2種harpin內(nèi)源表達(dá)對(duì)短短芽孢桿菌HAB—5菌株抑制和促生能力的影響

汪惠　謝琳琳　劉文波等

摘要：采用化學(xué)方法分別將來(lái)自水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）、棉花角斑病菌（X. citri subsp. malvacearum）hrp基因簇中的hpa1Xoo、hpaXm基因轉(zhuǎn)化至生防菌短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevs）HAB-5菌株，測(cè)定2種harpin蛋白對(duì)短短芽孢桿菌抑菌和促生能力的影響，以期獲得更高效的生防菌株。結(jié)果表明，獲得轉(zhuǎn)入hpa1Xoo的突變體581個(gè)，轉(zhuǎn)入hpaXm的突變體有650個(gè)；經(jīng)PCR及PCR Southern Blot驗(yàn)證，確定hpa1Xoo、hpaXm基因均成功轉(zhuǎn)化至HAB-5菌株中；經(jīng)SDS-PAGE電泳，在分子量大小約39、41 ku處可見(jiàn)明顯條帶，表明hpa1Xoo、hpaXm基因分別編碼的融合蛋白GST-harpinXoo、GST-harpinXm在突變體菌株中得到表達(dá)；與出發(fā)菌株HAB-5菌株相比，轉(zhuǎn)化后的突變體在菌落形態(tài)、拮抗活性上均發(fā)生了改變，且突變體總蛋白可在煙草葉片上激發(fā)過(guò)敏性反應(yīng)，而HAB-5菌株總蛋白不能激發(fā)過(guò)敏性反應(yīng)；突變體菌株對(duì)番茄種子的促生作用顯著提高，且轉(zhuǎn)入hpaXm基因的菌株效果更佳，使胚芽、胚根的生長(zhǎng)分別提高100.77%、69.14%?？梢?jiàn)，harpin能夠在短短芽孢桿菌HAB-5菌株中得到表達(dá)，且轉(zhuǎn)化后的突變體表現(xiàn)出良好的促生效果。

關(guān)鍵詞：hpa1Xoo；hpaXm；轉(zhuǎn)化；短短芽孢桿菌HAB-5；過(guò)敏性反應(yīng)

中圖分類(lèi)號(hào)： S476文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0161-06

收稿日期：2015-01-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31160359、31360029）；海南省產(chǎn)學(xué)研一體化專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：CXY20140038）；海南大學(xué)社會(huì)服務(wù)專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：HDSF201305）；教育部博士點(diǎn)基金（編號(hào)：20124601110004、20104601110004）；國(guó)家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：CARS-34-GW8）；國(guó)家重大基礎(chǔ)研究計(jì)劃（編號(hào)：2011CB111612）。

作者簡(jiǎn)介：汪惠（1991—），女，碩士研究生，主要從事微生物學(xué)研究。

通信作者：鄭服叢，教授，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail：zhengfucong@126.com。harpin是一類(lèi)由革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌hrp基因編碼的蛋白質(zhì)，由不依賴(lài)信號(hào)肽的Ⅲ型分泌機(jī)制分泌到胞外，可在非寄主植物上引起過(guò)敏反應(yīng)（hypersensitive response，HR）[1-3]。在非寄主植物上施用Harpin蛋白，可使植物產(chǎn)生抗病、抗蟲(chóng)、促進(jìn)生長(zhǎng)等多種有益表型[4]，這些表型與harpin蛋白誘導(dǎo)的植物內(nèi)在生理生化反應(yīng)相關(guān)[5]。harpin蛋白富含甘氨酸，缺乏半胱氨酸，熱穩(wěn)定但對(duì)蛋白酶敏感[6]。harpinXoo、harpinXm是由分別來(lái)自于水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）、棉花角斑病菌（X. citri ssp. malvacearum）hrp基因簇中hpa1（hrf1）基因編碼的蛋白，均具有harpin蛋白的共同特征，且能誘導(dǎo)煙草、擬南芥、番茄、矮牽牛、馬鈴薯、大豆、黃瓜、辣椒等多種植物產(chǎn)生過(guò)敏性反應(yīng)[7-8]。

芽孢桿菌作為一種較理想的生防微生物，逐漸成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[9]。通過(guò)基因工程技術(shù)有目的地改造拮抗細(xì)菌，拓寬新型高效生防菌的防治范圍并提高生防效果，已成為植物病害生物防治研究的重點(diǎn)[10]。目前，已有學(xué)者將編碼harpin蛋白的hrp基因轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌中，使出發(fā)菌株具有harpin蛋白的部分特性[11-12]。以短短芽孢桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)是研究熱點(diǎn)，但其表達(dá)harpin蛋白卻未見(jiàn)報(bào)道。短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevs）HAB-5菌株是一種較廣譜的生防細(xì)菌，對(duì)多種病原菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制能力，但該菌株不具有誘導(dǎo)抗病能力和穩(wěn)定有效的促生效果[13]。把編碼harpin蛋白誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性的hrp基因轉(zhuǎn)化到生防菌芽孢桿菌中，以期實(shí)現(xiàn)harpin蛋白在短短芽孢桿菌中的高效表達(dá)，獲得更高效的生防菌株，為新型生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試菌株、培養(yǎng)基、植物材料

供試菌株為HAB-5菌株，是筆者所在實(shí)驗(yàn)室從棉花根際土壤中分離獲得的1株短短芽孢桿菌[13]。大腸桿菌（Escherichia coli）菌株BL21（DE3）作為重組融合蛋白GST-harpinXoo、GST-harpinXm表達(dá)的宿主菌株，具有氨芐青霉素抗性（Amp，100 mg/mL），表達(dá)的重組融合蛋白GST-harpinXoo、GST-harpinXm的分子量大小分別為39、41 ku左右。芒果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）C7-2菌株來(lái)自筆者所在實(shí)驗(yàn)室，用于拮抗測(cè)定。

LB培養(yǎng)基[14]用于HAB-5菌株、突變體菌株的培養(yǎng)；PDA培養(yǎng)基[14]用于供試病原真菌、HAB-5菌株、突變體菌株的對(duì)峙培養(yǎng)。MD培養(yǎng)基[15]（10 mL）配方為：10×PC緩沖液0.92 mL、50%葡萄糖0.1 mL（115 ℃滅菌30 min）、5 mg/mL 色氨酸0.1 mL、2.2 mg/mL檸檬酸鐵銨0.005 mL、05 mol/L天門(mén)冬氨酸鉀0.24 mL、1 mol/L硫酸鎂0.03 mL。10×PC緩沖液配方為：磷酸二氫鉀44 mmol/L、磷酸氫二鉀60 mmol/L、檸檬酸三鈉30 mmol/L。

供試煙草品種為三生煙（Nicotiana sp.），于（25±1） ℃培養(yǎng)至5～7葉。番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）種子紅粉佳人，購(gòu)自天津科潤(rùn)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司。

1.2酶、試劑、引物

質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Marker、Taq酶、限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司，Southern雜交試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏公司，分子操作過(guò)程均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。引物合成、測(cè)序均由華大基因公司完成，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系（總體積25 μL）為：EcoTaq Mix 8.5 μL、DNA模板1 μL、上下游引物各1 μL，并使用滅菌超純水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 45 s、56 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，保存圖像。

1.4HAB-5菌株、突變體菌株的菌落形態(tài)及其對(duì)C7-2菌株的拮抗作用

1.4.1菌落形態(tài)觀察用滅菌后的牙簽接菌在LB瓊脂平板上，置于28 ℃培養(yǎng)2 d，觀察菌落形態(tài)。

1.4.2對(duì)芒果炭疽菌C7-2菌株的拮抗作用采用平板對(duì)峙法[16]，在PDA平板中央接種1塊直徑為0.5 cm的病原菌菌餅，在菌餅周?chē)?.5 cm處接種供試細(xì)菌；單獨(dú)接種直徑為0.5 cm的病原菌菌餅為對(duì)照。將平板置于28 ℃下培養(yǎng)，觀察記錄有無(wú)抑菌圈及其大小，并計(jì)算抑菌率。抑菌率（%）=（對(duì)照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑）/對(duì)照病原菌菌落直徑×100%[17]。

1.5粗蛋白的提取及SDS-PAGE電泳

參照繆衛(wèi)國(guó)提取harpin粗蛋白、菌體總蛋白的方法[8]，采用LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)（160 r/min、28 ℃）菌株12 h，以8 000 r/min下離心10 min收集菌體。將菌體用PBS懸浮，經(jīng)超聲波破碎儀破碎菌體后于4 ℃、8 000 r/min離心10 min。采用0.22 μm細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾上清液，獲得粗蛋白，煮沸（100 ℃）10 min進(jìn)一步純化粗蛋白以檢測(cè)harpin蛋白的活性。SDS-PAGE電泳參照汪家政等的方法[18]進(jìn)行。

1.6煙草過(guò)敏性反應(yīng)及突變體蛋白特性

過(guò)敏性反應(yīng)的測(cè)定參照Klement的方法[19]，分別取HAB-5菌株的總蛋白、突變體代表菌株的總蛋白、GST-harpinXoo蛋白、GST-harpinXm蛋白、PBS各50 μL，注射到煙草葉片中，于（25±1） ℃下放置，觀察煙草葉片是否發(fā)生過(guò)敏性反應(yīng)。突變體蛋白特性的研究參照諶曉曦等的方法[20]，分別測(cè)定菌體粗蛋白在煮沸10 min、強(qiáng)酸堿、蛋白酶K、紫外線(xiàn)等處理下的穩(wěn)定性。

1.7短短芽孢桿菌HAB-5菌株及其突變體菌株對(duì)番茄種子的促生作用

取HAB-5菌株、突變體代表菌株，測(cè)試其對(duì)番茄種子的促生作用。取搖菌過(guò)夜的菌株培養(yǎng)液，于4 ℃、8 000 r/min下離心10 min，棄去上清液。經(jīng)無(wú)菌水清洗后再次離心，并用無(wú)菌水調(diào)節(jié)至D600 nm=0.8，即菌液濃度約為10 億CFU/mL，保存?zhèn)溆?。采用無(wú)菌水將各菌株菌懸液依次稀釋為1億、0.1億、0.01億、0.001 億CFU/mL等濃度，每個(gè)處理濃度3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10粒番茄種子。種子經(jīng)溫湯浸種后，置于鋪有單層濾紙的培養(yǎng)皿（9 cm）中，分別向各培養(yǎng)皿中注入5 mL不同濃度的處理液，種子上部再鋪1層濾紙，置于（28±1） ℃恒溫培養(yǎng)箱中。于72 h后觀察發(fā)芽勢(shì)情況，于96 h后計(jì)算發(fā)芽率，并測(cè)定胚根、胚芽的長(zhǎng)度，以根長(zhǎng)達(dá)到0.2 cm為萌芽標(biāo)志[21]。試驗(yàn)中對(duì)照均為無(wú)菌水。

2結(jié)果與分析

2.1突變體菌株的篩選及PCR、PCR Southern Blot驗(yàn)證

將hpa1Xoo、hpaXm基因轉(zhuǎn)化HAB-5菌株48 h后，在Amp抗性平板上形成單菌落，作為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，分別獲得轉(zhuǎn)入hpa1Xoo、hpaXm的轉(zhuǎn)化子581、650個(gè)（圖1-A）。挑取50個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在400～500 bp間均可擴(kuò)增出特異性條帶，經(jīng)測(cè)序比對(duì)分別與hpa1Xoo、hpaXm基因序列吻合。其中10個(gè)突變體的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1-B，分別將轉(zhuǎn)入hpaXm的

突變體命名為B1xm、B2xm、B3xm、B4xm、B5xm，將轉(zhuǎn)入hpa1Xoo的突變體命名為B1xoo、B2xoo、B3xoo、B4xoo、B5xoo。進(jìn)行PCR Southern Blot驗(yàn)證以確保試驗(yàn)的精確性，可見(jiàn)選取的突變體均產(chǎn)生明顯陽(yáng)性信號(hào)（圖1-C），由此確定hpa1Xoo、hpaXm基因均已成功轉(zhuǎn)化至HAB-5菌株中。

2.2菌落形態(tài)對(duì)比

轉(zhuǎn)化后的突變體在固體LB培養(yǎng)基平板上接種72 h，與HAB-5菌株相比，轉(zhuǎn)入hpa1Xoo、hpaXm基因的突變體菌落均發(fā)生了一定程度的形態(tài)變化。HAB-5菌株的菌落呈白色，菌落表面微起皺褶，菌苔邊緣呈波紋狀，不透明，易挑起；轉(zhuǎn)化后突變體的菌落顏色各異，呈白色或微黃色，菌落表面凸起，半透明且有光澤，質(zhì)地濕潤(rùn)，不易挑起。轉(zhuǎn)hpaXm菌株的菌落較平滑，菌苔邊緣較整齊；轉(zhuǎn)hpa1Xoo菌株的菌落多呈蛋黃狀，中心凸起，邊緣較平坦，菌苔邊緣多呈不規(guī)則狀（圖2）。

2.3突變體對(duì)炭疽病C7-2菌株的拮抗作用

對(duì)峙培養(yǎng)后，HAB-5菌株及各突變體菌株在培養(yǎng)3、5、7 d 后均對(duì)病原菌C7-2菌株產(chǎn)生不同程度的抑制作用，但與HAB-5菌株相比，突變體的拮抗活性均減弱。對(duì)峙3 d后產(chǎn)生抑菌帶；對(duì)峙5 d后抑菌帶逐漸減弱，但抑菌效果有所增強(qiáng)；對(duì)峙7 d后抑菌帶消失，但對(duì)病原菌仍有一定程度的抑菌作用（圖3、表2）。

2.4突變體harpin蛋白的表達(dá)

從突變體中選取2株代表性菌株B3xm、B5xoo，用作后續(xù)研究。細(xì)胞破碎提取GST-harpin粗蛋白以及HAB-5、B3xm、B5xoo菌株總蛋白后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，在30～50 ku之間，約39、41 ku位置可見(jiàn)B3xm、B5xoo菌株總蛋白均存在明顯條帶，與GST-harpinXm、GST-harpinXoo相應(yīng)位置的條帶相同；而在HAB-5菌株總蛋白的泳道相同位置并未出現(xiàn)類(lèi)似條帶，表明融合蛋白GST-harpinXm、GST-harpinXoo在突變體B3xm、B5xoo菌體內(nèi)得到表達(dá)。此外，與HAB-5菌株相比，B3xm、B5xoo在整個(gè)蛋白譜帶上均發(fā)生了改變，表明突變體菌株在多肽和蛋白表達(dá)的種類(lèi)、數(shù)量上也有很大改變（圖4）。

2.5突變體粗蛋白過(guò)敏性反應(yīng)檢測(cè)及其特性

將GST-harpinXoo粗蛋白、GST-harpinXm粗蛋白、B3xm粗蛋白、B5xoo粗蛋白分別注射至煙草葉片中，18 h后均能在煙草葉片上產(chǎn)生過(guò)敏性反應(yīng)，而HAB-5菌株粗蛋白不能產(chǎn)生過(guò)敏性反應(yīng)。分別以100 ℃煮沸10 min、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿處理突變體粗蛋白，仍能在18 h內(nèi)激發(fā)HR；經(jīng)蛋白酶K水解30 min、紫外光照射處理則完全喪失了激發(fā)HR的能力，表明突變體表達(dá)的harpin蛋白對(duì)酸堿不敏感，對(duì)熱穩(wěn)定、紫外線(xiàn)和蛋白酶K敏感，此結(jié)論與已報(bào)道的GST-harpinXoo、GST-harpinXm粗蛋白特性[8]相同（圖5）。

2.6各菌株對(duì)番茄種子的促生效果

與清水對(duì)照相比，HAB-5、B3xm、B5xoo不同濃度菌懸液對(duì)胚芽、胚根的生長(zhǎng)均有顯著性差異。除10 億CFU/mL外，隨著濃度的降低，HAB-5菌懸液的胚芽生長(zhǎng)分別比對(duì)照高10.85%、24.03%、26.36%、34.11%，胚根生長(zhǎng)分別比對(duì)照高9.14%、26.29%、29.71%、36.00%，0.001 億CFU/mL 為菌懸液的最適濃度，胚芽、胚根生長(zhǎng)分別提高34.11%、36.00%；B3xm菌懸液的胚芽生長(zhǎng)分別比對(duì)照高100.77%、59.70%、27.13%、44.19%、45.74%，胚根生長(zhǎng)分別比對(duì)照高

69.14%、28.29%、21.71%、2400%、20.57%，10 億CFU/mL為菌懸液的最適濃度，胚芽、胚根生長(zhǎng)分別提高100.77%、69.14%；B5xoo菌懸液的胚芽生長(zhǎng)分別比對(duì)照高68.21%、54.26%、69.77%、91.47%、46.51%，胚根生長(zhǎng)分別比對(duì)照高36.86%、2571%、3857%、47.14%、38.86%，0.01億CFU/mL為菌懸液的最適濃度，胚芽、胚根生長(zhǎng)分別提高91.47%、4714%。可見(jiàn)，除10億CFU/mL的HAB-5菌懸液外，不同濃度的菌懸液對(duì)番茄胚根、胚芽生長(zhǎng)均有不同程度的促生作用；與HAB-5菌株相比，轉(zhuǎn)化后的突變體菌株B3xm、B5xoo對(duì)胚芽和胚根的促生作用均有明顯提高，且高濃度菌懸液對(duì)番茄種子的生長(zhǎng)并無(wú)抑制作用（表3）。

3結(jié)論與討論

目前，harpin蛋白基因表達(dá)宿主主要是大腸桿菌、酵母、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌是經(jīng)典的蛋白基因表達(dá)系統(tǒng)，能夠高水平表達(dá)外源蛋白基因，但由于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁復(fù)雜，具有雙層膜結(jié)構(gòu)，其分泌的水解酶常在信號(hào)肽的引導(dǎo)下跨越第1層膜后滯留在周質(zhì)空間，因而很難將蛋白分泌到胞外；此外，大腸桿菌是一種潛在的病原菌，其生長(zhǎng)過(guò)程中不斷釋放脂多糖等致熱源物質(zhì)，為產(chǎn)物的分離和純化帶來(lái)巨大困難[22]。酵母菌雖具有一定蛋白翻譯后的加工能力，有利于真核蛋白的表達(dá)，但在表達(dá)外源基因時(shí)會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)物蛋白不均一、降解、信號(hào)肽加工不完全、形成多聚體等問(wèn)題，蛋白分泌效率低[23]。相對(duì)于前兩者，芽孢桿菌表現(xiàn)出很大的優(yōu)越性。王鈺利用枯草芽孢桿菌表達(dá)harpin蛋白，生物活性檢測(cè)、誘導(dǎo)植物抗病性分析結(jié)果表明，工程菌能夠誘導(dǎo)煙草葉片產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，并能提高番茄對(duì)早疫病菌的抗性[11]。喬俊卿等將harpin編碼基因?qū)虢獾矸垩挎邨U菌FZB42菌株中，harpin蛋白可分泌到胞外并保持生物活性，表現(xiàn)出比出發(fā)菌株更好的促生和防病能力[12]。本研究將2種harpin編碼基因?qū)攵潭萄挎邨U菌HAB-5菌株中，反而降低了該菌株的抑菌能力，但能夠誘導(dǎo)煙草葉片產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，并提高出發(fā)菌株的促生能力。

關(guān)于芽孢桿菌生防菌株的構(gòu)建，枯草芽孢桿菌的研究較為成熟，但由于其胞外蛋白酶活性很強(qiáng)，會(huì)大量降解外源蛋白，在構(gòu)建工程生防菌株時(shí)具有較大局限性。蘇云金芽孢桿菌雖然胞外蛋白酶活性不高，但野生菌株中含有大量?jī)?nèi)生質(zhì)粒，而內(nèi)生質(zhì)粒對(duì)外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)具有較大影響。本研究中短短芽孢桿菌HAB-5菌株的胞外蛋白酶活性?xún)H為枯草芽孢桿菌的1.6%，且細(xì)胞壁較薄，內(nèi)生質(zhì)粒較少[24]，從而能有效防止外源蛋白的降解，促進(jìn)外源基因的高效導(dǎo)入，使有促生防病效果的harpin蛋白與生防芽孢桿菌真正結(jié)合起來(lái)，研制出新型高效的生防制劑。以短短芽孢桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)是研究熱點(diǎn)，但未見(jiàn)其表達(dá)harpin的相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，將突變體菌體總蛋白B3xm、B5xoo注射至煙草葉片，均能在煙草葉片上產(chǎn)生明顯的過(guò)敏性壞死斑；經(jīng)SDS-PAGE電泳，分別在分子量大小為39、41 ku處可見(jiàn)明顯條帶，表明融合蛋白GST-harpinXm、GST-harpinXoo在突變體菌體內(nèi)得到良好表達(dá)。此結(jié)論與編碼harpin基因轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌[11]、解淀粉芽孢桿菌FZB42菌株的研究結(jié)論[12]相一致。

本研究通過(guò)化學(xué)方法成功將hpa1Xoo、hpaXm基因轉(zhuǎn)入短短芽孢桿菌HAB-5菌株中，得到一系列轉(zhuǎn)化子。雖轉(zhuǎn)化效率很高，但得到的突變體菌落均發(fā)生了形態(tài)變化，且目前篩選出的突變體對(duì)致病菌的拮抗效果與原始菌株相比均不理想。已有研究表明，用質(zhì)粒進(jìn)行菌株標(biāo)記時(shí)，由于質(zhì)粒中報(bào)告基因、抗生素等基因的表達(dá)是在宿主菌體的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯系統(tǒng)作用下進(jìn)行的，消耗了宿主的物質(zhì)和能量，對(duì)宿主造成代謝負(fù)擔(dān)，可能影響宿主菌體的拮抗性能[25]。此外，在SDS-PAGE電泳過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，突變體B3xm、B5xoo菌株在整個(gè)蛋白譜帶上與HAB-5菌株有很大差異，菌株體內(nèi)表達(dá)的多肽和蛋白質(zhì)的數(shù)量、種類(lèi)均發(fā)生了變化，從而使表達(dá)的抑菌活性物質(zhì)發(fā)生改變。在突變體與病原菌C7-2菌株的對(duì)峙培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)3 d后突變體對(duì)C7-2菌株表現(xiàn)出一定程度的抑菌作用，5 d后抑菌作用有所增強(qiáng)，7 d后抑菌作用逐漸減弱。已有研究表明，枯草芽孢桿菌代謝過(guò)程中產(chǎn)生的某些抗菌物質(zhì)，可能作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被細(xì)菌本身和其他菌利用，導(dǎo)致抗菌物質(zhì)減少、抑菌作用減弱[26-27]，此現(xiàn)象有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

在番茄種子促生試驗(yàn)中，與HAB-5菌株相比，突變體的促生作用明顯提高，且轉(zhuǎn)入hpaXm基因效果更佳，胚芽、胚根生長(zhǎng)分別提高100.77%、69.14%，為今后微生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。10億CFU/mL HAB-5菌懸液對(duì)番茄種子的生長(zhǎng)具有抑制作用，但隨著濃度的降低，均能對(duì)番茄種子產(chǎn)生促生作用。宋永燕等在研究LM-3對(duì)水稻的促生作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，低濃度拮抗菌無(wú)細(xì)胞濾液對(duì)植物均有促生作用，較高濃度的拮抗菌濾液則出現(xiàn)抑制作用[28]，這與本研究結(jié)論相似。在番茄種子促生試驗(yàn)中，未發(fā)現(xiàn)B3xm、B5xoo突變體菌株菌懸液抑制種子生長(zhǎng)的現(xiàn)象，這可能與harpin蛋白在HAB-5菌株中的表達(dá)有關(guān)，有待開(kāi)展后續(xù)相關(guān)研究，以期為生防菌的實(shí)際應(yīng)用提供依據(jù)。

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