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    致病性蠟樣芽胞桿菌的研究進(jìn)展

    2016-01-30 12:28:10黃靜敏蘭全學(xué)深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院廣東深圳518131
    關(guān)鍵詞:腸毒素蠟樣芽胞

    劉 芳 羅 臻 黃靜敏 蘭全學(xué)(深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院 廣東深圳 518131)

    致病性蠟樣芽胞桿菌的研究進(jìn)展

    劉芳羅臻黃靜敏蘭全學(xué)
    (深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院廣東深圳518131)

    概述了蠟樣芽胞桿菌的生物學(xué)特性、致病性及其檢測(cè)方法,并探討各種檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)和局限性。有助于對(duì)食品中蠟樣芽孢桿菌污染進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,為食品安全風(fēng)險(xiǎn)管理提供依據(jù)。

    蠟樣芽胞桿菌;致病性;檢測(cè)

    1 前言

    在我國(guó),細(xì)菌性微生物是導(dǎo)致食源性疾病發(fā)生的主要病因,嚴(yán)重危及人們的健康,成為目前較為突出的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一,每年我國(guó)食源性致病菌導(dǎo)致數(shù)千萬(wàn)人次發(fā)病,由此造成的損失巨大。我國(guó)的主要食源性致病菌包括沙門(mén)氏菌(Salmonella)、志賀氏菌(Shigella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、溶血性鏈球菌(Streptococcus hemolyticus)、大腸埃希氏菌O157(Escherichia coli O157)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)等。其中,蠟樣芽胞桿菌引發(fā)的食物中毒問(wèn)題越來(lái)越受到人們的關(guān)注。蠟樣芽胞桿菌是芽孢桿菌屬的一種革蘭氏陽(yáng)性菌,兼性需氧,廣泛分布于土壤、灰塵和污水中,也是食品中常見(jiàn)污染菌和條件致病菌[1]。少量攝入蠟樣芽胞桿菌不會(huì)引起食物中毒,只有其在食物中成指數(shù)生長(zhǎng)才會(huì)產(chǎn)生腸毒素。一般認(rèn)為蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒屬毒素型食物中毒。

    2 蠟樣芽胞桿菌的生物學(xué)特性

    蠟樣芽胞桿菌菌體大小為 (1.0 μm-1.2 μm)× (3.0 μm-5.0 μm),芽孢呈橢圓形,在營(yíng)養(yǎng)肉湯中32℃培養(yǎng)3 d后,芽孢形成率在90%以上,80℃-85℃水浴5 min-10 min可刺激芽孢萌發(fā);最高生長(zhǎng)溫度35℃-45℃,最低生長(zhǎng)溫度10℃-20℃,10℃以下和63℃以上不繁殖,65℃-70℃菌體易死去;最適生長(zhǎng)pH為4.3-9.3;在葡萄糖洋菜上生長(zhǎng)的菌落細(xì)胞含有復(fù)紅不著色的小球,不產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)蛋白晶體[2];在普通瓊脂上形成的菌落較大,灰白色、不透明,表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀,邊緣常呈擴(kuò)展?fàn)睿桓事洞悸腰S多粘菌素瓊脂培養(yǎng)基上菌落為粉紅色、周?chē)邪咨某恋憝h(huán)[3];蠟樣芽孢桿菌能夠發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸,不發(fā)酵阿拉伯糖、木糖和甘露醇,有運(yùn)動(dòng)性,可還原硝酸鹽,分解酪氨酸,厭氧時(shí)可利用葡萄糖,過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、卵黃反應(yīng)、V-P反應(yīng)呈陽(yáng)性,能產(chǎn)生卵磷脂酶和酪蛋白酶[4]。

    3 蠟樣芽孢桿菌的致病性

    在細(xì)菌性食物中毒事件中,由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒比較常見(jiàn)。早在1973年,Bulyba等人就報(bào)道了污染蠟樣芽孢桿菌的乳制品引起食物中毒[5]。1994-2003年十年內(nèi),國(guó)內(nèi)報(bào)道的蠟樣芽孢桿菌食物中毒共47起,其中食物中毒進(jìn)食人數(shù)2541人,中毒者1758人,發(fā)病率69.19%,但是無(wú)一人死亡[6]。據(jù)2008-2010年我國(guó)突發(fā)公共衛(wèi)生事件報(bào)告管理信息系統(tǒng)統(tǒng)計(jì),我國(guó)細(xì)菌性食物中毒中,由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒在發(fā)生起數(shù)和發(fā)病人數(shù)方面均居前三位[7]。

    蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒臨床表現(xiàn)為發(fā)病急,來(lái)勢(shì)猛,主要癥狀為惡心、嘔吐和腹瀉。蠟樣芽胞桿菌是條件致病菌,主要是通過(guò)產(chǎn)生腹瀉毒素和嘔吐毒素導(dǎo)致食物中毒,偶見(jiàn)菌體感染引起眼疾、心內(nèi)膜炎、腦膜炎和菌血癥等疾?。?]。食品中蠟樣芽孢桿菌數(shù)量超過(guò)105CFU/g時(shí)即可導(dǎo)致嘔吐和腹瀉,嘔吐的主要原因是某些菌株代謝產(chǎn)生了熱穩(wěn)定的嘔吐毒素,而腹瀉與蠟樣芽孢桿菌分泌的各種腸毒素有關(guān)[8]。嘔吐毒素是一種環(huán)形肽,分子量為1 153.38 u,在126℃加熱90 min和在pH 2-12的條件下仍有活性,主要中毒癥狀為惡心、嘔吐,伴有腹瀉、頭暈、發(fā)燒和四肢無(wú)力等癥狀,與金黃色葡萄球菌引發(fā)的食物中毒現(xiàn)象類(lèi)似,中毒的潛伏期一般為0.5 h-6 h,一般限于富含淀粉質(zhì)的食品,特別是米飯。腹瀉毒素是一種分子量在38000 u-46000 u之間的蛋白質(zhì),56℃下加熱5 min失活,遇到胰蛋白酶或胃蛋白酶失活,有抗原性;中毒癥狀類(lèi)似于產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens)食物中毒現(xiàn)象:水樣腹瀉、腹部痙攣和疼痛,嘔吐很少見(jiàn)。常因食用肉類(lèi)、海鮮、乳品和蔬菜等食物引起,潛伏期一般為6 h-15 h,一般持續(xù)24 h[9-11]。

    蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒可分為嘔吐型和腹瀉型兩類(lèi)[12],主要毒力因子包括:與嘔吐毒素相關(guān)的非核糖體多肽合成酶系(NRPS)基因[13];與腹瀉毒素相關(guān)的溶血素 BL基因 (hblA、hblB、hblC和hblD)、非溶血性腸毒素Nhe基因 (nheA、nheB和nheC)、腸毒素 FM 基因 (entFM)、腸毒素T基因(bceT)和細(xì)胞毒素K基因 (cytK)[14]。hblA、hblB、hblC、hblD基因可以編碼相應(yīng)蛋白 HblA、HblB、HblC、HblD;nheA、nheB、nheC編碼相應(yīng)蛋白NheA、NheB、NheC;bceT和cytK基因分別編碼腸毒素T和細(xì)胞毒素K。

    4 蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)方法的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

    目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)于蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)方法,主要有生化檢測(cè)方法、PCR技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)等。

    4.1生化檢測(cè)方法

    生化檢測(cè)方法原理是通過(guò)目標(biāo)菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的酶和代謝物的生化反應(yīng)判斷是否為蠟樣芽孢桿菌。生理生化試驗(yàn)一般涉及葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、改良V-P試驗(yàn)、L-酪氨酸分解試驗(yàn)、溶菌酶試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、蛋白毒素結(jié)晶試驗(yàn)等[15-16]。GERVASYM等[17-18]利用反向被動(dòng)乳膠凝集試驗(yàn)(RPLA)檢測(cè)食品中的蠟樣芽孢桿菌;黃訓(xùn)端等[19]利用VITEK自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定了草莓蠟樣芽孢桿菌,并與分子生物學(xué)的驗(yàn)證結(jié)果一致,表明VITEK的可靠性和準(zhǔn)確性。生化檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)成熟、易操作,標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法在微生物實(shí)驗(yàn)室易推廣,耗材成本低,對(duì)人員技術(shù)要求不高。

    然而,生化檢測(cè)方法操作步驟繁瑣,檢測(cè)周期長(zhǎng),商品化鑒定試劑盒的應(yīng)用雖然可以縮短檢測(cè)周期,但高額的成本不利于應(yīng)用推廣[4]。另外,生化檢測(cè)方法無(wú)法檢測(cè)毒力基因,對(duì)蠟樣芽孢桿菌致病性無(wú)法進(jìn)行評(píng)估[20]。

    4.2基于PCR的檢測(cè)方法

    PCR檢測(cè)技術(shù)特異性強(qiáng),靈敏度高,近年來(lái)在食源性致病菌檢測(cè)方面得到了廣泛應(yīng)用。王振國(guó)[21]等分別通過(guò)擴(kuò)增gyrB與hblA基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)蠟樣芽孢桿菌的快速檢測(cè)。VESAM等[22]發(fā)現(xiàn),通過(guò)PCR篩選HblA基因檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌方法比RPLA更快;BJARNE M H等[23]建立了利用PCR技術(shù)區(qū)分蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌的方法。由于蠟樣芽孢桿菌毒力基因的多樣性和個(gè)體差異性,不能通過(guò)單一毒力因子的檢測(cè)判定其致病因子,普通PCR技術(shù)有一定局限性。

    多重PCR(mPCR)技術(shù)能滿足同時(shí)擴(kuò)增多種DNA序列的需要,與普通PCR相比,更加快速、準(zhǔn)確和靈敏度高,能夠高效地檢測(cè)編碼多重毒素的蠟樣芽孢桿菌。Dzieciol等[24]針對(duì)蠟樣芽孢桿菌gyrB、16S rRNA和編碼嘔吐毒素的基因ces構(gòu)建了mPCR體系,成功檢測(cè)出人工污染牛奶中產(chǎn)嘔吐毒素和不產(chǎn)毒蠟樣芽孢桿菌,檢測(cè)限達(dá) 1.91×103CFU/mL;Wehrle等[25]利用溶血素基因 hbl、非溶血素基因 nhe和細(xì)胞毒素基因 cytK設(shè)計(jì)引物構(gòu)建 mPCR,對(duì)引起腹瀉的蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示所檢測(cè)的108份食物樣品中有14份被產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌污染;Yang等[26]利用5種不同的產(chǎn)腸毒素基因和一種產(chǎn)嘔吐毒素基因共設(shè)計(jì)了12對(duì)引物,構(gòu)建了的 mPCR方法檢測(cè)出蠟樣孢桿菌所有已知毒素基因;蔣培余等[27]通過(guò)設(shè)計(jì)引物和探針,優(yōu)化反應(yīng)條件,建立多重實(shí)時(shí)PCR,檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌16S rRNA保守區(qū)基因及其ces基因(編碼致嘔毒素cereulide)與菌株鑒定結(jié)果的符合率為100%,蠟樣芽孢桿菌的 ces基因檢測(cè)結(jié)果也與普通 PCR結(jié)果相符。mPCR能檢測(cè)到食品中產(chǎn)毒素和不產(chǎn)毒素的蠟樣芽孢桿菌,在實(shí)際檢測(cè)中具有較強(qiáng)應(yīng)用價(jià)值。然而由于mPCR涉及到多對(duì)引物和不同模板,所以在實(shí)驗(yàn)初期要對(duì)反應(yīng)體系的條件進(jìn)行優(yōu)化,檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。

    熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)技術(shù)與常規(guī)PCR相比,更加快速準(zhǔn)確,重復(fù)性好,且能定量,可用于產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌引起食物中毒的快速鑒定。artinez等[28]以磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C基因(pcplc)為靶基因首次對(duì)食品中活的蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行了qPCR定量檢測(cè),在人工污染的液態(tài)蛋樣品中檢測(cè)限能達(dá)到1.1×104CFU/mL;Lim等[29]針對(duì)groEL和ces設(shè)計(jì)引物和探針,分別特異性檢測(cè)不產(chǎn)和產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌,在純培養(yǎng)物中的檢測(cè)限均為1.0×100CFU/反應(yīng),并能準(zhǔn)確檢測(cè)豆醬樣品中的產(chǎn)毒和不產(chǎn)毒蠟樣芽孢桿菌;Hansen等[30]用hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC和bceT為目的基因設(shè)計(jì)引物,采用qPCR技術(shù)對(duì)63株產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌的毒素基因分布進(jìn)行了分析;王紅[31]等通過(guò)qPCR技術(shù)檢測(cè)34株疑似蠟樣芽孢桿菌溶血素基因,33株均為陽(yáng)性,符合率為97.1%??焖?、靈敏及準(zhǔn)確定量的特點(diǎn)使qPCR技術(shù)對(duì)食物中食源性致病菌進(jìn)行定量檢測(cè)的應(yīng)用更加廣泛。

    4.3免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

    免疫學(xué)檢測(cè)方法主要是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA),具有檢測(cè)時(shí)間短、成本低、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。Day等[32]在1994年首次利用ELISA法對(duì)蠟樣芽孢桿菌的致腹瀉型腸毒素進(jìn)行檢測(cè);CHEN CH等[33]報(bào)道了用蛋白印記技術(shù)(Colony Blot Immunoassay CBI)快速檢測(cè)蠟樣芽抱桿菌的方法;Wehrle等[25]利用蠟樣芽孢桿菌的特異性抗體對(duì)產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌的Hbl-L2、NheA、NheB和NheC進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法不適用于蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)。利用抗體的方法雖然檢測(cè)速度較快,但易產(chǎn)生交叉反應(yīng)。另外,區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞需要針對(duì)特征性蛋白制備抗體,難度較大,對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)水平要求較高,并且檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性相對(duì)較低。

    5 結(jié)語(yǔ)

    目前蠟樣芽孢桿菌污染問(wèn)題已是家庭飲食及公共餐飲業(yè)存在的一個(gè)主要的問(wèn)題。有報(bào)道的蠟樣芽孢桿菌引發(fā)的食物中毒,多是和人們生活息息相關(guān)的食品。乳制品、蒸煮的米飯和炒飯、調(diào)味料、糧食制品、豆制品、肉制品、烘焙食品等食品都易發(fā)生蠟樣芽孢桿菌引發(fā)的食物中毒。一般而言,該菌在食品中大于105CFU/g時(shí),即可能引起食物中毒,這進(jìn)一步提高了對(duì)食品的安全性要求。并非所有蠟樣芽孢桿菌都具有致病性,只有部分菌株攜帶了與致病性相關(guān)的毒力基因,才會(huì)導(dǎo)致食源性疾病,因此對(duì)這些致病性菌株的毒力基因分布特征進(jìn)行研究具有十分重要的意義。

    現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、勞動(dòng)強(qiáng)度大、檢驗(yàn)成本高,因此急需建立致病性蠟樣芽孢桿菌的快速檢測(cè)體系,探索其毒力因子分布特征,有效彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的不足,為食品安全監(jiān)管以及臨床診斷提供可靠的手段。而且,了解食品中蠟樣芽孢桿菌主要毒力基因型,有助于食品中蠟樣芽孢桿菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,為食品安全風(fēng)險(xiǎn)管理提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù);對(duì)于建立和完善細(xì)菌性食源性疾病監(jiān)測(cè)和預(yù)警系統(tǒng),增強(qiáng)對(duì)細(xì)菌性食源性疾病暴發(fā)的反應(yīng)和預(yù)警能力,降低細(xì)菌性食源性疾病的發(fā)生率起著重要的作用。

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    Research Progress of Pathogenic Bacillus Cereus

    LIU Fang,LUO Zhen,HUANG Jingmin,LAN Quanxue
    (Shenzhen Academy of Metrology&Quality Inspection,Shenzhen,Guangdong,518131)

    Biologicalcharacteristics,pathogenicityanddetectionmethodsofBacilluscereusare introduced.Theadvantagesandlimitationsofeachdetectionmethodsarediscussed.Thispaper contributes to risk evaluation and administration of B.cereus contamination in food.

    Bacillus cereus;Pathogenicity;Detection

    TS207.4

    E-mail:4275777@qq.com

    2015-07-17

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