培美曲塞與厄洛替尼聯(lián)合或序貫治療對肺腺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

張小華　陳開杰　張海偉　劉　靜　賈毅敏

(重慶市腫瘤研究所藥學部,重慶　400030)

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培美曲塞與厄洛替尼聯(lián)合或序貫治療對肺腺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

張小華陳開杰張海偉1劉靜賈毅敏

(重慶市腫瘤研究所藥學部,重慶400030)

摘要〔〕目的探討培美曲塞與厄洛替尼聯(lián)合或序貫對肺腺癌A549細胞增殖和凋亡的影響。方法以人肺腺癌 A549 細胞為研究對象，分別應用培美曲塞與厄洛替尼單藥、聯(lián)合及不同序貫方法干預72 h后，MTT法檢測細胞增殖及抑制情況，并計算聯(lián)合指數(shù)(CI)，流式細胞儀(FCM)檢測細胞周期及凋亡情況，蛋白質印跡法(Western印跡法)檢測磷酸化表皮生長因子受體(p-EGFR)及磷酸化-ATK(p-AKT)的表達情況。結果培美曲塞序貫厄洛替尼組(P-E)對A549細胞增殖的抑制率及凋亡率較高，明顯高于培美曲塞(P)和厄洛替尼(E)單藥組以及厄洛替尼聯(lián)合(E+P)或序貫培美曲塞組(E-P)(P均<0.05)。E組和E+P/E-P組的G1期細胞所占比例較對照組明顯增多(P<0.05)，P組和P-E組的S期細胞所占比例較對照組明顯增多(P均<0.05)。各藥物干預組細胞凋亡率均較對照組明顯增高，且P-E組細胞凋亡率明顯高于其他組(P均<0.05)。P-E組A549細胞p-AKT及p-EGFR的表達水平均明顯低于對照組(P均<0.05)。結論培美曲塞可有效抑制肺腺癌A549細胞的增殖作用，且與厄洛替尼序貫應用的協(xié)同效果更為明顯，其作用機制可能與p-EGFR及p-AKT信號通路相關。

關鍵詞〔〕肺腺癌；培美曲塞；厄洛替尼；序貫；聯(lián)合

1重慶市腫瘤研究所腫瘤實驗室

第一作者：張小華(1966-)，女，副主任藥師，主要從事臨床藥理學方面的研究。

肺癌具有起病隱匿的特點，絕大多數(shù)患者臨床確診時已經(jīng)處于晚期，失去最佳治療時期〔1〕?；熀捅砥どL因子受體(EGFR)已經(jīng)成為治療肺癌的主要方法，培美曲塞是一種新的化療藥物，屬于第3代化療藥物，可以抑制胸腺酸合成酶、甘氨酰胺核苷酸轉甲酰酶以及二氫葉酸還原酶來拮抗葉酸的代謝，進而使核苷酸合成受到抑制，最終起到抑制腫瘤生長的作用。厄洛替尼能抑制酪氨酸激酶，阻斷信息的轉導起到抑制腫瘤的作用〔2〕。培美曲塞與厄洛替尼聯(lián)合或序貫在臨床上被廣泛應用于治療肺癌，并取得較好的臨床療效。本研究旨在分析培美曲塞與厄洛替尼聯(lián)合或序貫治療對肺腺癌細胞株A549細胞增殖和凋亡的影響。

1材料與方法

1.1細胞野生型K-ras基因及EGFR基因突變的肺腺癌A549細胞株均來自我院，應用RPMI1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，應用胰蛋白酶進行消化傳代，取對數(shù)增長期的細胞應用于實驗。

1.2實驗試劑及藥品RPMI1640培養(yǎng)液與胎牛血清均由美國Hyclone公司提供；青霉素、鏈霉素均由山東齊魯制藥有限公司提供；厄洛替尼由美國羅氏制藥有限公司提供，以二甲基亞砜(DMSO)溶解，應用培養(yǎng)液將其稀釋到所用濃度；培美曲塞由齊魯制藥有限公司提供，以生理鹽水溶解，應用培養(yǎng)液將其稀釋到所用的濃度；MTT以及DMSO均由美國Sigma公司提供；Hoechst 33258染色劑、細胞凋亡以及細胞周期檢測試劑均由上海生物技術有限公司提供。

1.3方法

1.3.1分組所有細胞平均分為培美曲塞單藥組(P)、厄洛替尼單藥組(E)、厄洛替尼聯(lián)合培美曲塞組(E+P)、厄洛替尼序貫培美曲塞組(E-P)、培美曲塞序貫厄洛替尼組(P-E)以及非藥物干預的對照組。

1.3.2指標檢測①應用MTT法檢測培美曲塞與厄洛替尼對A549細胞增殖的影響。將對數(shù)增長期的細胞接種于96孔板上，待細胞貼壁開始生長以后將不同濃度的培美曲塞和厄洛替尼加入到孔中，每個濃度均設置6個重復的孔，將僅僅含有培養(yǎng)液、細胞以及相應濃度的DMSO孔設置為對照組，培養(yǎng)細胞72 h以后將MTT液加入到孔中，培養(yǎng)細胞4 h以后將上清液丟棄掉，加入DMSO震蕩以后應用自動酶聯(lián)免疫檢測儀檢測570 nm波長的各個孔吸光度(D)，并且計算細胞增殖抑制情況。聯(lián)合指數(shù)(CI)測定：應用Compusyn軟件計算CI值，CI值>1表示厄洛替尼和培美曲塞有拮抗作用，CI=1表示厄洛替尼和培美曲塞具有相加作用，CI值<1表示厄洛替尼和培美曲塞具有協(xié)同作用。倒置相差顯微鏡下觀察A549細胞被厄洛替尼和培美曲塞作用以后的形態(tài)。②流式細胞儀(FCM)檢測厄洛替尼和培美曲塞作用以后細胞的凋亡情況及細胞周期分布水平。③蛋白質印跡(Western印跡)法檢測厄洛替尼和培美曲塞作用以后A549細胞磷酸化EGFR(p-EGFR)及磷酸化-ATK(p-AKT)的表達情況。

1.4統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0軟件進行F檢驗、SNK法檢驗。

2結果

2.1各組肺腺癌A549細胞MTT檢測結果比較各藥物干預組細胞增殖抑制率均明顯高于對照組〔(3.42±0.34)%〕(P>0.05)，P組〔(48.73±3.92)%〕與E+P組〔(54.34±6.39)%〕細胞增殖抑制率比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；P-E組〔(66.53±6.42)%〕細胞增殖抑制率明顯高于P組、E+P組及E-P組〔(23.84±5.27)%〕，各干預組中E-P組細胞增殖抑制率最低，E組為(38.58±4.32)%(P均<0.05)。各干預組中CI值比較，P-E組CI值最低，為(0.37±0.03)；而E-P最高，為(1.97±0.21)；對照組為2.07±0.09，P組為1.07±0.06，E組為1.24±0.04，E+P組為1.15±0.06。

2.2各組肺腺癌A549細胞分布比例及凋亡情況比較E組、E+P組及E-P組的G1期細胞比例較對照組增高，且P組和P-E組的S期細胞比例較對照組增多(P<0.05)；G2期細胞所占比例在各藥物干預組均較對照組明顯減少(P<0.05)；各藥物干預組細胞凋亡率均較對照組明顯增高(P<0.05)。P組、E+P組與E-P組細胞凋亡率比較差異顯著(P<0.05)，而P-E組細胞凋亡率明顯高于其他組(P<0.05)。見表1。

組別細胞周期G1SG2凋亡率對照組53.1±5.235.0±4.514.0±2.90.9±0.1P組38.5±4.155.7±3.11)3.7±0.51)27.9±2.31)2)3)E組76.9±8.91)17.8±2.04.9±0.71)8.0±1.11)2)3)E+P組63.9±3.21)33.5±1.73.3±0.51)30.8±1.51)2)3)P-E組39.0±2.958.7±5.41)1.2±0.11)43.1±3.41)E-P組80.2±9.81)19.2±1.90.7±0.11)19.8±2.31)2)

與對照組比較：1)P<0.05；與P-E組比較：2)P<0.05；與E-P組比較：3)P<0.05

2.3各組A549 細胞中p-AKT和 p-EGFR 的表達比較E組(0.25±0.05)及P-E組(0.17±0.04)A549 細胞中p-AKT的表達水平較對照組(0.62±0.08)明顯下降，且P-E組明顯低于E組，而P組(1.01±0.09)較對照組明顯上調，E+P組(0.70±0.06)和E-P組(0.53±0.06)p-AKT 表達水平較E組及P-E組明顯上升(P均<0.05)。另外，P組及E-P組細胞p-EGFR的表達水平(1.67±0.07，1.70±0.06)較對照組(1.19±0.05)明顯上調，而P-E組(0.78±0.05)較對照組明顯下調，且E-P組細胞p-EGFR的表達水平較E組(1.16±0.04)及E+P組(1.05±0.06)明顯上調，而P-E組較E組及E+P組明顯下調(均P<0.05)。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)〔3〕，K-ras的突變與惡性腫瘤的發(fā)生以及發(fā)展具有較大關系，該基因屬于ras家族中的成員，在非小細胞肺癌(NSCLC)患者中，大約有20%～30%的患者存在K-ras基因突變，其中肺腺癌占大多數(shù)。且研究證實〔4〕，K-ras是引起NSCLC對EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)產生耐藥的重要因素。厄洛替尼是一種口服的EGFR-TKIs藥物，在臨床中已廣泛應用于EGFR基因突變的肺癌患者，但不能使K-ras基因突變的肺癌患者從中獲益〔5〕。培美曲塞是新一代多靶點細胞毒藥物，可通過有效抑制胸苷酸合成酶、二氫葉酸還原酶等的活性對葉酸代謝起到干擾作用，從而降低DNA、RNA等的合成，起到阻斷腫瘤細胞增殖的作用。但有研究顯示，培美曲塞不能顯著改善肺癌患者的治療有效率，其與其他化療藥物的聯(lián)合應用療效不一〔6〕。本研究提示培美曲塞及厄洛替尼對肺腺癌A549細胞的增殖均有較好的抑制作用，且培美曲塞序貫厄洛替尼對A549細胞的增殖抑制作用具有協(xié)同效果，但是厄洛替尼序貫培美曲塞對A549細胞增殖的抑制作用具有拮抗效果。分析本研究結果原因，抗腫瘤藥物的各種作用機制存在一定差異，培美曲塞與厄洛替尼抑制肺腺癌細胞的作用周期也存在差異，厄洛替尼主要應用于細胞分裂的G1期，培美曲塞則會作用在S期，當厄洛替尼序貫培美曲塞的時候，會使肺腺癌細胞被阻滯在G1期，致使S期的細胞顯著減少，進而使兩者的效果具有拮抗作用，使對細胞的抑制作用降低〔7〕。厄洛替尼聯(lián)合培美曲塞的時候，G1期的肺腺癌細胞會顯著增多，但是處于S期的細胞不會明顯減少，進而說明培美曲塞的作用沒受到抑制作用，說明兩種藥物聯(lián)合對細胞增殖和凋亡抑制作用沒有顯著增加的原因為對細胞周期作用不同。而應用培美曲塞序貫厄洛替尼能使G1期的細胞數(shù)量顯著減少，S期細胞的數(shù)目顯著增加，會使肺腺癌細胞被阻滯于S期后迅速誘導其進入凋亡階段，進而使兩種藥物作用產生協(xié)同效果〔8〕。FCM 法檢測各組細胞凋亡率的結果與其他研究〔9〕結果具有一致性，充分證實培美曲塞序貫厄洛替尼對肺腺癌A549細胞具有較強的抑制作用。且研究還發(fā)現(xiàn)，培美曲塞序貫厄洛替尼對肺腺癌A549細胞具有抑制作用與p-AKT的激活有關，該物質被激活能有效增強細胞對厄洛替尼的敏感性〔10〕。

綜上所述，應用培美曲塞序貫厄洛替尼能有效抑制肺腺癌A549細胞的增殖和凋亡，有效提高肺腺癌患者的治療效果，值得臨床推廣。

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〔2014-11-10修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：陳開杰(1977-)，男，副主任藥師，主要從事臨床藥學方面的研究。

基金項目：重慶市醫(yī)學科研計劃項目(No.2013-2-129)

中圖分類號〔〕R73〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6658-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.007