丹參酮ⅡA對(duì)病毒性心肌炎小鼠血清炎性因子水平的影響*

王德坤　魏漢維　彭　戩（湖北省武漢市東湖醫(yī)院，湖北 武漢 430074）

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丹參酮ⅡA對(duì)病毒性心肌炎小鼠血清炎性因子水平的影響*

王德坤魏漢維彭戩
（湖北省武漢市東湖醫(yī)院，湖北 武漢 430074）

目的 觀察丹參酮ⅡA對(duì)病毒性心肌炎小鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）水平的影響。方法 80只雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（對(duì)照組）20例、病毒性心肌炎模型組（模型組）30例、丹參酮ⅡA治療組（治療組）30例。模型組、治療組腹腔接種柯薩奇病毒B3（CVB3）建立病毒性心肌炎模型，對(duì)照組腹腔注射不含病毒的 Eagle's液。治療組于病毒接種0.5 h后腹腔注射丹參酮ⅡA注射液，連續(xù)14 d。觀察記錄小鼠一般情況、記錄死亡數(shù)，計(jì)算小鼠生存率；取血測(cè)定小鼠血清IL-6、TNF-α水平；取心臟，計(jì)算心臟指數(shù)，HE染色，計(jì)算病理評(píng)分。結(jié)果 與對(duì)照組小鼠比較，模型組小鼠血清IL-6和TNF-α水平、心臟指數(shù)、心臟病理評(píng)分均升高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組小鼠心臟指數(shù)、TNF-α、IL-6水平、心臟病理評(píng)分均降低（P＜0.05）。結(jié)論 丹參酮ⅡA可通過(guò)降低TNF-α、IL-6發(fā)揮減輕心肌損傷、治療病毒性心肌炎作用。

病毒性心肌炎丹參酮ⅡA腫瘤壞死因子-α白介素-6

【Abstract】Objective：To study the effect of sodium tanshinoneⅡA sulfonate on tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukine-6（IL-6）in mice with coxsackie B3 viral myocarditis.Methods：Eighty male BALB/c mice were randomly divided into three groups：the control group（n=20），viral myocarditis model group（n=30）and sodium tanshinoneⅡA sulfonate-treated group（n=30）.The first two groups were intraperitoneally inoculated with CVB3 to induce myocarditis，the control group with virus-free Eagle′s medium instead.Sodium tanshinoneⅡA sulfonate-treated group was given andrographis injection through intraperitoneal injection 0.5 hours after injecting virus every day for 14 days.The control group and myocarditis group used normal saline instead.The general state of the mice was observed；deaths were recorded and the survival rate of mice was calculated；the content of TNF-α and IL-6 was tested.Hearts were taken；the cardiac index was calculated；HE staining was adopted；the pathological integral was calculated.Results：Compared with the control group，cardiac index，TNF-α and IL-6 level and the pathological integral in the model group increased（P＜0.05）；compared with the model group，cardiac index，TNF-α and IL-6 level and the pathological integral in sodium tanshinoneⅡA sulfonate-treated group were decreased（P＜0.05）.Conclusion：Sodium tanshinoneⅡA sulfonate can decrease TNF-α and IL-6 serum level of mice and has obvious effects on prevention and treatment.

【Key words】Viral Myocarditis；Sodium tanshinoneⅡA sulfonate；TNF-α；IL-6

病毒性心肌炎（VMC）是心血管常見(jiàn)的疾病之一，腸道病毒尤其是柯薩奇B3病毒（CVB3）是引起VMC的最常見(jiàn)原因［1］。嚴(yán)重者可導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)異常，伴發(fā)心功能不全、休克等嚴(yán)重并發(fā)癥［2］，甚至導(dǎo)致死亡，如何有效治療VMC已經(jīng)成為當(dāng)前研究的重要內(nèi)容。丹參酮ⅡA磺酸鈉（STS）是從天然植物丹參中提取的水溶性物質(zhì)，有研究表明，STS有消炎抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤及抗氧化的作用［3］。已有研究表明丹參對(duì)病毒性心肌炎也有治療作用［4］，但該藥的作用機(jī)制目前還不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察STS對(duì)病毒性心肌炎小鼠血清炎性因子水平的影響，探討其治療病毒性心肌炎的具體機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物動(dòng)物健康雄性BALB/c小鼠購(gòu)自蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［合格證號(hào)SCXK（蘇）2008-0005］，4周齡，體質(zhì)量13～16 g，共80只。

1.2試藥與儀器CVB3 Nancy株購(gòu)自武漢大學(xué)典藏中心病毒原液有效價(jià)為102TCID 50/0.1 mL。STS（上海第一生化藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20026249）。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒，白細(xì)胞介素-6（IL-6）試劑盒由上海科敏生物科技公司提供。

1.3造模與給藥將小鼠隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組（對(duì)照組）20例、病毒性心肌炎模型組（模型組）30例和丹參酮ⅡA磺酸鈉治療組（治療組）30例。對(duì)照組給予不含病毒的Eagle's液0.1 mL腹腔注射。模型組和治療組給予同體積的CVB3濃度為102TCID 50/0.1 mL的病毒液腹腔注射。于病毒接種0.5 h后治療組腹腔注射STS 0.1 mL/只，每日1次，連續(xù)14 d。對(duì)照組及模型組注射同體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.4標(biāo)本采集與檢測(cè)1）小鼠一般情況：每天觀察小鼠生命體征、飲食及活動(dòng)情況等，記錄存活率。2）心臟指數(shù)：接種病毒2周處死小鼠開(kāi)胸取出心臟，用濾紙吸干心臟表面血液后稱質(zhì)量，計(jì)算心臟指數(shù)（心質(zhì)量/體質(zhì)量）。3）血清炎癥因子水平測(cè)定：小鼠接種病毒2周，摘眼球取血，離心10 min（4℃，3000 r/min），取上清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清TNF-α及IL-6水平。4）心肌組織病理學(xué)觀察：小鼠心肌組織依次給予10%甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，置光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。病理積分計(jì)算，無(wú)病變計(jì)0分，病變面積＜25%計(jì)1分，病變面積25%～50%計(jì)2分，病變面積50%～75%計(jì)3分，病變面積＞75%計(jì)4分。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組小鼠一般情況對(duì)照組小鼠活動(dòng)、飲食等一般狀況良好，皮毛光滑，14 d未死亡，存活率100%。模型組小鼠2 d出現(xiàn)活動(dòng)減少，飲食下降，皮毛無(wú)光澤，蜷縮等癥狀，4 d開(kāi)始出現(xiàn)死亡，7～10 d達(dá)到死亡高峰，14 d共死亡9只，存活率為70.00%。治療組小鼠臨床癥狀比模型組小鼠輕，5 d開(kāi)始出現(xiàn)死亡，14 d共死亡4只，存活率為86.67%。各組存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2各組心臟指數(shù)及心肌病理光鏡觀察結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。與對(duì)照組比較，模型組和治療組小鼠心臟指數(shù)均明顯上升（P＜0.05）；治療組心臟指數(shù)明顯低于模型組（P＜0.05）。光鏡下見(jiàn)對(duì)照組心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維排列整齊，橫紋清晰，間質(zhì)無(wú)充血水腫；模型組心外膜充血水腫，心肌細(xì)胞周?chē)醒装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞，鄰近心肌細(xì)胞出現(xiàn)玻璃樣或空泡，肌纖維排列紊亂、出現(xiàn)腫脹、斷裂；治療組小鼠心肌組織病理學(xué)改變較模型組明顯減輕。

表1　各組小鼠心臟指數(shù)及炎癥病理積分比較（±s）

表1　各組小鼠心臟指數(shù)及炎癥病理積分比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，△P＜0.05。下同。

組別　n　心臟指數(shù)　病理評(píng)分對(duì)照組　20　4.11±0.07　0模型組　30　4.86±0.15△　2.82±0.41△治療組　30　4.43±.011*△　1.24±.032*△

圖1　小鼠心肌組織病理切片（HE染色，400倍）

2.3各組小鼠血清炎性因子水平比較見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，模型組和治療組的血清IL-6及TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，治療組血清IL-6、TNF-α水平降低（P＜0.05）。

表2　各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表2　各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

組別　n　IL-6　TNF-α對(duì)照組　20　10.46±2.48　82.72±12.46模型組　30　29.51±4.23△　176.51±41.57△治療組　30　20.11±4.12*△　138.62±30.81*△

3　討　論

VMC最具特征性的病理特征是心肌細(xì)胞的壞死以及心肌炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，現(xiàn)認(rèn)為其主要的發(fā)病機(jī)制是病毒的直接損害和機(jī)體的炎癥免疫損傷［5］。TNF-α是機(jī)體炎性反應(yīng)與免疫系統(tǒng)重要調(diào)節(jié)因子，已有研究表明CVB3所致心肌的心肌炎癥病變程度與TNF-α的水平有密切的相關(guān)性，TNF-α表達(dá)水平上升可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的壞死和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，使心肌組織的炎性反應(yīng)加重，此外，持續(xù)高水平的TNF-α可改變肌膜蛋白，導(dǎo)致心肌細(xì)胞被破壞從而損傷心?。?］。IL-6是由單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞（Th2）產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子，可介導(dǎo)細(xì)胞毒性損傷［5］。有研究［5，7-8］發(fā)現(xiàn)VMC患者血清IL-6和TNF-α水平明顯升高，提示炎癥反應(yīng)的過(guò)度增強(qiáng)，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡，同時(shí)IL-6和TNF-α二者具有協(xié)同作用，進(jìn)一步加重心肌細(xì)胞的炎性損傷和壞死。

目前臨床上對(duì)于VMC的治療主要以抗炎、心肌保護(hù)等對(duì)癥治療為主，療效欠佳，有報(bào)道指出中藥丹參在病毒性心肌炎的治療有一定優(yōu)勢(shì)，可從多途徑多靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用，從而改善心肌缺血［4］，但該藥的作用機(jī)制目前還不清楚。《吳普本草》有記載丹參味辛、性涼，具有活血化瘀、理氣止痛、涼血消癰及活血通經(jīng)之效，被廣泛用于臨床心腦血管疾病的治療［9］。丹參酮ⅡA是丹參的有效成分，有消炎抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤及抗氧化等作用，可減輕巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子NO、TNF-α和IL-6的表達(dá)，阻礙NF-κB與DNA相結(jié)合，抑制NF-κB下游基因的轉(zhuǎn)錄［10-13］。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA對(duì)細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，能明顯抑制病毒的繁殖，具有直接殺滅病毒的作用，隨著其藥物濃度的提高，病毒抑制率明顯升高［14-15］。

本研究采用丹參的主要成分丹參酮ⅡA對(duì)VMC模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VMC小鼠的TNF-α、IL-6水平較對(duì)照組有顯著性升高（P＜0.05），給予丹參酮ⅡA干預(yù)后其炎性因子TNF-α和IL-6水平較模型組明顯降低 （P＜0.05），提示丹參酮ⅡA可降低VMC小鼠的炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步觀察小鼠的形態(tài)學(xué)變化，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，模型組小鼠心臟指數(shù)明顯上升、心肌出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變（P＜0.05），丹參酮ⅡA干預(yù)后小鼠心臟指數(shù)明顯低于模型組（P＜0.05），小鼠心肌組織病理改變較模型組減輕，其存活率（86.67%）較模型組（70.00%）有明顯的提高（P＜0.05）。研究結(jié)果表明，丹參酮ⅡA能減輕VMC心肌損傷，提高小鼠生存率，對(duì)病毒性心肌炎有治療作用，其機(jī)制可能與丹參酮ⅡA可下調(diào)TNF-α、IL-6的表達(dá)有關(guān)。

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Effect of Sodium TanshinoneⅡA Sulfonate on TNF-α and IL-6 in Mice with Coxsackie B3 Viral Myocarditis

WANG Dekun，WEI Hanwei，PENG Jian.Cardiovascular Internal Medicine Department of Donghu Hospital，Hubei，Wuhan 430074，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）05-0766-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.005

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30500657）；湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（211CDB196）

2016-01-07）