英夫利昔單抗對(duì)高脂飼養(yǎng)大鼠腸黏膜屏障及胰島素抵抗的影響

楊　峰　楊高中　夏扣平　張小春

(九江市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江西　九江　332000)

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英夫利昔單抗對(duì)高脂飼養(yǎng)大鼠腸黏膜屏障及胰島素抵抗的影響

楊峰楊高中夏扣平1張小春

(九江市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江西九江332000)

摘要〔〕目的探討英夫利昔單抗對(duì)高脂飼養(yǎng)大鼠腸黏膜功能及胰島素抵抗(IR)的影響。方法30只大鼠隨機(jī)分為3組：正常組，模型組，英夫利昔單抗組。通過高脂飼料喂養(yǎng)大鼠造模，6 w后IR大鼠造模成功。模型組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)6 w，治療組在高脂飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上分別于0，2，4 w給予英夫利昔單抗肌注(3 mg/kg)1次。于6 w處死大鼠，頸總動(dòng)脈取血并取小腸標(biāo)本。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)；ELISA法檢測(cè)大鼠血清腫瘤壞死因子(TNF)-α及白細(xì)胞介素(IL)-10含量；比色法檢測(cè)血清二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸含量；HE染色檢測(cè)大鼠腸黏膜形態(tài)；Western印跡檢測(cè)大鼠小腸組織核因子(NF)-κB p65、pp65、IκBα、p-IκBα、閉合蛋白(ZO-1)、咬合蛋白的表達(dá)。結(jié)果與正常組比較，模型組IR大鼠血清中FPG、FINS水平顯著上升，胰島素敏感指數(shù)(ISI)下降，大鼠小腸黏膜損害程度較深，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較多，血清中DAO、D-乳酸及TNF-α含量上升，IL-10含量下降，NF-κB p65及IκBα磷酸化水平升高，ZO-1及咬合蛋白表達(dá)量下降；英夫利昔單抗可顯著抑制此變化。結(jié)論英夫利昔單抗可以通過NF-κB信號(hào)通路來調(diào)節(jié)TNF-α等相關(guān)炎癥因子含量，并間接影響TNF-α誘導(dǎo)的緊密連接蛋白的表達(dá)，從而改善大鼠腸黏膜功能，治療大鼠IR。

關(guān)鍵詞〔〕英夫利昔單抗；胰島素抵抗；腸黏膜屏障；腫瘤壞死因子-α；核因子-κB；信號(hào)通路

1江西省永修縣人民醫(yī)院內(nèi)3科

第一作者：楊峰(1974-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事消化系統(tǒng)疾病臨床研究。

胰島素抵抗(IR)是多種代謝性疾病的始動(dòng)因素和致病基礎(chǔ)。隨著現(xiàn)代生活方式的改變，各種與IR相關(guān)的代謝性疾病，如肥胖、糖尿病、高血壓及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等發(fā)病率逐年上升〔1～3〕。IR是一個(gè)慢性非特異性炎癥持續(xù)過程〔4〕。其病理過程為：長(zhǎng)期高脂飲食，引起腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，增加了腸道的通透性，導(dǎo)致腸道屏障功能受損，腸道細(xì)菌所產(chǎn)生的內(nèi)毒素(LPS)大量進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)，形成代謝性內(nèi)毒素血癥；從而刺激核因子(NF)-κB信號(hào)通路〔5〕釋放炎性因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6〔6〕等，導(dǎo)致IR；而炎性因子進(jìn)一步抑制腸道上皮緊密連接蛋白的表達(dá)〔7〕，加重腸道屏障功能損傷。說明腸道屏障功能障礙為發(fā)生IR的啟動(dòng)因素，其中TNF-α高度表達(dá)是發(fā)生IR的中心環(huán)節(jié)。英夫利昔單抗目前廣泛應(yīng)用于炎癥性腸病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑病及銀屑病關(guān)節(jié)炎等疾病的治療，并已取得良好的療效〔8～11〕，作為一種新型生物制劑，與體內(nèi)多種形式的TNF-α有較強(qiáng)結(jié)合能力，降低TNF-α生物活性，從而阻斷炎癥反應(yīng)〔12〕，并抑制TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的降低〔13〕，降低腸上皮通透性，從而保護(hù)腸黏膜屏障功能〔14〕。高脂飼養(yǎng)Swiss小鼠，可產(chǎn)生IR及糖耐受，短期給予英夫利昔單抗可改善癥狀〔15〕。英夫利昔單抗可改善強(qiáng)直性脊柱炎病人IR〔11〕。自發(fā)性高血壓大鼠主動(dòng)脈中胰島素活性下降，TNF-α活性提高，給予一定劑量英夫利昔，可抑制Iκβ磷酸化，改善此性狀〔16〕?；谝陨侠碚摫尘埃覀兊贸黾僭O(shè)，英夫利昔單抗可以通過NF-κB信號(hào)通路降低體內(nèi)TNF-α水平及生物活性，改善高脂大鼠腸黏膜障礙從而治療IR，并對(duì)此進(jìn)行探討。

1材料和方法

1.1動(dòng)物5～6周齡，160～180 g的健康成年SD 雄性大鼠30只，購于南昌大學(xué)動(dòng)物部，室內(nèi)溫度控制在(23±2)℃，大鼠自由飲食和攝水。

1.2藥物及飼料英夫利昔單抗(西安楊森制藥有限公司)；普通飼料(100 g)：豆粕25 g、黃豆5 g、玉米30 g、酵母2.5 g、鼓子10 g、魚粉10 g、骨粉2.5 g、高粱5 g、標(biāo)準(zhǔn)粉8.5 g、豆油1 g、鹽0.5 g。高脂飼料(100 g)：基礎(chǔ)飼料44 g、雞蛋20 g、奶粉15 g、豬油15 g、鮮黃豆芽5 g、魚肝油1 g。

1.3試劑 大鼠血清TNF-α檢測(cè)試劑盒(Bender MedSystems公司)；BCA法蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；β-actin(碧云天生物技術(shù)研究所)；閉合蛋白(ZO-1)蛋白抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；NF-κB p65，pp65，IκBα，p-IκBα蛋白抗體(Epitmics公司)；咬合蛋白抗體(Occludin,Abcam公司)；二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4儀器全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó) ROCHE MODULAR SWA 公司 )；LDZ5-2 型臺(tái)式低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心廠)；ZT-12P 生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)；電泳儀，轉(zhuǎn)印電泳儀，ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；酶標(biāo)儀(瑞士TECAN集團(tuán)公司)；-80℃冰箱(美國(guó)Thermo公司)。

1.5大鼠IR模型的建立大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，給予高脂飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)6 w后，尾靜脈取血測(cè)空腹血糖(FPG)及胰島素(FINS)，并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)，ISI<-4.11±0.32即IR大鼠造模成功。

1.6動(dòng)物分組及干預(yù)方法正常組：一直給予普通飼料喂養(yǎng)；將造模成功的20只大鼠隨機(jī)分為：模型組：繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)6 w；英夫利昔單抗組：在高脂飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上分別于0，2，4 w給予英夫利昔單抗肌注(3 mg/kg)1次。

1.7標(biāo)本采集各組大鼠禁食12 h，麻醉，經(jīng)頸總動(dòng)脈采血，并處死大鼠，取小腸標(biāo)本，標(biāo)本皆放于-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.8血清葡萄糖、胰島素及ISI的測(cè)定血清葡萄糖、胰島素由我院檢驗(yàn)科生化研究室采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，并計(jì)算ISI。

1.9血清TNF-α及IL-10含量的測(cè)定采用雙抗夾心ELISA法。分別按試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。

1.10血清DAO及D-乳酸含量的測(cè)定采用改良分光光度法測(cè)定。分別按試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。

1.11HE染色小腸組織標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛浸泡，石蠟包埋，切片，烘干。二甲苯脫蠟，無水、95%、80%乙醇脫水，流水沖洗，蘇木素浸泡，鹽酸酒精浸泡，流水沖洗至返藍(lán)，伊紅復(fù)染，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，吹干后中性樹膠封片，后鏡檢。

1.12Western印跡取適量小腸組織標(biāo)本，加入RIPA裂解液，裂解，離心，收獲蛋白。根據(jù)BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，濕法磚膜。一抗孵育，4℃過夜；漂洗后，二抗室溫孵育1～2 h。漂洗，滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件對(duì)各抗體條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、One-Way ANOVA。

2結(jié)果

2.1英夫利昔單抗對(duì)高脂飼養(yǎng)大鼠FPG，F(xiàn)INS及ISI的影響與正常組比較，模型組中大鼠FINS，F(xiàn)INS水平上升，ISI下降(P<0.01)；與模型組比較，英夫利昔單抗組能降低IR大鼠FPG、FINS水平，并提高ISI(P<0.05)。見表1。

表1　英夫利昔單抗對(duì)高脂飼養(yǎng)大鼠FPG、

與正常組比較：1)P<0.01;與模型組比較：2)P<0.01，下表同

2.2HE染色檢測(cè)英夫利昔單抗對(duì)高脂飼養(yǎng)大鼠腸黏膜形態(tài)的影響正常組小腸黏膜各層結(jié)構(gòu)完整連續(xù)，極少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組中黏膜糜爛，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；英夫利昔單抗治療組小腸黏膜損害程度較輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為清楚。見圖1。

圖1　英夫利昔單抗對(duì)高脂飼養(yǎng)大鼠腸黏膜形態(tài)的影響(×400)

2.3英夫利昔單抗對(duì)高脂飼養(yǎng)大鼠血清TNF-α及IL-10水平的影響與正常組比較，模型組大鼠血清中TNF-α水平上升，IL-10水平下降(P<0.01)；與模型組比較，英夫利昔單抗能降低IR大鼠血清中TNF-α含量并提高IL-10水平(P<0.05)。見表2。

表2　英夫利昔單抗對(duì)高脂飼養(yǎng)大鼠血清TNF-α、

2.4英夫利昔單抗對(duì)高脂飼養(yǎng)大鼠腸黏膜通透性的影響與正常組比較，模型組中大鼠血清DAO及D-乳酸水平上升(P<0.01)；與模型組比較，英夫利昔單抗能降低IR大鼠血清中DAO及D-乳酸水平(P<0.05)。見表3。

表3　英夫利昔單抗對(duì)高脂飼養(yǎng)

2.5英夫利昔對(duì)高脂飼養(yǎng)大鼠腸上皮緊密連接蛋白含量的影響與正常組比較，模型組IR大鼠小腸組織中ZO-1和Occludin表達(dá)量顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，英夫利昔單抗能提高IR大鼠小腸組織中ZO-1和Occludin表達(dá)(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2　英夫利昔單拉對(duì)高脂飼養(yǎng)大鼠腸上皮緊密連接蛋白含量的影響

組別ZO-1/GADPHOccludin/GADPH正常組2.38±0.191.27±0.05模型組0.19±0.001)0.31±0.041)英夫利昔單抗組1.16±0.172)1.07±0.102)

2.6英夫利昔對(duì)高脂飼養(yǎng)大鼠NF-κB信號(hào)通路的影響與正常組比較，模型組IR大鼠小腸組織NF-κB p65和IκBα磷酸化水平上升(P<0.01)；與模型組比較，英夫利昔單抗能抑制IR大鼠小腸組織中NF-κB p65和IκBα磷酸化水平(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3　英夫利昔單抗對(duì)高脂飼養(yǎng)大鼠NF-κB信號(hào)通路的影響

組別p-IκBα/IκBαpp65/p65正常組0.35±0.020.26±0.05模型組1.38±0.151)0.89±0.031)英夫利昔單抗組0.79±0.082)0.45±0.052)

3討論

IR是指外周圍靶器官對(duì)胰島素敏感度及反應(yīng)性下降的一種病理狀態(tài)，主要表現(xiàn)為糖脂代謝異常等〔2,3〕。我們實(shí)驗(yàn)室用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠在6 w出現(xiàn)了FPG、FINS上升癥狀，胰島素敏感指數(shù)降低，顯示了IR癥狀，與El等〔17〕的觀點(diǎn)肥胖導(dǎo)致人體產(chǎn)生IR一致。英夫利昔單抗可改善強(qiáng)直性脊柱炎病人IR〔11〕。而本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)英夫利昔單抗能降低IR。

TNF-α主要由活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)炎癥部位白細(xì)胞的聚集和活化，多種炎癥介質(zhì)。TNF-α在肥胖病人和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的腸道組織中含量上升并與胰島素敏感性下降有關(guān)〔18,19〕。TNF-α高度表達(dá)是發(fā)生IR的中心環(huán)節(jié)，因此，抑制TNF-α的顯著表達(dá)可治療IR?？筎NF-α可通過胰島素信號(hào)通路治療高IR類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者〔20〕。高脂飼養(yǎng)的Wistar大鼠給予英夫利昔10 d，可抑制肝組織中促炎因子TNF-α、IL-1β含量〔12〕。Olsen等〔21,22〕利用英夫利昔單抗治療潰瘍性結(jié)腸炎患者，結(jié)果顯示治療后腸黏膜中TNF-α水平顯著降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)IR抵抗的大鼠，血清中TNF-α含量顯著上升，給予英夫利昔單抗后，可顯著降低TNF-α含量。IL-10是Tp細(xì)胞分泌產(chǎn)生的抗炎細(xì)胞因子，可直接抑制Th1細(xì)胞，減少促炎因子的產(chǎn)生。Menassa等〔23〕的研究顯示，實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜中IL-10水平顯著低于正常組，同時(shí)小鼠IL-10基因沉默也可誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的產(chǎn)生，經(jīng)治療后，腸道炎癥較模型組有所緩解。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)IR大鼠，血清中IL-10含量顯著下降，給予英夫利昔單抗后，可提高IL-10含量。

高脂飼養(yǎng)大鼠，會(huì)使大鼠腸道功能受損，腸道屏障通透性升高，使腸道內(nèi)有害物質(zhì)如細(xì)菌或毒素通過腸黏膜進(jìn)入體內(nèi)，產(chǎn)生炎癥，導(dǎo)致腸源性內(nèi)毒素血癥，影響胰島素信號(hào)通路，產(chǎn)生IR。英夫利昔單抗可抑制克羅恩病人血清中TNF-α表達(dá)及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)〔9〕并恢復(fù)腸黏膜形態(tài)〔8,10〕。英夫利昔單抗可抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠黏膜損傷〔24〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腸黏膜糜爛，黏膜下層水腫，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。英夫利昔能改善此癥狀。

DAO主要位于小腸黏膜，在血漿中含量極低，當(dāng)腸黏膜通透性增加時(shí)，DAO進(jìn)入腸細(xì)胞間使血液中DAO水平升高，故能反映腸黏膜通透性變化。D-乳酸是腸道固有細(xì)菌的代謝終產(chǎn)物，生理狀態(tài)下血中D-乳酸含量很低，當(dāng)各種因素誘導(dǎo)腸黏膜損傷，腸上皮細(xì)胞間隙連接破壞，腸道屏障通透性增高，腸腔內(nèi)的D-乳酸通過受損腸黏膜進(jìn)入血循環(huán)，導(dǎo)致其含量上升，故D-乳酸水平也可反映腸黏膜損害程度和通透性變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)IR抵抗的大鼠，血清中DAO和D-乳酸水平顯著上升，給予英夫利昔單抗后，可顯著降低DAO和D-乳酸含量。

腸黏膜上皮屏障是由完整的腸上皮細(xì)胞和相鄰腸上皮細(xì)胞之間的連接構(gòu)成。上皮細(xì)胞間通過形成緊密連接蛋白網(wǎng)絡(luò)復(fù)合物，防止腸道內(nèi)有害物質(zhì)對(duì)腸腔外組織器官侵犯。其中緊密連接(TJ)是決定腸黏膜通透性最重要的連接方式，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)緊密連接斷裂或緊密連接蛋白減少，會(huì)使腸上皮細(xì)胞間隙增大，腸黏膜通透性增加〔25,26〕。ZO-1蛋白屬于膜結(jié)合鳥苷酸激酶家族，為跨膜蛋白，起中介作用，并且還可與其他緊密連接蛋白相連。TNF-α與結(jié)腸癌上皮細(xì)胞株(CaCo-2細(xì)胞株)共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)腸道屏障功能降低，ZO-1 mRNA和蛋白表達(dá)皆下降〔27〕。咬合蛋白也是構(gòu)成緊密連接成分之一，能使細(xì)胞以拉鏈?zhǔn)骄o密結(jié)合，并參與緊密連接形成的信號(hào)調(diào)節(jié)。缺乏完整結(jié)構(gòu)的咬合蛋白片段轉(zhuǎn)入缺乏TJ的L-成纖維細(xì)胞未能改善細(xì)胞屏障功能，當(dāng)轉(zhuǎn)入咬合蛋白完整片段后，相鄰細(xì)胞之間可以形成TJ樣結(jié)構(gòu)〔28〕。Costantini等〔29〕，分別在燒傷引起的腸黏膜屏障損害及感染性腸病中觀察到咬合蛋白和ZO-1的表達(dá)顯著降低。TNFR-1(-/-)小鼠或英夫利昔治療組小鼠可改善小鼠的腸黏膜障礙功能，是通過提高腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的〔13〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)IR抵抗的大鼠腸黏膜形態(tài)受損，咬合蛋白和ZO-1表達(dá)下降，給予英夫利昔后，可顯著提高咬合蛋白和ZO-1的表達(dá)量。

NF-κB通路是體內(nèi)主要的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與IR的發(fā)生有密切的聯(lián)系，已成為研究改善IR的新靶點(diǎn)〔5,31〕。在細(xì)胞中最常見的作用形式為 p65 及 p50 組成的二聚體，未受刺激時(shí)與 IκB 結(jié)合，當(dāng)受到刺激時(shí)，IκB被降解，磷酸化，從而釋放NF-κB p65，使之恢復(fù)轉(zhuǎn)錄活性并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。Vona-Davis〔32〕等發(fā)現(xiàn)NF-κB的拮抗劑可以顯著抑制組織病理損傷及大量炎癥因子的產(chǎn)生。IR/糖尿病小鼠暴露于PM2.5空氣中4～5 w，腦注射IKKβ抑制劑IMD-0354可改善小鼠胰島素敏感度，抑制TNFα含量〔33〕。英夫利昔單抗治療12個(gè)克羅恩病人，發(fā)現(xiàn)腸黏膜中炎癥細(xì)胞數(shù)目減少，TNF-α含量降低，是通過NF-κB活性實(shí)現(xiàn)的〔14〕。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)IR大鼠腸組織中NF-κB p65及IκBα磷酸化程度上升，英夫利昔單抗可顯著抑制NF-κB信號(hào)通路的活化。Al-Sadi等〔34〕使用NF-κB抑制劑或NF-κB p65 siRNA基因沉默技術(shù)降低炎癥因子引起的緊密連接破壞。說明英夫利昔單抗可以通過NF-κB信號(hào)通路來調(diào)節(jié)TNF-α相關(guān)炎癥因子含量，并間接影響TNF-α誘導(dǎo)的緊密連接蛋白的表達(dá)，從而改善大鼠腸黏膜功能進(jìn)而治療IR大鼠。

雖然本實(shí)驗(yàn)得到英夫利昔單抗可通過NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)TNF-α相關(guān)炎癥因子含量，并間接影響TNF-α誘導(dǎo)的緊密連接蛋白的表達(dá)，并改善大鼠腸黏膜功能從而治療大鼠IR。但是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)還是有所不足。首先是本實(shí)驗(yàn)是從蛋白水平探討英夫利昔單抗對(duì)于NF-κB信號(hào)通路的影響，沒有涉及基因水平，mRNA的合成和蛋白質(zhì)的合成可能不在同一個(gè)水平上，會(huì)產(chǎn)生誤差，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。且本實(shí)驗(yàn)缺少NF-κB信號(hào)通路抑制劑給藥組，來進(jìn)一步更加精確的得到結(jié)論。

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〔2014-09-16修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：江西省衛(wèi)生計(jì)生委科技計(jì)劃項(xiàng)目(20141725)

中圖分類號(hào)〔〕R589〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)21-6045-05；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.018