熱補(bǔ)針法對(duì)RA模型家兔關(guān)節(jié)滑膜LDH、ATPase活性的影響*

杜小正,王金海,秦曉光,方曉麗,張小江

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

熱補(bǔ)針法對(duì)RA模型家兔關(guān)節(jié)滑膜LDH、ATPase活性的影響*

杜小正1,王金海2,秦曉光1,方曉麗1,張小江1

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

摘要目的：從機(jī)體能量代謝的角度探討熱補(bǔ)針法“取熱”的作用機(jī)制。方法：將40只青紫藍(lán)家兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針法組，每組8只。除正常對(duì)照組外，采用卵蛋白誘導(dǎo)法和低溫冷凍法對(duì)其他4組進(jìn)行RA寒證模型復(fù)制。造模成功后，除正常對(duì)照組、模型對(duì)照組外，其余各組分別施以平補(bǔ)平瀉、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法、熱補(bǔ)針法針刺，留針30 min/次，1 d 1次，共7 d。治療結(jié)束后分離關(guān)節(jié)滑膜，冰凍切片，借助組織化學(xué)染色技術(shù)觀察膝關(guān)節(jié)滑膜組織乳酸脫氫酶(LDH)、三磷酸腺苷酶(ATPase)活性。結(jié)果：模型對(duì)照組LDH和ATPase積分光度、陽性總面積、面積百分比高于正常對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；針刺組LDH活性變化均低于模型對(duì)照組(P<0.05)，而ATPase活性變化均高于模型對(duì)照組(P<0.05)；熱補(bǔ)針法組LDH活性變化均低于其他兩針刺組(P<0.05)，但ATPase活性變化明顯高于其他兩針刺組(P<0.05)。結(jié)論: 熱補(bǔ)針法能夠降低RA家兔關(guān)節(jié)滑膜LDH活性，增強(qiáng)ATPase活性，從而增強(qiáng)有氧代謝，使機(jī)體局部產(chǎn)生更多的能量可能是熱補(bǔ)針法“取熱”的機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞熱補(bǔ)針法；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；LDH；ATPase；動(dòng)物；家兔

熱補(bǔ)針法是簡化燒山火和進(jìn)火補(bǔ)法所形成的一種針刺手法，具有溫陽散寒的作用，能使患者產(chǎn)生熱感[1]。研究[2-4]表明：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者存在能量代謝不足的現(xiàn)象，即輕中度貧血、四肢關(guān)節(jié)冰冷僵硬等。前期的研究[5-8]證實(shí)了熱補(bǔ)針法對(duì)RA模型家兔具有鎮(zhèn)痛效應(yīng)，并且證實(shí)與腦脊液中β-EP、CCK-8和關(guān)節(jié)局部組織中β-EP、PGE2和LEK的變化有關(guān)。但是，這些研究只是從某些微觀指標(biāo)闡釋了其機(jī)理，未能體現(xiàn)熱補(bǔ)針法“取熱”的特點(diǎn)，還不足以揭示熱補(bǔ)針法對(duì)RA的相對(duì)特異調(diào)節(jié)機(jī)制。作為一種“取熱”手法，是否調(diào)節(jié)了RA機(jī)體能量代謝，顯示出相對(duì)特異性的治療作用？因此，本實(shí)驗(yàn)以RA寒證模型家兔為載體，觀察熱補(bǔ)針法對(duì)能量代謝相關(guān)酶LDH和ATPase的影響，從調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝的角度探討其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物

健康2.5月齡普通級(jí)雄性青紫藍(lán)家兔40只，體質(zhì)量(2.5±0.5)kg，由蘭州生物制品研究所提供，合格證號(hào)SCXK(甘)2012-0001。動(dòng)物購回后在蘭州軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)SYXK2007-007)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為：溫度(20±2)℃，相對(duì)濕度(50±10)%，按晝夜節(jié)律自然照明，自由進(jìn)食和飲水(自來水)，每周稱量1次體質(zhì)量。

1.2試劑與儀器

弗氏完全佐劑，Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)120428；卵蛋白干粉，上海伯奧生物科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)120513；硫化鈉，上?；瘜W(xué)試劑二廠產(chǎn)品，批號(hào)120511；LDH、ATPase染色試劑盒，上海榕柏生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20120569。華佗牌針灸針，直徑0.25 mm、長40 mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司產(chǎn)品；HANGPINGJAZO03精密天平，上海精密儀器公司產(chǎn)品；Tissue-Tek TEC全自動(dòng)組織包埋機(jī)，產(chǎn)地日本；CM1900冰凍切片機(jī)，產(chǎn)地德國、OLYMPUS 51TR-32FB3-E01光學(xué)顯微鏡，產(chǎn)地日本。

1.3分組與模型的建立

動(dòng)物被適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針法組，每組8只。以卵蛋白誘導(dǎo)法和低溫冷凍法進(jìn)行類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒證模型復(fù)制[9-10]，即：在實(shí)驗(yàn)開始的前3 d，用硫化鈉和蒸餾水配制成的80 g/L硫化鈉作為脫毛劑，脫掉家兔肩背部提前選定的6個(gè)點(diǎn)和雙后腿膝關(guān)節(jié)周圍的毛。將4 g/L的卵蛋白溶液和等量的弗氏完全佐劑混合液于每個(gè)點(diǎn)皮下注射0.2 mL。兩周后再以同樣的方法、劑量每點(diǎn)重復(fù)皮下注射1次。第2次免疫完成后6 d，將預(yù)先配制好的20 g/L卵蛋白生理鹽水溶液向膝關(guān)節(jié)內(nèi)分別注入0.4 mL。在24 h之內(nèi)膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫觸痛，表明模型復(fù)制成功。在模型復(fù)制成功后第2天，用700 mL/L酒精消毒兩后腿足，上、下、左、右圍置冰袋(3份冰+1份結(jié)晶氯化鈣，粉碎混合，溫度降至-20～-25 ℃之間)冷凍1.5 h，在45 ℃溫水中復(fù)溫5 min (室溫12℃)。冷凍后14 d，家兔表現(xiàn)為精神萎糜不振；兩后肢匍伏跛行；膝關(guān)節(jié)腫脹、周徑明顯大于對(duì)照組，局部青紫、皮溫不高，表示RA寒證模型建立成功。

1.4針刺方法

造模成功后，各組家兔進(jìn)行相應(yīng)處理。足三里穴選取參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[11]家兔常用針灸穴位定位標(biāo)準(zhǔn)，并以比較解剖學(xué)為依據(jù)定位。正常對(duì)照組：不予任何處理，僅每日與針刺組同時(shí)給予捆綁和抓取刺激1次。模型對(duì)照組：不予任何處理，僅每日與針刺組同時(shí)給予捆綁和抓取刺激1次。平補(bǔ)平瀉組：用兔臺(tái)固定家兔，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)20 g/L碘酒、體積分?jǐn)?shù)750 mL/L酒精消毒后，將華佗牌針灸針90度直刺刺入足三里穴內(nèi)8 mm，施以平補(bǔ)平瀉法1 min，留針30 min/次, 1 d 1次，共7 d。平補(bǔ)平瀉法操作方法參照《刺法灸法學(xué)》[12]：針刺得氣后，施以前后均勻捻轉(zhuǎn)，指力均勻，角度180°～360°，頻率60～90轉(zhuǎn)/min，反復(fù)操作1 min。捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組：固定、消毒方法同前，將華佗牌針灸針90度直刺刺入足三里穴內(nèi)8 mm，施以捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法1 min，留針30 min/次，1 d 1次，共7 d。捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法操作方法參照《刺法灸法學(xué)》[12]：針刺得氣后，在針下得氣處小幅度前后捻轉(zhuǎn)針體(角度180°～360°，頻率60～90轉(zhuǎn)/min)，拇指向前左轉(zhuǎn)時(shí)用力重，指力沉重向下；拇指向后右轉(zhuǎn)還原時(shí)用力輕，反復(fù)操作1 min。熱補(bǔ)針法組：固定、消毒方法同前，將華佗牌針灸針90度直刺刺入足三里穴內(nèi)8 mm，施以熱補(bǔ)法1 min，留針30 min/次，1 d 1次，共7 d。熱補(bǔ)針法操作參照《鄭氏針灸全集》[1]：操作者左手拇指緊按穴位，右手持針刺入穴內(nèi)8～12 mm，針刺得氣后，左手加重壓力，右手拇指向前連續(xù)捻按5次；針下沉緊后針尖拉著有感應(yīng)的部位，連續(xù)重插輕提5次；拇指再向前連續(xù)捻按5次，反復(fù)操作1 min，最后使針下沉緊，留針30 min。

1.5檢測指標(biāo)

采用組織化學(xué)染色法觀察組織LDH和ATPase。

1.5.1組織切片制備

將家兔處死，迅速采取關(guān)節(jié)滑膜組織。恒凍箱切片機(jī)切片，厚度6 μm，貼于蓋玻片上風(fēng)干。ATPase采用鈣鈷法染色，LDH染色采用四唑鹽法，嚴(yán)格按照染色試劑盒說明進(jìn)行切片染色、制備。

1.5.2組織切片定量分析

組織切片經(jīng)Image pro圖像分析系統(tǒng)對(duì)關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的LDH、ATPase陽性沉淀的圖像分析。計(jì)算機(jī)軟件分析[Pixel2]表示像素平方，主要用于計(jì)算酶染色陽性圖像面積，Areasum[Pixel2]表示陽性總面積；面積百分比是關(guān)鍵性指標(biāo)，表示陽性面積占整個(gè)圖片百分?jǐn)?shù)，反映酶相對(duì)活性強(qiáng)度；積分光度則是通過酶染色的深淺程度來體現(xiàn)酶活性的大小。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1各組家兔關(guān)節(jié)滑膜LDH活性變化對(duì)比

模型對(duì)照組、平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針法組的家兔滑膜LDH積分光度、陽性總面積、面積百分比均高于正常對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針法組滑膜LDH積分光度、陽性總面積、面積百分比均降低，但仍高于正常對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( (P<0.05)。熱補(bǔ)針法組LDH積分光度、陽性總面積、面積百分比均低于平補(bǔ)平瀉組和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，#P<0.05；與平補(bǔ)平瀉組對(duì)比，△P<0.05；與捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組比較，＊P<0.05。

2.2各組家兔關(guān)節(jié)滑膜ATPase活性變化對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組、平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針法組ATPase積分光度、陽性總面積、面積百分比升高，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針法組ATPase積分光度、陽性總面積、面積百分比均較模型對(duì)照組高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。熱補(bǔ)針法組ATPase活性高于平補(bǔ)平瀉組和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖2。

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，#P<0.05；與平補(bǔ)平瀉組對(duì)比，△P<0.05；與捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組對(duì)比，＊P<0.05。

3討論

《針灸大成·三衢楊氏補(bǔ)瀉》曰：“燒山火，能除寒，三進(jìn)一退熱涌涌……”又曰：“進(jìn)火針，初進(jìn)一分，……退三退，進(jìn)三進(jìn)，……自然熱矣?！币饧礋交鸷瓦M(jìn)火補(bǔ)法均能使機(jī)體局部產(chǎn)生熱感，因此稱其為“取熱”手法。熱補(bǔ)針法是鄭毓琳教授、鄭魁山教授簡化燒山火和進(jìn)火補(bǔ)法而來的，具有“取熱”效應(yīng)。既然熱補(bǔ)針法能夠使機(jī)體局部產(chǎn)生熱感，就說明機(jī)體的能量代謝發(fā)生了變化；因此，本實(shí)驗(yàn)選擇與能量代謝相關(guān)的酶LDH和ATPase作為指標(biāo)，觀察其對(duì)RA寒證模型家兔能量代謝的影響。

卵蛋白誘導(dǎo)的RA模型能很好地模擬人RA病理過程，而且病理過程至少持續(xù)8周，在家兔等較大型動(dòng)物上能夠復(fù)制，是研究RA的理想的模型[13]。但是，卵蛋白誘導(dǎo)的RA模型關(guān)節(jié)局部始終紅腫熱痛，能量代謝異?；钴S，類似于人RA發(fā)病早期的“熱痹”。冷凍1次后，關(guān)節(jié)局部皮溫逐漸降低，血沉加快，紅細(xì)胞壓積下降，纖維蛋白原增加，肢體血流緩慢，流量減少，與人RA后期的“寒痹”和“風(fēng)寒濕阻證”相似[10]。前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，凍后第14天，皮溫降至正常或者稍低，說明低溫應(yīng)激能使機(jī)體能量代謝下降。中醫(yī)所謂“寒”就是低溫環(huán)境刺激，這種單純疾病動(dòng)物模型過程中融入中醫(yī)病因因素，既符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)RA病理特點(diǎn)，又體現(xiàn)了中醫(yī)辨證論治的特色。

LDH是糖無氧酵解的關(guān)鍵酶，廣泛存在于組織細(xì)胞內(nèi)，主要作用是催化乳酸與丙酮酸之間的反應(yīng)。葡萄糖通過無氧酵解最后被LDH催化生成乳酸。機(jī)體在病理?xiàng)l件下，LDH活性增強(qiáng)，催化乳酸氧化，這是機(jī)體自動(dòng)調(diào)節(jié)的保護(hù)性代償機(jī)制。當(dāng)滑膜組織缺氧時(shí)，滑膜細(xì)胞生理功能被破壞，發(fā)生一系列病理生化變化，滑膜細(xì)胞變性釋放出LDH、細(xì)胞被破壞越多, LDH活性越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)中模型對(duì)照組、平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針法組家兔滑膜LDH活性均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)印證了以上觀點(diǎn)。此外，丙酮酸被LDH催化產(chǎn)生大量乳酸，乳酸在體內(nèi)的大量堆積又會(huì)導(dǎo)致機(jī)體疲乏無力。本實(shí)驗(yàn)造模成功后，家兔精神萎靡、活動(dòng)量減少的癥狀與之相符。針刺治療1周后，平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針法組滑膜LDH活性均向正常水平恢復(fù)(P<0.05)，說明各種針刺方法均可使LDH活性降低，這可能是因?yàn)獒槾炭梢栽鰪?qiáng)局部血液循環(huán)，從而增強(qiáng)了供氧能力，使機(jī)體局部組織缺氧狀態(tài)得到改善，細(xì)胞有氧呼吸增強(qiáng)，相應(yīng)的無氧呼吸開始減弱，LDH活性也逐漸降低；且熱補(bǔ)針法降低LDH活性的效果優(yōu)于平補(bǔ)平瀉法和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法(P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn)[14]疲勞大鼠骨骼肌中LDH含量明顯增高(P<0.05)，通過服用抗疲勞中藥能明顯降低血清LDH[15]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。ATPase是細(xì)胞膜上重要的離子載體，具有載體和酶的功能，可用于判斷機(jī)體能量代謝的強(qiáng)弱。模型對(duì)照組ATPase活性增高，可能是因?yàn)榈蜏貞?yīng)激使機(jī)體能量代謝下降，機(jī)體應(yīng)激性增高了ATPase活性。針刺治療后，ATPase活性進(jìn)一步增高，說明這幾種針刺方法均能使機(jī)體能量代謝能力增強(qiáng)，以熱補(bǔ)針法的效應(yīng)最明顯。相似的研究[16]也表明針刺可以使小鼠胃及骨骼肌ATPase活性明顯增強(qiáng)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

LDH是無氧代謝酶，ATPase是有氧代謝酶，以上的結(jié)果提示：針刺能夠降低無氧代謝而增強(qiáng)有氧代謝。熱補(bǔ)針法可增強(qiáng)機(jī)體有氧代謝，使機(jī)體產(chǎn)生更多的能量，部分轉(zhuǎn)化為熱能散出體外，這可能就是熱補(bǔ)針法“取熱”的機(jī)制；但是機(jī)體能量代謝是一個(gè)涉及多個(gè)環(huán)節(jié)的復(fù)雜過程，僅從兩個(gè)能量代謝相關(guān)酶的變化來得出上述結(jié)論為時(shí)過早，還需要進(jìn)一步的深入研究。

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(編輯陶珠)

文章編號(hào):1001-6910(2016)01-0058-05

中圖分類號(hào):R593.22

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

doi:10.3969/j.issn.1001-6910.2016.01.26

作者簡介

杜小正(1973-)，男(漢族)，甘肅蘭州人，博士，副教授，副主任醫(yī)師，研究方向：傳統(tǒng)針刺手法治療免疫系統(tǒng)疾病。

* 基金項(xiàng)目：2011年度甘肅省教育廳第二批科研項(xiàng)目(1106B-08)；2010年度甘肅中醫(yī)學(xué)院中青年科研基金項(xiàng)目(gszyxy2010-4)

收稿日期：2015-06-18；修回日期：2015-11-11