骨髓單核細胞移植對潰瘍性結(jié)腸炎炎性因子IL-1和MFG-E8變化的研究①

苗秋實,鮑秀琦,姜　威,李　璇,韓宇鵬

(1.佳木斯大學研究生學院,黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

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骨髓單核細胞移植對潰瘍性結(jié)腸炎炎性因子IL-1和MFG-E8變化的研究①

苗秋實1,鮑秀琦2,姜威2,李璇1,韓宇鵬1

(1.佳木斯大學研究生學院,黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：探討骨髓單核干細胞移植對潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用。方法：建立潰瘍性結(jié)腸炎的動物實驗，采用骨髓單核干細胞移植技術(shù)，移植后在不同的時間段取結(jié)腸組織，檢測IL-1和MFG-E8的變化。 結(jié)果：移植后7d，移植組的IL-1表達水平與PBS組、對照組相比，明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；移植后14d，移植組的IL-1表達水平與PBS組、對照組相比，明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與移植后7d的IL-1表達水平相比，差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；移植后7d，移植組的MFG-E8表達水平與PBS組、對照組相比，明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);移植后14d，移植組的MFG-E8表達水平與PBS組、對照組相比，明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與移植后7d的MFG-E8表達水平相比，差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論：骨髓單核細胞移植可降低潰瘍性結(jié)腸炎炎性因子的水平，對大鼠體內(nèi)的炎性環(huán)境帶來一定的緩解作用。

關(guān)鍵詞:骨髓單核細胞移植；潰瘍性結(jié)腸炎；炎性因子；異常表達

目前研究顯示UC患者存在自身免疫功能失衡，自身免疫是炎性病變，由自身免疫介導(dǎo)[1]，大量炎性介質(zhì)和細胞因子聚集于腸黏膜引起腸黏膜的炎性反應(yīng)[2]，近年來隨著干細胞移植研究的不斷深入，潰瘍性結(jié)腸炎的治療看到了更大的前景[3]。利用干細胞移植治療UC，目前已經(jīng)在國內(nèi)外實驗中成為熱點，已有研究證實MSCs經(jīng)尾靜脈移植入大鼠UC模型體內(nèi)后，可通過血液循環(huán)遷移至受損腸道。本研究建立潰瘍性結(jié)腸炎的動物實驗，采用骨髓單核干細胞移植技術(shù)，移植后在不同的時間段取結(jié)腸組織，檢測IL-1和MFG-E8的變化，旨在探討骨髓單核干細胞移植對潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用。

1　材料和方法

1.1材料

健康成年SD大鼠，雄性，體重250g；弗氏完全佐劑(Sigma,美國)；PBS緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)；雙縮脲法蛋白定量試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

選擇45只健康清潔級SD大鼠45只，均為6～8周齡，將這些大鼠隨機分為3組，每組15只，分別為移植組、PBS組和正常對照組。要對移植組、PBS組大鼠進行模型制備，利用免疫復(fù)合法來進行UC模型的制造。

分離出家兔結(jié)腸的黏膜層，低溫離心，取上清液，并使用雙縮脲法檢測其蛋白含量(20mg/mL)，加入等量弗氏完全佐劑制成1:1抗原乳化液。間隔14d，將0.4mL抗原乳化劑在2次在大鼠腹股溝、足跖處注射，灌腸后大鼠保持平躺至自然清醒[3]。造模24h后，在移植組大鼠的尾靜脈處注入細胞懸液，然后對大鼠的精神、進食和活動情況進行觀察，并在細胞移植后的3d、7d、14d，分別取3組大鼠中的5只進行處死，對結(jié)腸部分進行剖取，并剪開縱行，對其進行PBS沖洗，然后對結(jié)腸的形態(tài)，黏膜損傷進行觀察。對結(jié)腸組織進行常規(guī)石蠟包埋，進行連續(xù)切片和HE染色，在光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)學變化。提取腸黏膜固有層單個核細胞，Western blotting檢測檢測腸黏膜細胞因子水平，用洗片機洗片，圖像分析軟件測其灰度值，與內(nèi)參的灰度值比較為其蛋白的相對含量。

1.3統(tǒng)計學方法

2　結(jié)果

2.1三組不同階段的IL-1表達水平比較

移植后7d，移植組的IL-1表達水平與PBS組、對照組相比，明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);移植后14d，移植組的IL-1表達水平與PBS組、對照組相比，明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與移植后7d的IL-1表達水平相比，差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　三組不同階段IL-1含量比較

注：與PBS組相比，△P<0.05。與對照組相比，﹡P<0.05。與移植后7d相比，●P<0.05。

2.2移植術(shù)前后MFG-E8表達水平比較

移植后7d，移植組的MFG-E8表達水平與PBS組、對照組相比，明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；移植后14d，移植組的MFG-E8表達水平與PBS組、對照組相比，明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與移植后7d的MFG-E8表達水平相比，差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；見表2。

表2　三組不同階段MFG-E8含量比較

注：與PBS組相比，△P<0.05。與對照組相比，﹡P<0.05。與移植后7d相比，●P<0.05。

3　討論

骨髓間充質(zhì)干細胞能分泌多種細胞因子，如：血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor VEGF)、集落刺激因子(Clone Stimulating factor,CSF)、干細胞因子(Stem Cell Factor，SCF)、間質(zhì)細胞源性因子1(Stromal Cell．Derived Factor-I，SDF-1)、胰島素樣生長因子(insulin like growth factor，IGF)、肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)、堿性纖維母細胞因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)等[5]，其中部組織發(fā)生炎性反應(yīng)時，VEGF表達增加，局部注射SDF-1將進一步上調(diào)損傷組織內(nèi)源性VEGF的表達，SDF-1與蛋白多糖結(jié)合后對造血前體細胞移動的誘導(dǎo)作用增強，且這種作用具有高度的特異性。上述因子已被證實有促進血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞增殖，發(fā)揮促炎性的作用[6]。干細胞移植后，移植區(qū)內(nèi)這些細胞因子的含量明顯增加，他們通過自分泌或旁分泌的方式，在改善宿主的炎性反應(yīng)方面起著十分重要的作用。過往研究揭示，MSC的這幾種作用途徑在治療中可能同時存在，當宿主發(fā)生炎性反應(yīng)時[7~9]，細胞內(nèi)可能分泌產(chǎn)生大量有利于細胞再生的物質(zhì)和信號，刺激植入的干細胞分化為炎癥免疫細胞，改善炎性反應(yīng)。環(huán)境中的調(diào)節(jié)信號系統(tǒng)通過與基因簇的相互作用，決定了特定基因的表達，并提供定向分化所需的電、機械刺激及所需的因子。本研究通過建立潰瘍性結(jié)腸炎的動物實驗，采用骨髓單核干細胞移植技術(shù)，移植后在不同的時間段取結(jié)腸組織，檢測IL-1和MFG-E8的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后3d，移植組的MFG-E8表達水平與PBS組、對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)； 移植后7d、移植后14d，移植組的MFG-E8表達水平與PBS組、對照組相比，明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義。本研究的結(jié)果提示骨髓單核細胞移植可降低潰瘍性結(jié)腸炎炎性因子的水平，對大鼠體內(nèi)的炎性環(huán)境帶來一定的緩解作用。

參考文獻:

[1]顏玉，韓桂華，陳剛.自身免疫性胰腺炎1例[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2013,36(05):109-110

[2]姜威,顏玉,鄭強,等.潰瘍性結(jié)腸炎Toll樣受體表達和NF-kB變化及益生菌的作用研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2013,36(05):34-35

[3]BaumgartDC,Carding SR.Inflammatory bowel disease:cause and immunobiology[J]. Lancet，2012,369(9573):1627-l640

[4]Collins P,Rhodes J.Ulcerative colitis:diagnosis and management[J].BMJ，2006, 3(7563): 340-343

[5]谷涌泉,張建,齊立行,等.骨髓動員刺激后自體骨髓源單個核細胞移植治療下肢缺血的初步臨床研究[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2006,20(10):1017-1020

[6]Izawa H, Kondo T, Usui A.Clinical protocol for angiogenesis by intramyocardial injection of autologous bone marrow mononuclear cells in patients with severe coronary artery disease[J].Circ J，2006,70(9):1180-1183

[7]Saleh A Naser，Melissa Arce，Anam Khaja，et al.Role of ATG16L,NOD2 and IL23R in Crohn's disease pathogenesis[J].World Journal of Gastroenterology,2012,5(2):23-24

[8]張榕,施茵,關(guān)鑫.GH-SOCS2-IGF-1軸對潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜屏障的影響[J].世界華人消化雜志,2010,23(8):112-113

The effects of bone marrow mononuclear cell transplantation

on ulcerativecolitis inflammatory cytokines (IL - 1 and MFG - E8)

MIAOQiu-shi1，BAOXiu-qi2，JIANGWei2，LIXuan1，HANYu-peng1

(1. Department of Clinical Medicine Major, Jiamusi University Graduate School, Jiamusi 154007; 2. Department of Digestion, the First Hospital Affiliated to Jiamusi University, Jiamusi 154003, China)

Abstract：Objective:To investigate bone marrow mononuclaer stem cell transplantation for the treatment of ulcerative colitis. Methods:The ulcerative colitis animal experiments were established by using bone marrow mononuclear stem cell transplant technology,in different time periods after transplantation in colon tissue,detection MFG-E8 and IL-1 change. Results:7d after transplantation, the expression level of IL - 1 in transplantation group compared with the PBS group and the control group, a significant decrease, the difference was statistically significant(P<0.05);14 d after transplantation, the expression level of IL -1 in transplantation group compared with the PBS group and the control group, a significant decrease, the difference was statistically significant(P<0.05),and the expression level of IL - 1 in 7d after transp lantation, compared differences have statistical significance(P<0.05);7d after transplantation, the expression level of MFG - E8 in transplantation group compared with the PBS group and the control group, a significant decrease, the difference was statistically significant(P<0.05);14d after transplantation, the expression level of MFG - E8 in transplantation group compared with the PBS group and the control group, a significant decrease, the difference was statistically significant(P<0.05),and the expression level of MFG - E8 in 7 d after transplantation, compared differences have statistical significance,P<0.05).Conclusion:bone marrow mononuclear cell transplantation can reduce the levels of inflammatory cytokines ulcerative colitis, the rat inflammatory environment bring some relief.

Key words:bone marrow mononuclear cell transplantation；ulcerative colitis；inflammatory factors；abnormal expression

中圖分類號：R574.62

文獻標識碼：B

文章編號：1008-0104(2015)06-0043-03

基金項目：①佳木斯大學研究生科科技創(chuàng)新項目,編號：LM2014-016。

作者簡介：苗秋實(1986~)女，天津人，在讀碩士研究生。

通訊作者：鮑秀琦(1963~)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：674399943@qq.com。

(收稿日期：2015-05-07)