補(bǔ)肺益脾通竅湯對(duì)慢性鼻竇炎家兔模型NF-κB p65的影響*

張　岳，唐年亞

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 南陽(yáng) 473000)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

補(bǔ)肺益脾通竅湯對(duì)慢性鼻竇炎家兔模型NF-κB p65的影響*

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(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 南陽(yáng) 473000)

摘要目的：研究補(bǔ)肺益脾通竅湯對(duì)慢性鼻竇炎家兔模型鼻黏膜NF-κB p65的影響，探討其作用機(jī)制。方法：選取家兔60只，雌雄各半，分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型對(duì)照組、克拉霉素片組、補(bǔ)肺益脾通竅湯組、針氧組6組，每組10只。采用竇口不完全堵塞+竇腔留置棉絮造模法建立慢性鼻竇炎家兔模型，造模時(shí)間為42 d。造模成功后，克拉霉素片組灌胃克拉霉素片25 μg/(g·d)；補(bǔ)肺益脾通竅湯組灌胃補(bǔ)肺益脾通竅湯14 g生藥/(kg·d)；針氧組針刺5組穴位(迎香穴、肺俞穴、脾俞穴、腎俞穴和后三里穴)，針刺后給體積分?jǐn)?shù)300 mL/L氧10 min，1 d 1次；以上各組療程均為14 d。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組兔NF-κB p65在鼻竇黏膜的表達(dá)。結(jié)果：模型對(duì)照組家兔NF-κB p65的表達(dá)高于正常對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，克拉霉素片組、補(bǔ)肺益脾通竅湯組和針氧組NF-κB p65的表達(dá)均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)；其中以補(bǔ)肺益脾通竅湯組降低最為明顯，與正常對(duì)照組對(duì)比，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論： 補(bǔ)肺益脾通竅湯能夠抑制NF-κB p65激活，終止炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，減少炎癥介質(zhì)釋放，限制炎癥反應(yīng)；減輕鼻黏膜炎癥反應(yīng)，達(dá)到治療慢性鼻竇炎的目的。

關(guān)鍵詞補(bǔ)肺益脾通竅湯；慢性鼻竇炎；NF-κB p65；動(dòng)物；家兔

慢性鼻竇炎(chronic sinusitis，CRS) 屬中醫(yī)學(xué)“慢鼻淵”范疇，是鼻竇黏膜慢性化膿性疾病，臨床上以慢性上頜竇炎最為常見。目前臨床治療CRS多采用的藥物和(或)手術(shù)治療，容易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，手術(shù)治療后遺癥(如病情反復(fù)、頭痛等癥狀加重、嗅覺(jué)減退等)增多，因此尋求安全、有效、副作用少的CRS治療方法，已成為廣大耳鼻喉科醫(yī)生迫切需要解決的問(wèn)題。本研究通過(guò)觀察補(bǔ)肺益脾通竅湯對(duì)慢性鼻竇炎家兔模型鼻黏膜NF-κB p65的影響，探討補(bǔ)肺益脾通竅湯治療CRS的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物

選取3月齡1級(jí)健康家兔60只，雌雄各半，體質(zhì)量1.9～2.3 kg，由華中科技大學(xué)統(tǒng)計(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(鄂)2013-10。

1.2菌株

取門診慢性鼻竇炎患者上頜竇穿刺沖洗液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，篩選單一菌株金黃色葡萄球菌接種于血平板上，置于培養(yǎng)箱中 24 h，收集菌落，用生理鹽水稀釋成1 麥?zhǔn)蠁挝坏募?xì)菌懸濁液備用。

1.3藥品、試劑與儀器

補(bǔ)肺益脾通竅湯由黨參、黃芪、山藥、桔梗、辛夷花、荊芥、防風(fēng)、薏苡仁、茯苓、鵝不食草、細(xì)辛、甘草等組成，由南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院藥房制備，每毫升含1 g生藥；克拉霉素片，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20131209。兔抗NF-κB多克隆抗體(批號(hào)BA0866)、生物素化山羊抗兔抗體(批號(hào)AR0194)、抗體稀釋液(批號(hào)AR1016)、兔SABC試劑盒(批號(hào)SA1052)，均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；DAB顯色試劑盒，北京中山生物技術(shù)有限公司，批號(hào)SW1040。華佗牌針灸針一次性無(wú)菌銀針(直徑0.3 mm，長(zhǎng)25 mm)，蘇州醫(yī)療用品廠產(chǎn)品；PHY-III病理組織漂烘處理儀，常州中威電子儀器廠產(chǎn)品；BMJ-III病理組織包埋冷凍臺(tái)，常州中威電子儀器廠產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津?qū)嶒?yàn)儀器廠產(chǎn)品；Leica Qwin V3.2.0圖像分析系統(tǒng)，產(chǎn)地德國(guó)。

1.4分組、模型的建立與給藥

將60只家兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型對(duì)照組、克拉霉素片組、補(bǔ)肺益脾通竅湯組、針氧組6組，每組10只。采用竇口不完全堵塞+竇腔留置棉絮造模方法建立CRS家兔模型：家兔鼻部常規(guī)消毒鋪巾，10 g/L利多卡因手術(shù)區(qū)浸潤(rùn)麻醉；沿鼻背正中線作一縱長(zhǎng)切口，分離雙側(cè)上頜竇前壁皮下組織及骨膜；上頜竇穿刺針在上頜竇前壁圓孔凹陷處鉆開直徑1.5 mm小孔；取少量棉絮放置在竇口及竇腔中，竇口不完全堵塞；注入1mL金黃色葡萄球菌懸濁液；碘伏消毒手術(shù)創(chuàng)面，將骨膜、皮膚逐層縫合。假手術(shù)組手術(shù)步驟同上，但竇腔內(nèi)不填塞棉絮，不注射細(xì)菌。正常對(duì)照組不需任何處理。造模時(shí)間為42 d。組織學(xué)病理檢查以鼻竇黏膜出現(xiàn)增生肥厚，伴大量慢性炎性細(xì)胞滲出為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。造模成功后，克拉霉素片組灌胃克拉霉素片25 μg/(g·d)；補(bǔ)肺益脾通竅湯組灌胃補(bǔ)肺益脾通竅湯14 g生藥/(kg·d)；針氧組針刺5組穴位(迎香穴、肺俞穴、脾俞穴、腎俞穴和后三里穴)，針刺后放入密封紙箱，給體積分?jǐn)?shù)300 mL/L氧10 min，1 d 1次。以上各組療程均為14 d。

1.5檢測(cè)指標(biāo)

治療結(jié)束處死動(dòng)物，于冰盤上取出部分鼻竇黏膜。按照試劑盒說(shuō)明書，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組兔NF-κB P65在鼻竇黏膜的表達(dá)。顯微鏡下隨機(jī)選5個(gè)高倍視野(×200)，用計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)分析細(xì)胞凋亡率，以細(xì)胞核染呈棕褐色者為NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞。細(xì)胞陽(yáng)性率=棕褐色細(xì)胞面積/細(xì)胞總面積×100%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

模型對(duì)照組家兔NF-κB p65的表達(dá)高于正常對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，克拉霉素片組、補(bǔ)肺益脾通竅湯組和針氧組NF-κB p65的表達(dá)均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)；其中以補(bǔ)肺益脾通竅湯組降低最為明顯，與正常對(duì)照組對(duì)比，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1各組家兔鼻竇黏膜中NF-κB p65表達(dá)

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，#P<0.05；與補(bǔ)肺益脾通竅湯組對(duì)比，△P<0.05。

3討論

慢性鼻竇炎多與鼻竇內(nèi)多種細(xì)菌感染、炎癥細(xì)胞長(zhǎng)期浸潤(rùn)相關(guān)。鼻竇急性炎癥反復(fù)多次發(fā)作，導(dǎo)致鼻竇黏膜病變，纖毛上皮功能失常，上皮細(xì)胞分泌增強(qiáng)和鱗狀上皮化；竇口黏膜腫脹、肥厚,甚至息肉樣變，使竇口引流受阻，出現(xiàn)鼻竇慢性炎癥。

慢性炎癥反應(yīng)是體液和細(xì)胞等多因素介導(dǎo)的免疫機(jī)制表達(dá)，基因轉(zhuǎn)錄增加是許多細(xì)胞因子產(chǎn)生過(guò)量的關(guān)鍵[1]。NF-κB p65通過(guò)促進(jìn)多種細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄，參與并調(diào)控多種炎癥因子表達(dá)[2]。NF-κB活化后在核定位信號(hào)介導(dǎo)下，以能量依賴形式進(jìn)入核內(nèi)，接觸DNA，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)等基因轉(zhuǎn)錄；激發(fā)NF-κB過(guò)度活化，引起炎癥介質(zhì)過(guò)度表達(dá)和超量釋放[3]。炎癥介質(zhì)同時(shí)反作用激活NF-κB，形成正反饋效應(yīng)，使炎癥反應(yīng)放大并持續(xù)存在。慢性咽炎是鼻-鼻竇黏膜的慢性化膿性炎癥，參與早期免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)各階段的許多細(xì)胞因子都受NF-κB的調(diào)控。炎癥反應(yīng)激活NF-κB p65，持續(xù)激活的NF-κB p65通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞因子(如IL-6、IL-8)表達(dá)，刺激抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力，使炎癥反應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，損傷鼻-鼻竇黏膜周圍上皮細(xì)胞DNA，引起鼻-鼻竇黏膜組織的炎性損害。

補(bǔ)肺益脾通竅湯主要針對(duì)肺脾氣虛、濕邪滯留鼻竅的病因，采用補(bǔ)益肺脾、利水滲濕排膿、宣通鼻竅的方法進(jìn)行治療。黨參、黃芪、山藥補(bǔ)肺脾之氣，桔梗宣肺排膿，辛夷祛風(fēng)通竅，荊芥、防風(fēng)祛風(fēng)解表，薏苡仁、茯苓利水滲濕健脾，鵝不食草、細(xì)辛祛風(fēng)散寒除濕通竅，甘草調(diào)和諸藥，共奏補(bǔ)肺益脾、宣鼻通竅之功效。現(xiàn)代藥理表明：黨參、薏苡仁能夠提高機(jī)體免疫功能[4-5]；黃芪可以降低滑膜細(xì)胞和血清脂質(zhì)過(guò)氧化物的一氧化氮，發(fā)揮一定的抗炎作用[6]。諸藥合用,可抑制CRS的發(fā)生、發(fā)展，達(dá)到治療本病的目的。

本實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)肺益脾通竅湯可降低CRS中升高的NF-κB p65至正常水平，由此推測(cè)，補(bǔ)肺益脾通竅湯能夠抑制NF-κB p65激活，終止炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，減少炎癥介質(zhì)釋放，限制炎癥反應(yīng)；并提高機(jī)體免疫力，減輕鼻黏膜炎癥反應(yīng)，達(dá)到治療慢性鼻竇炎的目的。

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(編輯陶珠)

文章編號(hào):1001-6910(2016)01-0065-03

中圖分類號(hào):R765.4+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

doi:10.3969/j.issn.1001-6910.2016.01.28

* 基金項(xiàng)目：南陽(yáng)市科技攻關(guān)項(xiàng)目(2013GG062)

收稿日期：2015-04-24；修回日期：2015-08-31