互作用均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。簡(jiǎn)單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，對(duì)于同一劑量，LBPa降低血清和肝臟MDA及升高肝臟T-AOC和CAT活力的效應(yīng)優(yōu)于LBP；對(duì)于LBP或LBPa，高劑量的效應(yīng)均優(yōu)于低劑量。結(jié)果提示，在提高正常小鼠抗氧化能力方面，乙?；揎椀腖BP的效應(yīng)優(yōu)于未修飾的效應(yīng)，高劑量的效應(yīng)優(yōu)于低劑量的效應(yīng)。見(jiàn)表3。

表2　乙酰化修飾因素和劑量因素對(duì)正常小鼠抗氧化能力影響的兩因素方差分析結(jié)果

3.4LBPa對(duì)H22腫瘤細(xì)胞增殖活性及其對(duì)血清TNF-α及IL-2含量的影響LBPa高、低劑量組腫瘤抑制率均低于陽(yáng)性對(duì)照組，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)，LBPa高、低劑量組之間脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果提示環(huán)磷酰胺雖然抗腫瘤活性較強(qiáng)，但對(duì)免疫器官具有顯著的抑制作用。LBPa高、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組血清TNF-α和IL-2水平較模型組顯著升高(P<0.05)，且LBPa高、低劑量組血清IL-2水平顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3　不同劑量LBP和LBPa對(duì)正常小鼠抗氧化能力的影響±s)

注：與LBP低劑量組比較，*P<0.05；與LBPa低劑量組比較，#P<0.05；與LBP高劑量組比較，△P<0.05。

表4　LBPa對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤抑制率、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及血清TNF-α、IL-2水平的影響±s)

注：同列具有相同右上標(biāo)符號(hào)的組別比較，P>0.05；同列具有不同右上標(biāo)符號(hào)的組別比較，P<0.05。

3.5乙?；揎椧蛩睾蛣┝恳蛩貙?duì)H22腫瘤細(xì)胞增殖活性及其對(duì)血清TNF-α及IL-2含量的影響兩因素方差分析結(jié)果顯示，乙?；揎椧蛩睾蛣┝恳蛩貙?duì)脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和血清TNF-α的主效應(yīng)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，乙酰化修飾因素對(duì)血清IL-2的主效應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩者的交互作用均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表5。簡(jiǎn)單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，相同劑量的LBPa對(duì)腫瘤的抑制作用高于相同劑量的LBP，血清TNF-α水平明顯高于相同劑量的LBP(P<0.05)，而對(duì)脾臟和胸腺的抑制作用均明顯低于相同劑量的LBP(P<0.05)，見(jiàn)表6。結(jié)果提示，乙?；揎椀腖BP抑制腫瘤的效應(yīng)及升高血清TNF-α和IL-2的效應(yīng)明顯優(yōu)于未修飾的LBP，其抑制免疫器官的效應(yīng)明顯低于未修飾的LBP，在保護(hù)脾臟和胸腺，升高血清TNF-α方面具有明顯的劑量依賴性，在升高血清IL-2方面無(wú)明顯的量效關(guān)系。

4討論

機(jī)體絕大部分病變與體內(nèi)抗氧化能力衰退有關(guān)，當(dāng)機(jī)體不能及時(shí)清理體內(nèi)過(guò)氧化物時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體受損、病變。本研究結(jié)果表明，LBP及LBPa均能提高機(jī)體抗氧化活力，且經(jīng)乙?；揎椀腖BPa抗氧化活性優(yōu)于未經(jīng)修飾的天然的LBP，表明乙?；揎椏梢蕴岣週BP的抗氧化活性。此外胸腺通過(guò)產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞以及胸腺素發(fā)揮免疫作用，脾臟與體液免疫關(guān)系密切，因此LBPa及LBP抗腫瘤活性機(jī)制之一可能為其能夠提升機(jī)體免疫器官作用從而發(fā)揮抗腫瘤活性；另外，LBP及LBPa可使H22荷瘤小鼠血清IL-2及TNF-α的含量增加，TNF-α可直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒性，而IL-2通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗癌活性[16]，且LBPa活性更優(yōu)。

表6　不同劑量LBP和LBPa對(duì)H22腫瘤細(xì)胞增殖活性及其對(duì)血清TNF-α及IL-2含量的影響±s)

注：與LBP低劑量組比較，*P<0.05；與LBPa低劑量組比較，#P<0.05；與LBP高劑量組比較，△P<0.05。

以上結(jié)果表明，LBP乙?；苌锏目寡趸翱鼓[瘤活性均顯著優(yōu)于未經(jīng)修飾的天然LBP。其原因可能是乙?；揎椄淖僉BP的定向性及橫向次序，因而改變其空間排布，增加其親水性，有利于藥物吸收，從而提高了LBP活性。

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Acetylation ofLyciumbarbarumL. Polysaccharide and Its Antioxidant and Antitumor Activities

PENGTian-yuan1,LIUJia-shui2,YANHong-zhuan2

(1.AnhuiMedicalUniversity,AnhuiHefei230032,China; 2.AnqingMedicalandPharmaceuticalCollege,AnhuiAnqing246052,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the influence of acetylation on the in vivo antioxidant and antitumor activities of Lycium barbarum L. polysaccharide (LBP). MethodsLBPa, the acetyl derivative of LBP, was obtained through acetylation. Kunming mice were randomly divided into blank control group, positive control group (vitamin C), low- and high-dose LBP groups, and low- and high-dose LBPa groups, and serum and liver malondialdehyde (MDA), total antioxidant capacity (T-AOC) of the liver, and catalase (CAT) were determined. A H22 tumor-bearing mouse model was established, and these mice were given LBP by gavage. The influence of LBPa and LBP on the inhibition rate of tumor cells, spleen index, thymus index, and serum levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-2 (IL-2) was observed. ResultsLBPa significantly improved liver CAT activity and T-AOC in normal mice and reduced the content of serum and liver MDA, achieving a better antioxidant effect than vitamin C and LBP; the antioxidant activity of LBP and LBPa was positively correlated with their doses. LBPa significantly inhibited the proliferation of H22 tumor cells, improved the immune organ index, and increased the serum levels of IL-2 and TNF-α; the influence on all indices except IL-2 was dose-dependent; LBPa had a better antitumor activity than LBP. ConclusionAcetylation can significantly improve the antioxidant and antitumor activities of LBP.

[Key words]Ganoderma lucidum L. polysaccharide; acetylation; antioxidant; antitumor

收稿日期：(2015-07-20；編輯：姚實(shí)林)

通信作者：顏紅專，yan1hz@163.com

作者簡(jiǎn)介：彭天元(1990-)，男，碩士研究生

基金項(xiàng)目：高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20113420120001)

[中圖分類號(hào)]R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.06.020