蒙菊（Chrysanthemum mongolicum）再生體系的建立

謝菲　陳茹陽(yáng)　趙惠恩

摘要：以蒙菊的葉片為試驗(yàn)材料，對(duì)蒙菊（Chrysanthemum mongolicum） 再生體系建立技術(shù)進(jìn)行了初步探索。結(jié)果表明，蒙菊葉片愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)以MS+6-BA 2.0 mg/L +2，4-D 0.3 mg/L為最適培養(yǎng)基，出愈率87.50%；愈傷組織分化培養(yǎng)以MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L為最適培養(yǎng)基，分化率為67.50%；生根培養(yǎng)以1/2MS+NAA 0.3 mg/L +蔗糖15 g/L為最適培養(yǎng)基，生根率為92.50%，平均根數(shù)5.33條，移栽成活率77.50%。

關(guān)鍵詞：蒙菊；組織培養(yǎng)；再生體系；葉片；培養(yǎng)基

中圖分類(lèi)號(hào)： S682.1+10.4+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0076-02

收稿日期：2014-12-18

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30970207）。

作者簡(jiǎn)介：謝菲（1990—），女，碩士研究生，主要從事花卉資源育種研究。E-mail： shelffy02@gmail.com。

通信作者：趙惠恩，博士，副教授，主要從事花卉資源育種研究。E-mail：zhaohuien@bjfu.edu.cn。蒙菊（Chrysanthemum mongolicum）是菊科春黃菊族菊屬多年生草本植物。蒙菊從我國(guó)內(nèi)蒙古地區(qū)分布至北極地區(qū)，耐寒性顯著，冬季能耐-40 ℃的低溫。蒙菊生于貧瘠的石質(zhì)山坡和亞高山地帶，海拔1 500～2 500 m[1]，耐旱性較好，可以應(yīng)用于屋頂綠化、荒坡綠化、巖石園綠化等方面。但蒙菊在我國(guó)分布區(qū)狹小，較難采集，引種后越夏困難，不易成活。通過(guò)建立蒙菊的再生體系可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模擴(kuò)繁，保存種質(zhì)資源，提高引種成功率。蒙菊的再生體系研究至今未見(jiàn)報(bào)道，因此，系統(tǒng)深入研究其再生能力及獲得再生植株，建立專(zhuān)門(mén)針對(duì)蒙菊的高效穩(wěn)定的再生體系，可為菊花耐寒基因工程和轉(zhuǎn)基因育種工作提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)，將有效推進(jìn)高等植物抗性生物技術(shù)育種進(jìn)程。本試驗(yàn)研究目的在于探究蒙菊在組織培養(yǎng)過(guò)程中各因素的作用及相互影響，建立出蒙菊的再生體系，為蒙菊的分子生物學(xué)研究、細(xì)胞學(xué)特性和基因工程中遺傳受體系統(tǒng)的建立奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)有利于實(shí)現(xiàn)蒙菊組培苗大規(guī)模的工廠化生產(chǎn)。

1材料與方法

1.1材料

本試驗(yàn)所用外植體為蒙菊組培無(wú)菌苗的葉片。

1.2方法

1.2.1愈傷組織的誘導(dǎo)從生長(zhǎng)健壯的蒙菊組培苗上剪取0.5 cm2的葉片（圖1-A），將葉片接入MS培養(yǎng)基中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑選用6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L），2，4-D（0.1、0.2、0.3 mg/L），NAA濃度為0.01 mg/L [2]，采用2因素3水平完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)[3]，每個(gè)處理重復(fù)3次。30 d后觀察愈傷組織形態(tài)（圖1-B），統(tǒng)計(jì)葉片的出愈率：出愈率=發(fā)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%。

1.2.2愈傷組織分化培養(yǎng)將增殖后的愈傷組織接入分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)其分化出芽點(diǎn)，形成幼小植株（圖1-C）。試驗(yàn)采用2因素3水平的完全試驗(yàn)設(shè)計(jì)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑選用6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L），NAA（0.05、0.10、0.20 mg/L）。每個(gè)處理接種20個(gè)0.5 cm3的愈傷組織，重復(fù)3次。在30 d后統(tǒng)計(jì)分化率，分化率=已分化的愈傷組織/接種愈傷組織總數(shù)×100%。

1.2.3壯苗由于長(zhǎng)期生長(zhǎng)在含有植物激素的培養(yǎng)條件下，繼代培養(yǎng)所得到的部分芽苗形態(tài)細(xì)弱，營(yíng)養(yǎng)不足，為了提高組培苗的生根率，需要將這些組培苗進(jìn)行壯苗培養(yǎng)（圖1-D）。將不足3 cm的芽苗移入MS培養(yǎng)基，含蔗糖35 g/L，培養(yǎng)30 d后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)。

1.2.4生根選擇長(zhǎng)約3 cm健壯的組培無(wú)根苗接入生根培養(yǎng)基中，含15 g/L蔗糖，6 g/L瓊脂，每個(gè)處理接入20個(gè)組培苗，重復(fù)3次。試驗(yàn)采用2因素3水平完全試驗(yàn)設(shè)計(jì)，培養(yǎng)基分別設(shè)為MS、1/2MS、1/4MS，NAA分別為0.1、0.2、0.3 mg/L，分別在20 d后觀察生根情況（圖1-E），統(tǒng)計(jì)生根率和平均根數(shù)。生根率=生根的芽苗數(shù)/接種芽苗總數(shù)×100%；平均根數(shù)=總的根數(shù)/生根的苗數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和DPS（data processing system）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、方差分析與多重比較，對(duì)百分率等數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析時(shí)，先將數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換。2結(jié)果與分析

2.1葉片愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)

在蒙菊葉片的初代培養(yǎng)試驗(yàn)中，接種1周后，葉片開(kāi)始卷曲，在切口邊緣處產(chǎn)生團(tuán)狀愈傷組織，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，愈傷組織的體積逐漸增大。從表1可以看出，A8處理MS+6-BA 2.00 mg/L +2，4-D 0.30 mg/L顯著優(yōu)于其他處理，出愈率87.50%，出愈時(shí)間較短，產(chǎn)生的愈傷組織為綠色，較致密，表面有小突起。A5處理的出愈率僅次于A8，但產(chǎn)生的愈傷組織顏色較淺，產(chǎn)愈量少。愈傷誘導(dǎo)率較低的是A1處理，出愈率42.50%，產(chǎn)生的愈傷組織呈透明狀，含水量較高，質(zhì)地較疏松，在接下來(lái)的試驗(yàn)中幾乎不能分化。

2.2愈傷組織分化試驗(yàn)

對(duì)蒙菊愈傷分化過(guò)程進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)愈傷組織上的突起會(huì)逐漸分化成很多綠色的不定芽。由表2可見(jiàn)，B8處理 MS+6-BA 2.00 mg/L+NAA 0.10 mg/L的分化效果最好，分化率為67.50%，愈傷表面有叢生芽形成。分化效果最差的處理為B6，分化率僅為15.00%，愈傷組織褐化嚴(yán)重。由此可見(jiàn)，褐化現(xiàn)象的防治對(duì)愈傷的增殖和分化有著積極的促進(jìn)作用。

2.3生根培養(yǎng)

無(wú)根苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中1周左右，多數(shù)處理中的蒙菊幼苗開(kāi)始生根，根系呈輻射狀，有白色、淺綠色、褐色幾種不同類(lèi)型。從表3可以看出，C6處理1/2MS+NAA 0.30 mg/L顯著優(yōu)于其他處理，生根率為92.50%，平均根數(shù)5.33條，根系健壯，白色，生長(zhǎng)速度較快。生根情況較差的為C1處理，生根率為32.5%，根系細(xì)弱，呈淺綠色，部分根尖變褐，可能是由于培養(yǎng)基中大量元素濃度較高，對(duì)根系發(fā)育產(chǎn)生抑制作用。

在生根培養(yǎng)中觀察到，當(dāng)NAA濃度過(guò)高時(shí)，根部愈傷組織較多，形成的根短粗；當(dāng)NAA濃度較高時(shí)，根部愈傷組織不多，形成的根輻射狀，粗細(xì)適中，根毛較多；當(dāng)NAA濃度較低時(shí)，愈傷組織較少，形成的根細(xì)長(zhǎng)，數(shù)量較多，根毛較少。

2.4煉苗與移栽

首先選擇較為健壯、高7 cm左右、根長(zhǎng)1～3 cm的組培苗進(jìn)行馴化。在出瓶之前，將培養(yǎng)容器置于較強(qiáng)光下，打開(kāi)瓶蓋增加通氣，同時(shí)在培養(yǎng)基上加入1層無(wú)菌水。在開(kāi)口3 d后進(jìn)行組培苗的出瓶移栽。先將試管苗在40 ℃左右的溫水中洗去黏附于組培苗根部的培養(yǎng)基，再放入1% KMnO4 溶液中浸泡5 min，沖洗干凈，栽入經(jīng)過(guò)高溫滅菌的基質(zhì)中，基質(zhì)選用1/2珍珠巖+1/2草炭。

將移栽后的苗置于人工氣候箱1周，調(diào)節(jié)濕度保持在70%以上、溫度20 ℃左右，待生長(zhǎng)穩(wěn)定后放到陽(yáng)光下讓其生長(zhǎng)[4]。每次移栽30株苗，重復(fù)3次試驗(yàn)，30 d后觀察（圖1-F），統(tǒng)計(jì)移栽成活率為87.50%。

在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)形成新根的狀態(tài)與煉苗的成活率有著密切的關(guān)系。當(dāng)根健壯、根毛較多、整體呈白色、長(zhǎng)度在1～3 cm、直徑1 mm左右時(shí)煉苗成活率最高。而根細(xì)長(zhǎng)、根數(shù)較多、根毛很少、根末端呈褐色、長(zhǎng)度大于3 cm的植株煉苗成活較低。所以，選擇根系最適的幼苗進(jìn)行煉苗可以提高成活率。

3討論與結(jié)論

研究表明，使用不同種類(lèi)、不同濃度和不同比例關(guān)系的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程、分化的方向和器官發(fā)生。當(dāng)細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素的比值高時(shí)，利于芽的分化；而細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素的比值低時(shí)，有利于根的形成；當(dāng)二者比值適中時(shí)，則愈傷組織處于旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài)，沒(méi)有器官分化[5]。在蒙菊的愈傷分化培養(yǎng)中采用 MS+NAA 0.20 mg/L+

6-BA 0.50 mg/L處理的培養(yǎng)基有少數(shù)愈傷組織出現(xiàn)先分化出根的現(xiàn)象，可能是由于6-BA/NAA的比值較低，促使根器官先發(fā)生。

本次試驗(yàn)采用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有6-BA、NAA、2，4-D 3種。試驗(yàn)結(jié)果表明，在初代培養(yǎng)中，適當(dāng)添加6-BA、NAA、2，4-D可以有效促進(jìn)芽的萌動(dòng)和愈傷組織的誘導(dǎo)。其中2，4-D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有著明顯的促進(jìn)作用，但用量過(guò)高會(huì)產(chǎn)生毒害作用，使形態(tài)畸變，誘導(dǎo)率降低。在繼代培養(yǎng)中6-BA對(duì)不定芽的增殖有較好的促進(jìn)效果，但在試驗(yàn)觀察中發(fā)現(xiàn)高濃度的6-BA培養(yǎng)基中長(zhǎng)期培養(yǎng)會(huì)出現(xiàn)較多玻璃化現(xiàn)象。在生根培養(yǎng)中，NAA的運(yùn)用有利于植株根系萌動(dòng)，當(dāng)NAA濃度較高時(shí)，形成的根粗壯，根毛較多；當(dāng)NAA濃度較低時(shí)，形成的根細(xì)長(zhǎng)、數(shù)量較多、根毛較少。

在本試驗(yàn)中，出現(xiàn)了葉片誘導(dǎo)時(shí)出愈率較高，但愈傷組織增殖系數(shù)不高、分化較少的現(xiàn)象，即使愈傷組織能分化出少量芽，也會(huì)因培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)無(wú)營(yíng)養(yǎng)而生長(zhǎng)緩慢甚至死掉。分析原因，一方面可能是初代培養(yǎng)使用的激素濃度不當(dāng)，雖然出愈率較高，但所誘導(dǎo)的愈傷組織大多數(shù)是比較致密的愈傷組織，很少有粗顆粒狀突起，難以增殖分化成芽；另一方面可能是由于植物本身的生理狀態(tài)和遺傳特性等因素造成的愈傷組織生長(zhǎng)情況不佳[6]；此外，光照、溫度等培養(yǎng)條件不適宜都可能是造成愈傷組織難分化成芽及分化的芽不易成活的因素。具體的愈傷組織分化成苗較難的原因還有待于進(jìn)一步深入研究。

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