中醫(yī)藥干預擴張型心肌病合并心力衰竭心肌細胞凋亡調(diào)控通路研究進展*

陸曉濛　陸　曙（.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 0000；.南京中醫(yī)藥大學附屬無錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 無錫4000）

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中醫(yī)藥干預擴張型心肌病合并心力衰竭心肌細胞凋亡調(diào)控通路研究進展*

陸曉濛1陸曙2
（1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210000；2.南京中醫(yī)藥大學附屬無錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 無錫214000）

細胞凋亡是導致心肌細胞損傷的方式之一，是擴張型心肌病心力衰竭心肌細胞丟失和心功能不全的重要機制。中醫(yī)藥能夠干預心肌細胞凋亡的不同通路，抑制細胞凋亡。本文就擴張型心肌病心肌細胞凋亡的線粒體信號傳導通路、死亡受體信號傳導通路以及中醫(yī)藥對細胞凋亡的干預作用作一綜述。

擴張型心肌病心力衰竭細胞凋亡中醫(yī)藥綜述

擴張型心肌?。?-4］（DCM）是一類病因未明的復合型心肌病，以左心室、右心室或雙心腔擴大，引起心肌收縮功能減退等為特征。本病病情呈進行性加重，常導致不可逆的心力衰竭和嚴重心律失常，甚至心臟性猝死。大量研究表明［5-7］，細胞凋亡是導致心肌細胞損傷的方式之一，是DCM心力衰竭心肌細胞丟失和心功能不全的重要機制。中醫(yī)藥能夠干預心肌細胞凋亡的不同通路，抑制細胞凋亡，對維持機體內(nèi)環(huán)境平衡、減輕心肌組織病理損傷、改善心室重塑具有重要意義。筆者就DCM心肌細胞凋亡機制及中醫(yī)藥干預研究進展作一綜述。

1　線粒體信號傳導通路及中醫(yī)藥的干預作用

細胞凋亡（apoptosis）是受基因控制的主動性非炎癥性細胞死亡。目前認為經(jīng)典細胞凋亡信號傳導通路包括線粒體途徑（又稱內(nèi)源性途徑）和死亡受體信號途徑（又稱外源性途徑）等多條信號通路。

1.1線粒體信號傳導通路 （內(nèi)源性途徑）線粒體是細胞能量代謝的中心，主要由基質(zhì)、內(nèi)膜、外膜和膜間隙組成。膜間隙含有多種促凋亡因子，如細胞色素C （Cytc）、Caspases酶原、腺苷酸激酶、凋亡誘導因子（AIF）、促凋亡線粒體蛋白（Smac/DIABLO）、核酸內(nèi)切酶G（EndoG）等。心肌細胞內(nèi)的線粒體位于肌漿網(wǎng)鈣釋放位點附近［8］，各種胞內(nèi)或胞外刺激，如鈣平衡失調(diào)、DNA損傷、缺氧、細胞毒藥物等均可破壞線粒體正常功能，導致氧自由基生成增多、細胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸釋放增多引起細胞凋亡［9-10］。

研究發(fā)現(xiàn)促凋亡信號引起線粒體跨膜電位（ΔΨm）喪失必然導致心肌細胞凋亡的發(fā)生［9，11-12］。在凋亡早期階段，凋亡細胞發(fā)生形態(tài)學改變之前，位于線粒體膜上的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）不可逆地持續(xù)開放，引起線粒體內(nèi)膜兩側(cè)H+梯度消失，細胞跨膜電位崩解，呼吸鏈解偶聯(lián)，線粒體基質(zhì)滲透壓升高，內(nèi)膜腫脹，線粒體漲大，外膜漲破后使膜間隙的細胞色素C、細胞凋亡誘導因子等致死性蛋白釋放于胞漿內(nèi)。細胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）形成多聚復合體，Apaf-1與Caspase-9原域通過兩者共有的caspase募集結(jié)構域（CARD）發(fā)生蛋白-蛋白相互作用，募集胞質(zhì)中的Caspase-9前體，Caspase-9酶原之間相互靠近并自我剪切而活化，激活下游Caspase-3和Caspase-7，從而啟動Caspase級聯(lián)反應，導致細胞凋亡［13］。

Bcl-2家族蛋白是該途徑的關鍵調(diào)節(jié)因素，能夠調(diào)節(jié)MPTP的啟閉。MPTP主要由外膜的電壓依賴性陰離子通道（VDAC）、內(nèi)膜的腺苷酸轉(zhuǎn)位蛋白（ANT）和基質(zhì)的親環(huán)蛋白D（CyPD）等組成［14］。Bax為重要的促凋亡基因，可與VDAC或ANT結(jié)合，開啟MPTP；Bcl-2則是定位于線粒體膜上功能與Bax相反的基因，有穩(wěn)定MPTP的作用。當Bax/Bax同源二聚體大量解離，形成Bax/Bcl-2異源二聚體時，產(chǎn)生對抗誘導凋亡作用，使細胞趨于存活［15］。Di Napoli等發(fā)現(xiàn)，DCM患者心內(nèi)膜下層Bax表達增多，收縮期室壁張力增高及心肌細胞凋亡指數(shù)增加均與Bax/Bcl-2比率增加有關［16］。阿霉素是一種有效的抗腫瘤藥物，但其主要的嚴重副作用是累積性、劑量依賴性的心臟毒性反應，可進一步發(fā)展成不可逆性心肌損傷，最終導致心力衰竭。目前認為心肌細胞凋亡是阿霉素誘導心肌病變的一個主要因素［8］。有學者觀察了阿霉素對DCM模型SD大鼠心肌損傷各項指標的影響，發(fā)現(xiàn)凋亡相關基因P53通過上調(diào)細胞色素C、ICE、Bax，下調(diào)Bcl-2誘發(fā)大鼠心肌細胞凋亡，引起大鼠心功能明顯下降，出現(xiàn)顯著的心肌損傷［17］。在大鼠原代心肌細胞中，阿霉素孵育24 h后即可檢測到MTT吸光度值明顯降低，說明阿霉素可直接作用于心肌細胞，引起一系列心肌損害。

1.2中醫(yī)藥對線粒體通路的影響一些具有抑制心肌細胞凋亡作用的中藥，都有良好的線粒體保護作用。中藥黃芪具有健脾補中、升陽舉陷、益衛(wèi)固表、利尿、托毒生肌的作用，其主要成分是黃芪總黃酮、黃芪總皂苷和黃芪多糖。無論是臨床研究還是體外實驗，都已證實黃芪對心血管系統(tǒng)有明顯的保護作用。胡鳴旭等發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷組大鼠線粒體膜電位MMP較模型組增加，細胞凋亡率減低，端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶表達陽性增加，說明黃芪甲苷能夠維持受損心肌細胞MMP的穩(wěn)定性，提高心肌細胞端?；钚?，調(diào)節(jié)能量代謝，改善心肌供血，抑制心肌細胞凋亡促進增殖［18］。黃芪注射液具有正性肌力作用，穩(wěn)定缺血心肌細胞膜，保護線粒體及溶酶體，從而保護心肌細胞，減輕心肌損傷的作用［19］。從川芎傘形科蒿本屬植物的根莖中提取的活性成分川芎嗪具有活血行氣、祛風止痛、抑制鈣通道的作用，通過縮短鈣通道開放時間，抑制鈣離子跨膜內(nèi)流從而穩(wěn)定了線粒體跨膜電位［20］。牛黃的重要活性成分牛黃酸［21］在心肌組織中含量最豐富，可平衡細胞壓、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣濃度防止鈣超載、關閉PT孔阻止致死性蛋白釋放，干預凋亡通路，從而延緩心力衰竭和抗心律失常，具有良好的心肌保護作用。心肌細胞凋亡所致心肌細胞數(shù)目減少及剩余的心肌細胞收縮功能代償不足，是促發(fā)心力衰竭時左心室功能障礙不斷惡化和心室重塑的重要因素，因此阻止細胞凋亡能減輕心臟重構和心力衰竭的程度。賈清華等［22］采用腹主動脈縮窄法構建大鼠慢性心力衰竭模型，用免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)，參芪強心口服液（主要成分黨參、炙黃芪、柴胡、當歸、川芎等）干預1月后，Bcl-2表達明顯增高，細胞凋亡率降低，證實了該方可能通過上述作用保護心肌細胞，延緩或逆轉(zhuǎn)心力衰竭進程。此外，人參皂苷Rb1［23］和葛根素［24］以及具有β受體阻滯作用的淫羊藿總黃酮［25］均可抑制心肌細胞凋亡，改善心室重塑。

2　死亡受體信號傳導通路及中醫(yī)藥的干預作用

2.1死亡信號傳導通路 （外源性途徑）誘導細胞凋亡的另一條重要途徑是死亡信號傳導通路。死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族，胞漿區(qū)/胞內(nèi)有一誘導細胞凋亡的關鍵區(qū)域，稱為死亡域（DD）。死亡域由同源氨基酸殘基構成具有蛋白水解功能，以此招募下游的凋亡蛋白［26］。典型的死亡受體為Fas和腫瘤壞死因子受體（TNFR）。目前認為凋亡刺激基因Fas及其配體Fasl是調(diào)控凋亡信號途徑的重要基因［27］。

死亡受體Fas（CD95）屬于Ⅰ型跨膜蛋白，在膜內(nèi)的C端含有一段氨基酸序列與細胞凋亡信號傳遞有關的死亡域（DD）。Fas的天然配體為具有同源三聚體結(jié)構的Fasl，為Ⅱ型跨膜蛋白，但Fasl僅存在于活化的T細胞和NK細胞中［9］。Fas與其配體Fasl構成的Fas/Fasl系統(tǒng)對維持細胞正常發(fā)育和細胞穩(wěn)態(tài)至關重要［8］。

當表達Fas陽性的靶細胞與其配體Fasl銜接后，連接蛋白即Fas相關死亡域蛋白（FADD）直接與Fas的死亡域結(jié)合［11］，同時FADD氨基端的死亡效應受體（DED）與Caspase-8原域中的DED相作用，通過蛋白-蛋白相互作用形成了由Fas、FADD和Caspase-8組成的死亡誘導信號復合體 （DISC）［10］。寡聚復合體中酶原相互接近，局部酶原濃度升高，使蛋白水解活性很弱的Caspase-8酶原自我剪切而活化，自活化的Caspase-8釋放到胞質(zhì)中啟動Caspase級聯(lián)反應，激活下游的效應Caspase（如Caspase-3、Caspase-7）［26］，引起核酸內(nèi)切酶及需鈣蛋白酶活化，降解DNA修復酶，從而導致Fas表達陽性的靶細胞凋亡。TNFR介導凋亡同樣由不同的胞質(zhì)蛋白與其配體TNF的死亡結(jié)構域結(jié)合，通過Caspase級聯(lián)反應將死亡信號傳遞給TNFR蛋白陽性細胞并激活該細胞的凋亡程序。

Fas/Fasl系統(tǒng)作為凋亡信號傳導途徑，參與了DCM心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展。魏淑榮等應用免疫組化等技術對DCM猝死者心肌Fas蛋白進行定性定量檢測，發(fā)現(xiàn)DCM猝死組心肌Fas蛋白表達明顯增多，陽性著色在心肌縱切面細胞膜及胞漿內(nèi)呈棕黃色顆粒狀或條狀分布，橫斷面細胞膜見環(huán)形棕黃色顆粒帶，而對照組未見明顯變化，說明心肌Fas蛋白的這種數(shù)量改變可能與DCM發(fā)生的因心律失常和心力衰竭所致猝死有關［27］。另有研究報道，DCM患者心功能與血漿sFas水平呈負相關，心功能越差者sFas增高越明顯，心力衰竭進行性加重［28］。

2.2中醫(yī)藥對死亡受體途徑的影響有研究發(fā)現(xiàn)，急性病毒性心肌炎向慢性擴張型心肌病轉(zhuǎn)變的過程中，可能是由于病毒感染心肌細胞，引起凋亡相關蛋白高度表達并與特定配體結(jié)合后啟動細胞凋亡信號，導致心肌細胞不斷丟失，最終進展為DCM［29］。周亞濱等學者用腹腔注射柯薩奇病毒B3的方式，建立重復感染的早期病毒性DCM小鼠模型，證實了機體在應對病毒感染時啟動了細胞凋亡以清除入侵的病毒，同時促發(fā)宿主細胞過度凋亡引起宿主病理損傷，從而對心肌組織造成一定的損害［29-30］。觀察益氣養(yǎng)陰、活血化瘀方（由黃芪、紅參、生地黃、麥冬、五味子、川芎、丹參、蘭根、大青葉等藥物組成）高劑量組的心肌超微結(jié)構，可見心肌肌纖維走行基本規(guī)則，線粒體輕度增生，間質(zhì)膠原纖維增生不明顯，用TUNEL法檢測到其Fas/Fasl蛋白陽性表達也低于模型組，說明益氣養(yǎng)陰、活血化瘀方能夠減輕病毒性DCM小鼠的病理損傷，抑制心肌細胞肥大，抑制凋亡。川芎嗪不僅具有保護線粒體的功能，還可通過下調(diào)促凋亡基因Fas的表達，阻止細胞凋亡，且這種保護作用呈劑量依賴型［31］。董波等觀察益氣強心飲不同劑量干預慢性心衰陽虛水泛證大鼠細胞凋亡及Fas/Fasl基因蛋白表達的影響，該方由紅參、制附子、黃芪、葶藶子、澤蘭、五加皮、丹參等組成，共具益氣溫陽、活血利水之功，補虛不留邪，標本兼治，能明顯下調(diào)慢性心衰大鼠心肌組織Fas、Fasl基因蛋白表達，調(diào)控慢性心衰大鼠的心肌細胞凋亡，具有治療及延緩心衰的發(fā)展等作用［32］。

3　中醫(yī)藥對多條凋亡通路聯(lián)合作用的影響

研究發(fā)現(xiàn)，DCM病程中心力衰竭常多次反復發(fā)生，有逐漸加重趨勢，雖然凋亡信號能激活多種途徑中的一種，但是某些情況下細胞凋亡途徑常常相互交錯、相互影響，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”的Caspase-3就是多種凋亡途徑的共同下游效應部分。部分中醫(yī)藥不僅能夠單獨作用于某一條凋亡途徑發(fā)揮抗凋亡作用，亦可對多條凋亡途徑同時產(chǎn)生作用。黃芪甲苷既可保護線粒體，穩(wěn)定線粒體膜電位［18］又能下調(diào)阿霉素心肌損傷大鼠心肌組織死亡結(jié)構域相關蛋白（Daxx）的表達［33］。袁錦可等［34-36］分別通過臨床實驗和動物及H9C2心肌細胞實驗，發(fā)現(xiàn)在西藥常規(guī)治療基礎上輔以益氣溫陽，活血通絡，利水消腫的芪藶強心膠囊（由黃芪、人參、附子、丹參、葶藶子、澤瀉、玉竹、桂枝、紅花、香加皮、陳皮等組成），可使左室射血分數(shù)增加、心室容積下降、6 min步行時間延長，血漿NT-pro BNP水平下降，明顯改善心功能，其機制可能為通過Fas/Fasl介導的死亡受體途徑和Bax/Bcl-2介導的線粒體途徑雙路徑共同抑制了心肌細胞凋亡。

4　結(jié)　語

綜上所述，在DCM心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中，可明確存在心肌細胞的凋亡。許多觸發(fā)因素可經(jīng)線粒體或死亡受體途徑誘導心肌細胞凋亡發(fā)生，成為擴張型心肌病的重要發(fā)病機制之一。中醫(yī)藥在這方面的研究方興未艾，無論實驗研究還是臨床觀察，均發(fā)現(xiàn)許多方藥如黃芪及其注射液、川芎嗪、牛磺酸、參芪強心口服液、益氣強心飲等可通過上調(diào)凋亡抑制基因蛋白表達、下調(diào)凋亡刺激基因蛋白表達等機制對心肌細胞起保護作用。但大部分抑制細胞凋亡的中藥有效成分尚未分離、鑒定，仍不能詳盡說明復方的復雜作用機制。因此，筆者認為今后尚需加強中藥有效成分的提取和鑒定，并開展大樣本臨床實驗研究，進一步探索中醫(yī)藥干預本病的作用機制。對這一課題的深入研究可以更好地保護心肌，提高心功能，改善心室重構，減少DCM患者發(fā)病率和病死率，延緩病情進展，改善心力衰竭患者預后，對心血管疾病的防治產(chǎn)生深遠意義。

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