胃泌素釋放肽受體拮抗劑RC-3095對大鼠肺組織纖維化的干預(yù)作用

伍素霞　惠復(fù)興

(張家港錦豐人民醫(yī)院，江蘇　張家港　215600)

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胃泌素釋放肽受體拮抗劑RC-3095對大鼠肺組織纖維化的干預(yù)作用

伍素霞惠復(fù)興1

(張家港錦豐人民醫(yī)院，江蘇張家港215600)

摘要〔〕目的研究胃泌素釋放肽(GRP)受體(R)拮抗劑RC-3095對大鼠肺組織纖維化的干預(yù)作用。方法構(gòu)建肺組織纖維化大鼠模型，將大鼠隨機分為正常對照組(NC組)、模型組(MO組)、RC-3095處理組(RC組，20 μg/d)，檢測肺濕重、肺干重、肺系數(shù)，HE染色觀察肺組織病理變化，酶聯(lián)免疫吸附法檢測肺組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量，Western印跡檢測GRP、GRPR和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β1蛋白表達情況，免疫共沉淀檢測GRP和GRPR相互作用情況。結(jié)果成功構(gòu)建肺組織纖維化大鼠模型，MO組肺組織結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡間隔增厚，存在大量炎性細胞浸潤；RC組肺組織結(jié)構(gòu)較為完整，纖維化程度降低。同時MO組肺組織濕重、干重和肺系數(shù)均高于NC組，RC組肺組織濕重、干重和肺系數(shù)均高于NC組但是低于MO組(P<0.05)。MO組中Ⅰ型膠原含量高于NC組，Ⅲ型膠原含量低于NC組。RC組中Ⅰ型膠原含量低于MO組，Ⅲ型膠原含量高于MO組(P<0.05)。RC-3095處理可有效抑制GRPR和TGFβ1蛋白水平，同時抑制GRPR和GPR的結(jié)合。結(jié)論RC-3095可以通過調(diào)節(jié)GRP和GRPR的結(jié)合能力及TGFβ1的蛋白水平有效地抑制肺部纖維化。

關(guān)鍵詞〔〕胃泌素釋放肽受體拮抗劑；RC-3095；肺組織纖維化

1無錫市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科

第一作者：伍素霞(1966-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事呼吸內(nèi)科疾病研究。

長期吸入含結(jié)晶型游離二氧化硅(SiO2)的粉塵可以導(dǎo)致嚴重的肺部彌漫性纖維化，即矽肺〔1〕。肺組織纖維化的發(fā)病機制往往是由于肺部組織中膠原代謝失調(diào)造成的〔2〕。目前對肺組織纖維化的治療仍需要研發(fā)有效的治療藥物。胃泌素釋放肽(GRP)是哺乳動物體內(nèi)蛙皮素類似物之一，GRP通過與GRP受體(GRPR)結(jié)合調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、炎癥反應(yīng)、癌癥發(fā)生等多種生理病理過程〔3〕。RC-3095是GRPR拮抗劑之一，本文主要研究RC-3095對大鼠肺組織纖維化的干預(yù)作用及臨床應(yīng)用價值。

1材料與方法

1.1動物分組與模型建立30只健康成年大鼠，由本院動物中心提供，本實驗通過本院倫理協(xié)會同意。平均體重(258±32.15)g，隨機分為正常對照組(NC組)、模型組(MO組)、RC-3095處理組(RC組)。大鼠經(jīng)0.4%戊巴比妥麻醉后，采用非暴露式氣管內(nèi)注入法，注入1 ml SiO2混懸液(40 mg/ml)，用手輕拍大鼠兩側(cè)胸壁，使粉塵分散至全肺。NC組注入同體積生理鹽水。建立矽肺模型后，RC每日腹腔注射20 μg/d RC-3095，NC組和MO組注射等體積生理鹽水。所有實驗動物均SPF級動物房中分籠飼養(yǎng)，飲水飼料籠具和所有操作用品均滅菌處理后使用。

1.2肺組織病理分析培養(yǎng)4 w后處死大鼠，收集肺部組織用于檢測肺濕、干重、肺系數(shù)及肺組織病理學(xué)分析。肺濕、干重的測定方法：剪下肺葉，用濾紙吸干，稱濕重后置 110℃干燥箱內(nèi)烘干至恒重。肺系數(shù)按照以下公式計算：肺系數(shù)=肺濕重(mg) /體重(g)×100%。將部分左肺葉置于 4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片后行蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組化檢測。

1.3ELISA法檢測肺組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量取肺組織50 g，液氮中充分研磨后，利用上海生工生物有限公司Ⅰ型和Ⅲ型膠原ELISA試劑盒檢測，操作按照說明書進行。

1.4Western印跡檢測GRP、GRPR和TGFβ1蛋白表達情況取肺組織50 g，液氮中充分研磨后，利用美國天根公司蛋白裂解液裂解獲得蛋白樣品，利用Western免疫印跡檢測肺組織中細胞內(nèi)GRP、GRPR、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β1的蛋白表達水平。GRP、GRPR、TGFβ1抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.5免疫共沉淀檢測GRP和GRPR相互作用情況取肺組織50 g，液氮中充分研磨后，利用美國天根公司蛋白裂解液裂解獲得蛋白樣品，加入5 μl GRP抗體，4℃孵育12 h，加入蛋白A (天根公司)孵育6 h后，用蛋白裂解液洗3次，每次10 min，4℃ 5 000 r/min離心1 min，收集珠子，加入20 μl上樣緩沖液，100℃煮5 min，利用GRPR抗體(美國SANTA公司)進行Western印跡實驗。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t、χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1肺組織病理學(xué)改變NC組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)無炎性細胞浸潤，肺泡間隔無充血、水腫及增厚等現(xiàn)象；MO組肺組織結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡間隔充血水腫存在增厚現(xiàn)象，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)存在大量炎性細胞浸潤；RC組肺組織結(jié)構(gòu)較為完整，與MO組相比炎癥細胞浸潤程度較輕，肺泡間隔增厚現(xiàn)象不明顯。見圖1。MO組肺組織濕重〔(4.23±0.57)g〕、干重〔(1.73±0.46)g〕和肺系數(shù)(12.27±0.48)均明顯高于NC組〔(1.53±0.34)g、(0.73±0.12)g、(5.11±0.39)〕，RC組肺組織濕重〔(2.11±0.36)g、干重(1.22±0.27)g和肺系數(shù)(8.47±0.38)〕均高于NC組但是顯著低于MO組(P<0.05)。

圖1　各組肺組織病理學(xué)改變(HE，×20)

2.2肺組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量MO組中Ⅰ型膠原含量〔(82.28±0.36)%〕明顯高于NC組〔(32.15±2.21)%〕，RC組中Ⅰ型膠原含量〔(46.15±0.36)%〕高于NC組但明顯低于MO組。MO組中Ⅲ型膠原含量〔(14.37±0.35)%〕明顯低于NC組〔(31.63±2.37)%〕，RC組中Ⅲ型膠原含量〔(27.38±0.3)%〕明顯低于NC組但明顯高于MO組(P<0.05)。

2.3RC-3095對GRP和GRPR相互作用的影響MO組中GRP和GRPR相互作用與NC組無顯著差異。說明RC-3095降低了GRP和GRPR的結(jié)合。見圖2。

圖2　RC-3095對GRP和GRPR相互作用的影響

2.4RC-3095對GRP、GRPR和TGFβ1蛋白水平的影響RC組、NC組和MO組的GRP蛋白水平無顯著性差異，MO組GRPR蛋白水平高于NC組，RC組GRPR蛋白水平低于MO組，與NC組無顯著性差異。TGFβ1蛋白水平與之相反，MO組TGFβ1蛋白水平低于NC組，RC組TGFβ1蛋白水平高于MO組和NC。見圖3。

圖3　3組GRP、GRPR和TGFβ1蛋白水平

3討論

肺部纖維化是可由多種病因造成的共同現(xiàn)象，目前常見的導(dǎo)致肺部纖維化的原因有吸入SiO2等有毒物質(zhì)、受到放射性損傷等，肺部纖維化也是導(dǎo)致急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS)患者死亡的重要原因之一〔4，5〕。肺部纖維化后，炎癥細胞浸潤肺泡組織，纖維細胞聚集，膠原沉積使得肺泡結(jié)構(gòu)組織改變，肺間質(zhì)增寬，顯微組織和毛細血管增生，繼而無法完成正常肺功能，導(dǎo)致患者死亡〔6〕。Ⅰ型膠原纖維粗，硬度和抗牽拉能力較強，而Ⅲ型膠原纖維較細，具有較好的伸展性和彈性〔7〕，Ⅰ型膠原含量增加而Ⅲ型膠原含量降低說明肺組織纖維化程度增強。

GRP是一種重要的細胞因子，參與促進生長、調(diào)節(jié)胃腸運動和激素分泌、晝夜節(jié)律等生理過程，并且與炎癥反應(yīng)和癌癥發(fā)生發(fā)展有關(guān)〔8〕。GRP發(fā)揮作用主要通過結(jié)合其受體GRPR進行。在癌癥治療中，以GRP/GRPR為靶向可以明顯提高藥物的有效靶向傳遞，降低腫瘤耐藥和化療藥物的不良反應(yīng)，可下調(diào)生長因子的水平，抑制血管生成信號通路、調(diào)節(jié)細胞增殖與凋亡的功能〔9〕。本文說明GRPR蛋白在肺部纖維化中可能發(fā)揮著重要作用。

RC-3095是GRP/GRPR通路的拮抗劑，由于RC-3095與GRP具有類似的結(jié)合能力，因此可以拮抗GRP與GRPR的結(jié)合，目前研究表明RC-3095在多種癌癥中具有抑制細胞增殖，降低炎癥反應(yīng)的功能，如結(jié)腸癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌等，同時也有化學(xué)預(yù)防劑的功能〔10〕。本文說明RC-3095可以有效地抑制肺部纖維化。RC-3095可以有效抑制肺纖維化大鼠中GRPR蛋白表達水平，但是對GRP蛋白水平無顯著影響，此外RC3095降低了GRPR和GRP的相互作用。肺纖維化過程包括肺組織的炎性損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞及隨后伴有肺間質(zhì)細胞積聚的組織修復(fù)過程。這個過程中有多種細胞因子參與，TGFβ1是目前已知的最強的致纖維化因子〔11〕，RC-3095可以通過調(diào)節(jié)GRP和GRPR的結(jié)合能力及TGFβ1的蛋白水平抑制肺部纖維化。

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〔2014-07-06修回〕

(編輯苑云杰)

基金項目：江蘇省衛(wèi)生廳指導(dǎo)性科研課題(No.Z201310)

中圖分類號〔〕R563.9〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6039-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.015