核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2和Keap1的分子結(jié)構(gòu)和功能及其信號通路調(diào)控分子機(jī)制研究進(jìn)展

王朝陽，荊 黎

（首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京100069）

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2和Keap1的分子結(jié)構(gòu)和功能及其信號通路調(diào)控分子機(jī)制研究進(jìn)展

王朝陽，荊 黎

（首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京100069）

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子（Nrf2）和抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合可啟動多種抗氧化、抗炎蛋白和解毒酶的表達(dá)。Nrf2/ARE信號通路在機(jī)體抗氧化和抗外源有毒化學(xué)物損傷過程中發(fā)揮著重要的作用，不僅參與調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)代謝等生理過程，也參與多種疾病的發(fā)病過程。本文綜述了Nrf2/ARE的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和功能及其信號通路調(diào)控的分子機(jī)制。

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子；氧化應(yīng)激；抗氧化反應(yīng)元件；調(diào)控機(jī)制

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor ery?throid 2 related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）信號通路是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的核心通路，直接影響細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，因而與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)［1-2］。該信號通路可調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，如Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶、DNA修復(fù)酶、分子伴侶蛋白和抗炎蛋白等多種與氧化應(yīng)激和化學(xué)應(yīng)激相關(guān)的蛋白編碼基因，占人類基因總數(shù)的1%～10%［3-4］。Nrf2/ARE信號通路本身也受到機(jī)體的嚴(yán)密調(diào)控，該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的異常會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。本文綜述其研究進(jìn)展，以闡明Nrf2/ARE信號通路調(diào)控的分子機(jī)制。

1 Nrf2的結(jié)構(gòu)和功能

Nrf2分子質(zhì)量為66 ku，具有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（basic leucine zipper，bZIP），是CNC（cap‘n’collar）轉(zhuǎn)錄因子家族中的重要成員，且轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)［2］。1994年，Moi等［5］首先發(fā)現(xiàn)并克隆出Nrf2蛋白，由于Nrf2蛋白可結(jié)合到轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-E2結(jié)合的共有序列上，故得名。除Nrf2外，CNC家族還包括P53，P45，Nrf1，Nrf3，Bach1和 Bach2［6-7］。Nrf2蛋白廣泛表達(dá)于肝、腎、心、肺、神經(jīng)組織、消化道上皮等多種組織細(xì)胞，由7個結(jié)構(gòu)域組成，分別為Neh 1～Neh 7［8］。Neh1包含1個CNC-bZIP結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可與Maf蛋白結(jié)合形成異二聚體并與DNA上的ARE結(jié)合［9］。Neh2包含DLG和ETGE模體（motif），可招募Kelch樣環(huán)氧氯丙烷（ECH）相關(guān)蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）［10］，從而負(fù)調(diào)控Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性。Neh2突變可使Nrf2失去與Keap1的結(jié)合能力，導(dǎo)致Nrf2的持續(xù)活化［11］。Nrf2羧基端的Neh3可招募色素-ATP酶/螺旋酶DNA結(jié)合蛋白6，是Nrf2的反式激活結(jié)構(gòu)域［12］。Neh4和Neh5也是Nrf2的反式激活結(jié)構(gòu)域。Nrf2與Maf蛋白結(jié)合形成的二聚體即使與ARE結(jié)合也不能獨(dú)立地激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，尚需通過Neh4和Neh5與其他轉(zhuǎn)錄輔助因子（如CREB結(jié)合蛋白、受體相關(guān)輔助激活因子）結(jié)合才能啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄［13］。Neh6包含DSGIS和DSAPGS模體，可借助DSGIS和DSAPGS與二聚體β轉(zhuǎn)導(dǎo)子重復(fù)包含蛋白結(jié)合從而負(fù)調(diào)控Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性［14-16］。Neh7介導(dǎo)Nrf2與視黃酸X受體的物理性結(jié)合，這種結(jié)合可抑制Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性［17］。

2 Keap1的結(jié)構(gòu)與功能

Keap1因與果蠅肌動蛋白結(jié)合蛋白Kelch相似而得名［18］。是位于細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2的負(fù)調(diào)控蛋白，可與Nrf2和細(xì)胞骨架蛋白（肌動蛋白）結(jié)合，將Nrf2定位于細(xì)胞質(zhì)而無法進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性。Keap1包含624個氨基酸殘基，具有5個結(jié)構(gòu)域：NTR，BTB，IVR，DGR和CTR［8］。DGR可與Nrf2的Neh1結(jié)合，也可與肌動蛋白結(jié)合［19］。BTB可介導(dǎo)Keap1形成同二聚體，BTB的第104位氨基酸高度保守，該氨基酸的突變可使Keap1無法形成二聚體。IVR結(jié)構(gòu)域富含半胱氨酸，是氧化劑和親電子劑的感受區(qū)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧化水平異常升高或細(xì)胞暴露于親電子劑時，IVR結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基（Cys226，Cys273和Cys288）可與氧化劑或親電子劑反應(yīng)，導(dǎo)致Keap1構(gòu)象的改變，與Nrf2分離，后者則進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動抗氧化基因或解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄。除了IVR結(jié)構(gòu)域具有氧化劑和親電子劑感受性外，BTB結(jié)構(gòu)域的Cys151，DGR結(jié)構(gòu)域的Cys434和CTR結(jié)構(gòu)域的Cys613也可感受細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平［20-24］。例如，當(dāng)暴露于氣態(tài)遞質(zhì)（gasotransmitter）硫化氫時，Cys226可與Cys613形成二硫鍵，從而使Keap1構(gòu)象發(fā)生改變［25］。

3 Nrf2活性調(diào)控的分子機(jī)制

3.1 蛋白質(zhì)水平的活性調(diào)控

目前，多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為細(xì)胞對Nrf2活性的調(diào)控主要發(fā)生在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性水平。細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下即有足量Nrf2表達(dá)，此時大部分Nrf2被Keap1介導(dǎo)的泛素化降解途徑所降解；氧化應(yīng)激時，Keap1構(gòu)象改變，失去對Nrf2的降解作用，Nrf2由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性。此外，氧化應(yīng)激和化學(xué)應(yīng)激也可激活某些蛋白激酶，使Nrf2發(fā)生磷酸化而活化。

3.1.1 Keap1抑制Nrf2活性

Keap1是Nrf2活性調(diào)節(jié)的分子開關(guān)。生理狀態(tài)下，Keap1可通過C端的Kelch重復(fù)結(jié)構(gòu)域與Nrf2 N端的Neh2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，將Nrf2錨定在微絲上，并可介導(dǎo)Nrf2的泛素化降解。Keap1的N端具有BTB結(jié)構(gòu)域，與其他具有BTB結(jié)構(gòu)域的蛋白一樣是滯蛋白（cullin）依賴性泛素連接酶E3的作用底物，可介導(dǎo)Nrf2的泛素化，并最終為26S蛋白酶體所降解。這個過程中Keap1起了連接Nrf2和Cul3-Rbx1-E3泛素連接酶復(fù)合體的作用［26］。綜上，生理狀態(tài)下Keap1通過將Nrf2錨定在細(xì)胞質(zhì)中及介導(dǎo)Nrf2的泛素化降解抑制Nrf2活性的。

當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧化物或自由基增多時，或細(xì)胞暴露于親電子物質(zhì)時，Keap1上的敏感氨基酸殘基（主要是半胱氨酸殘基）可與氧化劑、自由基或親電子劑反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致Keap1構(gòu)象改變，失去與Nrf2的結(jié)合能力，后者則可游離并在Nrf2的Neh1結(jié)構(gòu)域核轉(zhuǎn)位信號的指導(dǎo)下由胞質(zhì)進(jìn)入胞核，在細(xì)胞核內(nèi)不斷蓄積并啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄。

關(guān)于Keap1和Nrf2的相互作用，目前提出了一個“鉸鏈與門閂”或兩位點(diǎn)底物識別的模型（hinge and latch或two-site substrate recognition model）［27］。該模型認(rèn)為Keap1同二聚體的Kelch結(jié)構(gòu)域可與Nrf2的Neh2結(jié)構(gòu)域N端的DLG模體和ETGE模體結(jié)合。Keap1與DLG的結(jié)合是弱結(jié)合（門閂），與ETGE的結(jié)合是強(qiáng)結(jié)合（鉸鏈），鉸鏈的強(qiáng)度是門閂的100倍［28］。每2個Keap1可結(jié)合1個Nrf2上的DLG和ETGE模體，這種結(jié)合可使位于這兩種模體之間的可接受泛素的7個氨基酸殘基排列成合適的構(gòu)象，以利于泛素的連接［29］。當(dāng)處于氧化或化學(xué)應(yīng)激時，Keap1上的敏感氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致Keap1構(gòu)象改變，破壞了Kelch與DLG的弱結(jié)合（門閂破壞），但是Kelch與ETGE的強(qiáng)結(jié)合不受影響（鉸鏈保留）。此時，Nrf2依然與Keap1結(jié)合，但是Nrf2的泛素化明顯減弱，結(jié)果導(dǎo)致Keap1被Nrf2飽和，新生成的Nrf2不斷地自胞質(zhì)進(jìn)入胞核，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄。值得注意的是，當(dāng)Nrf2表達(dá)增加時，Nrf2本身可誘導(dǎo)Keap1的表達(dá)。顯然這是Nrf2的一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，可能會防止Nrf2/ARE通路的過度活化或者有利于該通路的及時終止。

3.1.2 蛋白激酶激活Nrf2的活性

除了Keap1，多種蛋白激酶對Nrf2的磷酸化也可實(shí)現(xiàn)對Nrf2活性的快速調(diào)節(jié)。有研究指出，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生時可激活某些蛋白激酶，后者可直接作用于Nrf2，促使其發(fā)生磷酸化修飾和構(gòu)象改變，進(jìn)而與Keap1分離，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性。一種典型的使Nrf2發(fā)生磷酸化激活的物質(zhì)是岡田酸，它是一種高效的蛋白磷酸酶抑制劑，可高效地促使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化。岡田酸處理HepG2細(xì)胞能促進(jìn)Nrf2的核蓄積和含ARE轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄［30］。蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶、PKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、PI3K和MAPK等均可使Nrf2發(fā)生磷酸化激活。目前研究比較清楚的是PKC可使位于Nrf2的Neh2結(jié)構(gòu)域上的Ser40發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致Nrf2與Keap1的解離［31］。已經(jīng)證明Ser40是PKC的作用靶點(diǎn)，因?yàn)橛肁la40置換Ser40后，PKC對Nrf2的激活作用明顯減弱［32］。但如以Glu40代替Ser40，即使沒有PKC，也會出現(xiàn)Nrf2磷酸化的系列表現(xiàn)，Nrf2在細(xì)胞核內(nèi)大量蓄積［33］。但并非所有的蛋白激酶對于Nrf2的磷酸化都是產(chǎn)生激活效應(yīng)的，這可能與磷酸化位點(diǎn)的不同有關(guān)。酪氨酸蛋白激酶Fyn可使Nrf2的Tyr568發(fā)生磷酸化，進(jìn)而促使Nrf2從細(xì)胞核移出［34］。因此，不同蛋白激酶對Nrf2不同位點(diǎn)氨基酸殘基的磷酸化修飾可能導(dǎo)致Nrf2的激活或抑制，充當(dāng)了Nrf2活性的分子開關(guān)。值得指出的是，各種蛋白激酶對Nrf2活性的調(diào)節(jié)只是一種“微調(diào)”，因?yàn)楫?dāng)敲除Keap1基因或使用siRNA技術(shù)沉默Keap1時，Nrf2和下游靶基因處于持續(xù)的活化狀態(tài)，此時蛋白激酶誘導(dǎo)劑刺激Nrf2活化的作用并不能顯現(xiàn)出來。這說明Keap1對Nrf2活性的調(diào)節(jié)可能是一種最為重要的總體調(diào)節(jié)，而蛋白激酶對Nrf2活性的調(diào)節(jié)可能只是一種精細(xì)的微調(diào)［35］。

3.1.3 其他蛋白質(zhì)因子對Nrf2活性的調(diào)控

細(xì)胞對Nrf2活性調(diào)節(jié)最主要的方式是Keap1的抑制和蛋白激酶的活化作用，此外還有許多蛋白因子可影響Nrf2的活性。Bach1與Nrf2一樣也屬于CNC-bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛表達(dá)于各種組織細(xì)胞。Bach1也可與Maf蛋白結(jié)合，Bach1-Maf蛋白復(fù)合物也可識別并結(jié)合ARE，但卻不能啟動ARE下游基因的轉(zhuǎn)錄，從而競爭性地抑制Nrf2與Maf蛋白的結(jié)合及Nrf2-Maf復(fù)合物與ARE結(jié)合，最終抑制ARE靶基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，Bach1基于某種未知的機(jī)制，與Maf蛋白解離并移出胞核降解。此時Nrf2與Keap1解離，移入胞核，并與Maf蛋白形成復(fù)合物，與靶基因上游的ARE結(jié)合啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄。現(xiàn)在已經(jīng)知道，Bach1可與Nrf2靶基因之一的血紅素加氧酶1基因的ARE結(jié)合，抑制人類和小鼠的血紅素加氧酶1基因轉(zhuǎn)錄［36］。還有研究指出Nrf2對血紅素加氧酶1的轉(zhuǎn)錄啟動作用是以Bach1的出核降解為前提的［37］。當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2增多時，可誘導(dǎo)Bach1的重新合成和入核，進(jìn)而抑制Nrf2的活性［36］。顯然，Nrf2的這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用有利于Nrf2/ARE信號通路的及時終止和避免Nrf2活性的劇烈波動。Chen等［38］發(fā)現(xiàn)P21蛋白可通過其KRR模體直接與Nrf2的DLG模體和ETGE模體相互作用，增加Nrf2蛋白的穩(wěn)定性；由于可與Keap1競爭性地結(jié)合Nrf2，因而還可減少Keap1介導(dǎo)的Nrf2泛素化降解。事實(shí)上，細(xì)胞內(nèi)還具有許多蛋白質(zhì)因子（P62/SQSTM1，二肽基肽酶3/DPP3等）可通過競爭性地結(jié)合Keap1而使Nrf2活化，這可能是基礎(chǔ)狀態(tài)下Nrf2/ARE信號通路仍然具有部分活性的原因。

3.2 Nrf2活性調(diào)控的表觀遺傳學(xué)機(jī)制

Nrf2活性調(diào)控主要發(fā)生在蛋白質(zhì)水平，但是近年來發(fā)現(xiàn)Nrf2的表觀遺傳學(xué)調(diào)控也可能具有重要意義。盡管Nrf2廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞，但不同類型細(xì)胞的Nrf2 mRNA表達(dá)水平卻相差很大［39］，造成這種差異的原因尚不清楚。但在前列腺腫瘤發(fā)生過程中，發(fā)現(xiàn)Nrf2的表達(dá)量顯著降低，這是因?yàn)樵贜rf2的啟動子區(qū)域具有5個CpG序列，這些CpG序列發(fā)生了高度的甲基化［40］。由此可推測，不同類型正常細(xì)胞的Nrf2表達(dá)差異也可能與表觀遺傳學(xué)調(diào)控有關(guān)。目前關(guān)于Nrf2表觀遺傳學(xué)調(diào)控的研究并不多，這里主要介紹Nrf2啟動子多態(tài)性和miRNA對Nrf2表達(dá)水平的調(diào)節(jié)及機(jī)制。

3.2.1 Nrf2啟動子多態(tài)性對Nrf2表達(dá)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，小鼠Nrf2基因啟動子區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性可影響Nrf2基因的表達(dá)，該多態(tài)性位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-336 bp的位置，與不同品系小鼠對急性肺損傷的易感性差異有關(guān)［41］。值得注意的是，在人類NRF2基因啟動子區(qū)域也發(fā)現(xiàn)了一個單核苷酸多態(tài)性調(diào)控Nrf2表達(dá)的例子，該單核苷酸多態(tài)性位于一個ARE樣序列（rs6721961）中，與人Nrf2表達(dá)量降低和對肺損傷易感性增加有關(guān)［42］。

3.2.2 miRNA對Nrf2表達(dá)的調(diào)控

miRNA可抑制Nrf2 mRNA的翻譯過程，這是因?yàn)檫@些miRNA可與Nrf2 mRNA的3′非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對，降低Nrf2 mRNA的穩(wěn)定性并阻遏其翻譯過程。迄今，所有miRNA對Nrf2表達(dá)水平影響的實(shí)驗(yàn)都是體外人為增加某種miRNA的表達(dá)水平，觀察到Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)量降低。但在自然狀態(tài)下，miRNA對Nrf2表達(dá)水平是否有影響，以及這種調(diào)控作用在所有Nrf2活性調(diào)控機(jī)制中的相對重要性仍有待進(jìn)一步研究。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在人MCF-7乳腺癌細(xì)胞中異位表達(dá)miR-28可以降低Nrf2 mRNA和蛋白的表達(dá)量［43］；在人SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中過表達(dá)miR-27a，miRNA-142-5p，miRNA-144及miR-153也可降低Nrf2 mRNA和蛋白的表達(dá)量［44］；同樣，在人MCF-10A和T47D乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-93，可降低Nrf2 mRNA和蛋白的表達(dá)［45］。目前關(guān)于lncRNA對Nrf2表達(dá)水平調(diào)控的研究很少，但是與miRNA類似，lncRNA很可能也參與了Nrf2活性的表觀遺傳學(xué)調(diào)控，因而需要更深入的探索和研究。

總的來看，Nrf2活性的表觀遺傳學(xué)調(diào)控可能是一種對Nrf2活性的長期調(diào)控或基礎(chǔ)調(diào)控，對外界環(huán)境因子的敏感性和反應(yīng)性可能不及Keap1或蛋白激酶。Keap1和蛋白激酶對Nrf2活性的調(diào)控是一種直接、迅速、即時的調(diào)控，對于細(xì)胞應(yīng)對氧化應(yīng)激和化學(xué)應(yīng)激可能更為重要。

3.3 小分子化學(xué)物對Nrf2活性的調(diào)控

Nrf2/ARE信號通路與多種疾病密切相關(guān)，是很有前景的藥物作用靶點(diǎn)。目前已有許多可調(diào)節(jié)Nrf2活性的天然和人工合成化學(xué)物。它們可分為Nrf2活性激活劑和抑制劑2類。值得指出的是，這些小分子化學(xué)物對Nrf2活性的調(diào)節(jié)多是間接性和激活性的。今后需要加大直接調(diào)節(jié)Nrf2活性和抑制Nrf2活性小分子化學(xué)物的研究，因?yàn)橐延醒芯勘砻鳎琋rf2過度活化與腫瘤細(xì)胞的耐藥性有關(guān)，利用Nrf2的抑制劑可增加腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性?？箟难崾且环N高效的抗氧化劑，可降低細(xì)胞內(nèi)過氧化物水平，最終抑制Nrf2與GCL基因啟動子區(qū)域的ARE結(jié)合。用抗壞血酸處理具有伊馬替尼抗性的細(xì)胞系KCL22/SR導(dǎo)致細(xì)胞谷胱甘肽水平降低和對伊馬替尼敏感性的增強(qiáng)。KCL22/SR細(xì)胞對伊馬替尼敏感性的增強(qiáng)至少部分是由于抗壞血酸對Nrf2活性的抑制［46］，但抗壞血酸對Nrf2活性的抑制顯然是一種間接依賴Keap1的方式。Wang等［47］發(fā)現(xiàn)全反式視黃酸可顯著抑制Nrf2的活性，其機(jī)制是在全反式視黃酸的存在下，Nrf2可與視黃酸受體α形成Nrf2-視黃酸受體α復(fù)合體，因而無法與靶基因啟動子區(qū)域的ARE結(jié)合。最近Olayanju等［48］發(fā)現(xiàn)一種苦木苦味素化合物鴉膽子苦醇（brusatol）能迅速和一過性地降低Nrf2蛋白質(zhì)水平，且證明這種抑制是發(fā)生在Nrf2轉(zhuǎn)錄后水平（即只有Nrf2蛋白表達(dá)降低，而Nrf2 mRNA表達(dá)并未下降），是Keap1、蛋白激酶等非依賴性的，但是鴉膽子苦醇導(dǎo)致Nrf2蛋白表達(dá)降低的具體機(jī)制尚不清楚。木犀草素（lute?olin）是一種黃酮類植物化學(xué)物，可以氧化-還原非依賴性方式抑制ARE基因的表達(dá)［49］。已知非小細(xì)胞性肺癌A549中Nrf2組成型活化，木犀草素處理細(xì)胞后能顯著降低Nrf2的mRNA和蛋白質(zhì)水平，致使Nrf2無法入核與ARE結(jié)合，進(jìn)而下調(diào)ARE基因的表達(dá)。木犀草素的這種作用可能與其加速Nrf2 mRNA的降解有關(guān)。但是，Lin等［50］卻在PC12細(xì)胞中得出了完全相反的結(jié)論，在PC12細(xì)胞中木犀草素能促進(jìn)血紅素加氧酶-1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，增加Nrf2與ARE的結(jié)合。事實(shí)上，目前對抑制Nrf2活性的小分子化學(xué)物的研究很少且爭議頗多。今后需加強(qiáng)這方面的研究，如通過高通量篩選和基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)等方法開發(fā)安全、高效、可逆的Nrf2小分子抑制劑，以便于實(shí)驗(yàn)室和臨床上的應(yīng)用。

4 Nrf2/ARE信號通路調(diào)控的靶基因

4.1 抗氧化蛋白/酶類基因

Nrf2/ARE信號通路是氧化應(yīng)激時機(jī)體激活的最主要的通路，可激活許多抗氧化蛋白/酶類的表達(dá)?？寡趸鞍?酶類可有效代謝各種自由基、ROS及其他過氧化物，避免過氧化物對細(xì)胞的損傷，有利于細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下的存活?，F(xiàn)已證明，Nrf2/ARE通路激活的抗氧化酶類有血紅素加氧酶1、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽還原酶2和4和依賴還原型輔酶Ⅱ/醌氧還蛋白1等，這些酶類都具有抗氧化功能，能減少過氧化物的產(chǎn)生或加速過氧化物、自由基的清除。Nrf2/ARE通路激活的抗氧化蛋白很多，主要包括過氧化氧還蛋白1和6、巰基氧還蛋白1、硫氧還蛋白（thioredoxin）和谷胱甘肽等。它們對于清除自由基、避免生物大分子氧化損傷具有重要意義［8］。

4.2 解毒酶類基因

Nrf2/ARE信號通路也是化學(xué)應(yīng)激時機(jī)體激活的主要通路，可以激活許多代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)、排泄有毒化學(xué)物的蛋白和酶類，有利于細(xì)胞在化學(xué)應(yīng)激狀態(tài)下的存活。Nrf2促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的解毒酶類包含了Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ相解毒酶［8］，Ⅰ相解毒酶主要是催化外源化學(xué)物的氧化、還原和水解反應(yīng)，可以直接破壞毒物的結(jié)構(gòu)，降低毒性。Ⅱ相解毒酶主要催化外源化學(xué)物或外源化學(xué)物經(jīng)Ⅰ相解毒酶代謝的中間產(chǎn)物的結(jié)合反應(yīng)，增加化學(xué)物的水溶性，促進(jìn)其排出體外。Ⅲ相解毒實(shí)質(zhì)上是細(xì)胞將細(xì)胞內(nèi)的外源化學(xué)物泵出細(xì)胞的過程，主要由一些依賴ATP的主動轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白承擔(dān)。

5 結(jié)語

Nrf2/ARE信號通路是機(jī)體應(yīng)對氧化應(yīng)激和化學(xué)應(yīng)激的主要通路，參與細(xì)胞增殖、三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝、細(xì)胞凋亡和衰老等多種生物學(xué)過程，與腫瘤、心血管疾病、糖尿病、慢性阻塞性肺病、肝腎疾病和炎癥等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。該通路主要受胞漿蛋白Keap1和各種蛋白激酶信號通路的調(diào)控，而表觀遺傳學(xué)調(diào)控也具有一定的意義，這方面的研究較少，需要進(jìn)一步的探索。Nrf2活化的靶基因絕大多數(shù)都是細(xì)胞保護(hù)基因，可促進(jìn)細(xì)胞存活，避免細(xì)胞受到損害，因而是很有前景的藥物作用靶點(diǎn)。

［1］Sayre LM，Perry G，Smith MA.Oxidative stress and neurotoxicity［J］.Chem Res Toxicol，2008，21（1）：172-188.

［2］Yu X，Kensler T.Nrf2 as a target for cancer che?moprevention［J］.Mutat Res，2005，591（1-2）：93-102.

［3］Tkachev VO，Menshchikova EB，Zenkov NK. Mechanism of the Nrf2/Keap1/ARE signaling sys?tem［J］.Biochemistry（Mosc），2011，76（4）：407-422.

［4］Li J，Lee JM，Johnson JA.Microarray analysis re?veals an antioxidant responsive element-driven gene set involved in conferring protection from an oxidative stress-induced apoptosis in IMR-32 cells［J］.J BiolChem，2002，277（1）：388-394.

［5］Moi P，Chan K，Asunis I，Cao A，Kan YW.Isola?tion of NF-E2-related factor 2（Nrf2），a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF-E2/AP1 repeat of the beta-globin locus control region［J］.Proc Natl Acad SciUSA，1994，91（21）：9926-9930.

［6］Sykiotis GP，Bohmann D.Stress-activated cap‘n’collar transcription factors in aging and human dis?ease［J］.SciSignal，2010，3（112）：re3.

［7］Chevillard G，Blank V.NFE2L3（NRF3）：the Cin?derella of the cap‘n’collar transcription factors［J］.Cell MolLife Sci，2011，68（20）：3337-3348.

［8］Hayes JD，Dinkova-Kostova AT.The Nrf2 regula?tory network provides an interface between redox and intermediary metabolism［J］.Trends Bio?chem Sci，2014，39（4）：199-218.

［9］Hirotsu Y，Katsuoka F，F(xiàn)unayama R，Nagashima T，Nishida Y，Nakayama K，et al.Nrf2-MafG het?erodimers contribute globally to antioxidant and metabolic networks［J］.Nucleic Acids Res，2012，40（20）：10228-10239.

［10］Tong KI，Katoh Y，KusunokiH，Itoh K，Tanaka T，Yamamoto M.Keap1 recruits Neh2 through bind?ing to ETGE and DLG motifs：characterization of the two-site molecular recognition model［J］.Mol CellBiol，2006，26（8）：2887-2900.

［11］Nioi P，Mcmahon M，Itoh K，Yamamoto M，Hayes JD.Identification of a novel Nrf2-regulated antioxidant response element（ARE）in the mouse NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1 gene：reassessment of the ARE consensus se?quence［J］.Biochem J，2003，374（Pt2）：337-348.

［12］Hayes JD，Mcmahon M.NRF2 and KEAP1 muta?tions：permanent activation of an adaptive re?sponse in cancer［J］.Trends Biochem Sci，2009，34（4）：176-188.

［13］Kim JH，Yu S，Chen JD，Kong AN.The nuclear cofactor RAC3/AIB1/SRC-3 enhances Nrf2 signal? ing by interacting with transactivation domains［J］.Oncogene，2013，32（4）：514-527.

［14］Rada P，Rojo AI，Chowdhry S，Mcmahon M，Hayes JD，Cuadrado A.SCF/β-TrCP promotes glycogen synthase kinase 3-dependent degradation of the Nrf2 transcription factor in a Keap1-independent manner［J］.Mol Cell Biol，2011，31（6）：1121-1133.

［15］Rada P，Rojo AI，Evrard-Todeschi N，Innamora?to NG，Cotte A，Jaworski T，et al.Structural and functional characterization of Nrf2 degradation by the glycogen synthase kinase 3/β-TrCP axis［J］. MolCell Biol，2012，32（17）：3486-3499.

［16］Chowdhry S，Zhang Y，Mcmahon M，Sutherland C，Cuadrado A，Hayes JD.Nrf2 is controlled by two distinctβ-TrCP recognition motifs in its Neh6 domain，one ofwhich can be modulated by GSK-3 activity［J］.Oncogene，2013，32（32）：3765-3781.

［17］Wang H，Liu K，Geng M，Gao P，Wu X，Hai Y，et al.RXRαinhibits the NRF2-ARE signaling path?way through a direct interaction with the Neh7 do?main of NRF2［J］.Cancer Res，2013，73（10）：3097-3108.

［18］Kobayashi M，Itoh K，Suzuki T，Osanai H，Nishi?kawa K，Katoh Y，et al.Identification of the inter?active interface and phylogenic conservation of the Nrf2-Keap1 system［J］.Genes Cells，2002，7（8）：807-820.

［19］Kang MI，Kobayashi A，Wakabayashi N，Kim SG，Yamamoto M.Scaffolding of Keap1 to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective phase 2 genes［J］. Proc NatlAcad SciUSA，2004，101（7）：2046-2051.

［20］Dinkova-Kostova AT，Holtzclaw WD，Cole RN，Itoh K，Wakabayashi N，Katoh Y，et al.Direct ev?idence that sulfhydryl groups of Keap1 are the sensors regulating induction of phase 2 enzymes that protect against carcinogens and oxidants［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（18）：11908-11913.

［21］Zhang DD，Hannink M.Distinct cysteine residues in Keap1 are required for Keap1-dependent ubiq?uitination of Nrf2 and for stabilization of Nrf2 by chemopreventive agents and oxidative stress［J］. MolCell Biol，2003，23（22）：8137-8151.

［22］Kobayashi M，Li L，Iwamoto N，Nakajima-Takagi Y，Kaneko H，Nakayama Y，et al.The antioxi?dant defense system Keap1-Nrf2 comprises a multiple sensing mechanism for responding to a wide range of chemical compounds［J］.Mol CellBiol，2009，29（2）：493-502.

［23］Fourquet S，Guerois R，Biard D，Toledano MB. Activation of NRF2 by nitrosative agents and H2O2involves KEAP1 disulfide formation［J］.J Biol Chem，2010，285（11）：8463-8471.

［24］Mcmahon M，Lamont DJ，Beattie KA，Hayes JD. Keap1 perceives stress via three sensors for the endogenous signaling molecules nitric oxide，zinc，and alkenals［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（44）：18838-18843.

［25］Hourihan JM，Kenna JG，Hayes JD.The gaso?transmitter hydrogen sulfide induces nrf2-target genes by inactivating the keap1 ubiquitin ligase substrate adaptor through formation of a disulfide bond between cys-226 and cys-613［J］.Antioxid Redox Signal，2013，19（5）：465-481.

［26］Nguyen T，Yang CS，Pickett CB.The pathways and molecular mechanisms regulating Nrf2 activa?tion in response to chemicalstress［J］.Free Rad?ic BiolMed，2004，37（4）：433-441.

［27］Mcmahon M，Thomas N，Itoh K，Yamamoto M，Hayes JD.Dimerization of substrate adaptors can facilitate cullin-mediated ubiquitylation of proteins by a″tethering″mechanism：a two-site interaction model for the Nrf2-Keap1 complex［J］.J Biol Chem，2006，281（34）：24756-24768.

［28］Tong KI，Katoh Y，KusunokiH，Itoh K，Tanaka T，Yamamoto M.Keap1 recruits Neh2 through bind?ing to ETGE and DLG motifs：characterization of the two-site molecular recognition model［J］.Mol CellBiol，2006，26（8）：2887-2900.

［29］Zhang DD，Lo SC，Cross JV，Templeton DJ，Hannink M.Keap1 is a redox-regulated substrate adaptor protein for a Cul3-dependent ubiquitin ligase complex［J］.Mol Cell Biol，2004，24（24）：10941-10953.

［30］Okawa H，MotohashiH，KobayashiA，AburataniH，Kensler TW，Yamamoto M.Hepatocyte-specific deletion ofthe keap1 gene activates Nrf2 and con?fers potent resistance against acute drug toxicity［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，339（1）：79-88.

［31］Huang HC，Nguyen T，Pickett CB.Regulation of the antioxidant response element by protein ki?nase C-mediated phosphorylation of NF-E2-relat?ed factor 2［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（23）：12475-12480.

［32］Bloom DA，Jaiswal AK.Phosphorylation of Nrf2 at Ser40 by protein kinase C in response to anti?oxidants leads to the release of Nrf2 from INrf2， but is not required for Nrf2 stabilization/accumula?tion in the nucleus and transcriptional activation of antioxidant response element-mediated NAD（P）H：quinone oxidoreductase-1 gene expression［J］.J BiolChem，2003，278（45）：44675-44682.

［33］Numazawa S，Ishikawa M，Yoshida A，Tanaka S，Yoshida T.Atypicalprotein kinase C mediates ac?tivation of NF-E2-related factor 2 in response to oxidative stress［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2003，285（2）：C334-C342.

［34］Kaspar JW，Jaiswal AK.Tyrosine phosphoryla?tion controls nuclear export of Fyn，allowing Nrf2 activation of cytoprotective gene expression［J］. FASEB J，2011，25（3）：1076-1087.

［35］Baird L，Dinkova-Kostova AT.The cytoprotective role of the Keap1-Nrf2 pathway［J］.Arch Toxi?col，2011，85（4）：241-272.

［36］Jyrkk?nen HK，Kuosmanen S，Hein?niemi M，Laitinen H，Kansanen E，Mella-Aho E，et al. Novel insights into the regulation of antioxidantresponse-element-mediated gene expression by electrophiles：induction of the transcriptional re?pressor BACH1 by Nrf2［J］.Biochem J，2011，440（2）：167-174.

［37］Reichard JF，Motz GT，Puga A.Heme oxygen?ase-1 induction by NRF2 requires inactivation of the transcriptional repressor BACH1［J］.Nucleic Acids Res，2007，35（21）：7074-7086.

［38］Chen W，Sun Z，Wang XJ，Jiang T，Huang Z，F(xiàn)ang D，et al.Direct interaction between Nrf2 and p21（Cip1/WAF1）upregulates the Nrf2-medi?ated antioxidant response［J］.Mol Cell，2009，34（6）：663-673.

［39］McMahon M，Itoh K，Yamamoto M，Chanas SA，Henderson CJ，McLellan LI，et al.The Cap’n’Collar basic leucine zipper transcription factor Nrf2（NF-E2 p45-related factor 2）controls both constitutive and inducible expression of intestinal detoxification and glutathione biosynthetic enzymes［J］.Cancer Res，2001，61（8）：3299-3307.

［40］Yu S，Khor TO，Cheung KL，Li W，Wu TY，Huang Y，et al.Nrf2 expression is regulated by epigenetic mechanisms in prostate cancer of TRAMP mice［J］.PLoS One，2010，5（1）：e8579.

［41］Cho HY，Jedlicka AE，Reddy SP，Zhang LY，Kensler TW，Kleeberger SR.Linkage analysis of susceptibility to hyperoxia.Nrf2 is a candidate gene［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2002，26（1）：42-51.

［42］SuzukiT，Shibata T，Takaya K，ShiraishiK，KohnoT，Kunitoh H，et al.Regulatory nexus of synthe?sis and degradation deciphers cellular Nrf2 ex?pression levels［J］.Mol Cell Biol，2013，33（12）：2402-2412.

［43］Yang M，Yao Y，Eades G，Zhang Y，Zhou Q. MiR-28 regulates Nrf2 expression through a Keap1-independent mechanism［J］.Breast Cancer Res Treat，2011，129（3）：983-991.

［44］Narasimhan M，PatelD，Vedpathak D，Rathinam M，Henderson G，Mahimainathan L.Identification of novel microRNAs in post-transcriptional control of Nrf2 expression and redox homeostasis in neuronal，SH-SY5Y cells［J］.PLoS One，2012，7（12）：e51111.

［45］Singh B，Ronghe AM，Chatterjee A，Bhat NK，Bhat HK.MicroRNA-93 regulates NRF2 expres?sion and is associated with breast carcinogenesis［J］.Carcinogenesis，2013，34（5）：1165-1172.

［46］Tarumoto T，Nagai T，Ohmine K，Miyoshi T，Nakamura M，Kondo T，et al.Ascorbic acid restores sensitivity to imatinib via suppression of Nrf2-dependent gene expression in the imatinibresistantcellline［J］.Exp Hematol，2004，32（4）：375-381.

［47］Wang XJ，Hayes JD，Henderson CJ，Wolf CR. Identification of retinoic acid as an inhibitor oftran?scription factor Nrf2 through activation of retinoic acid receptor alpha［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（49）：19589-19594.

［48］Olayanju A，Copple IM，Bryan HK，Edge GT，Si?son RL，Wong MW，et al.Brusatol provokes a rapid and transient inhibition of Nrf2 signaling and sensitizes mammalian cells to chemical toxicityimplications for therapeutic targeting of Nrf2［J］. Free Radic BiolMed，2015，78：202-212.

［49］Tang X，Wang H，F(xiàn)an L，Wu X，Xin A，Ren H，et al.Luteolin inhibits Nrf2 leading to negative reg?ulation of the Nrf2/ARE pathway and sensitization of human lung carcinoma A549 cells to therapeu?tic drugs［J］.Free Radic Biol Med，2011，50（11）：1599-1609.

［50］Lin CW，Wu MJ，Liu IY，Su JD，Yen JH.Neuro?trophic and cytoprotective action of luteolin in PC12 cells through ERK-dependent induction of Nrf2-driven HO-1 expression［J］.J Agric Food Chem，2010，58（7）：4477-4486.

Research progress in molecular structure and function of nuclear factor erythroid 2 related factor 2 and Keap1 and regulation mechanism of signalpathways

WANG Zhao-yang，JING Li
（Schoolof Public Health，CapitalMedica lUniversity，Beijing 100069，China）

The binding of the nuclear factor erythroid 2 related factor 2（Nrf2）to the antioxidant response elements（ARE）can start the expression of batches of antioxidant proteins，anti-inflammatory factors and detoxification enzymes.Nrf2/ARE signalling plays a pivotalrole in anti-inflammation and in preventing xenobiotics induced lesions.Besides involvenment in physiological processes，such as regulating nutrient metabolism，Nrf2/ARE signalling also functions in the pathogenesis ofvarious dieases. This review outlines the strcuture，functions，and regulation of Nrf2/ARE signalpathways.

nuclear factor erythroid 2 related factor 2；oxidative sress；antioxidantresponse ele?ment；regulation mechanism

The projectsupported by NationalNaturalScience Foundation of China（81202608）

JING Li，E-mail：jingli12@163.com

R963

A

1000-3002-（2016）05-0598-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.018

2015-09-07接受日期：2015-11-12）

（本文編輯：齊春會）

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202608）

王朝陽，碩士研究生，Tel：18811625182，E-mail：18611000168@163.com

荊黎，Tel：15810500163，E-mail：Jingli12@ 163.com