眼底熒光素血管造影在小鼠氧誘導視網(wǎng)膜病變中的應用評價

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·實驗研究·

眼底熒光素血管造影在小鼠氧誘導視網(wǎng)膜病變中的應用評價

李蓉1，常遠2

Evaluation of fundus fluorescein angiography in mice with oxygen-induced retinopathy

Citation:Li R, Chang Y.Evaluation of fundus fluorescein angiography in mice with oxygen-induced retinopathy.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(1):41-44

摘要

目的：在小鼠氧誘導視網(wǎng)膜病變模型(oxygen-induced retinopathy，OIR)中評價眼底熒光素血管造影(fundus fluorescein angiography，F(xiàn)FA)的應用價值。

方法：將前期實驗證實視網(wǎng)膜病變嚴重程度有明顯差異的兩組(B組>A組)各12只新生幼鼠于出生后第7d置于75%濃度氧環(huán)境中，第12d時返回正?？諝猸h(huán)境中飼養(yǎng)。第17d時將A組和B組的幼鼠均隨機分配，分別進行FFA檢查或高分子量FITC-Dextran灌注結合視網(wǎng)膜鋪片檢查，即每種檢查方法納入兩組幼鼠各6只，利用圖像分析軟件對視網(wǎng)膜無灌注區(qū)進行定量分析和比較。

結果：FFA結合圖像分析軟件能對視網(wǎng)膜無灌注區(qū)進行定量分析，與FITC-Dextran灌注結合視網(wǎng)膜鋪片的測量結果有良好的可比性，兩種方法得到的結果無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

結論：FFA結合圖像定量分析在小鼠OIR模型的血管病變評價中具有一定的實用價值。

關鍵詞：氧誘導視網(wǎng)膜病變；眼底熒光素血管造影；血管病變；定量分析

引用：李蓉，常遠.眼底熒光素血管造影在小鼠氧誘導視網(wǎng)膜病變中的應用評價.國際眼科雜志2016;16(1):41-44

0引言

通過對動物品系及吸氧濃度等關鍵環(huán)節(jié)的逐步改良，20世紀90年代由Smith等[1]學者建立的小鼠氧誘導視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy，OIR)模型較為穩(wěn)定，可重復性好，已被廣泛用于早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)的基礎研究。OIR的成模機制是將新生小鼠置入高氧環(huán)境，其發(fā)育不成熟的視網(wǎng)膜血管發(fā)生痙攣收縮、閉塞，在后極部形成無灌注區(qū)；返回常氧環(huán)境后，視網(wǎng)膜處于相對缺氧狀態(tài)，引起血管內皮細胞增殖，最終形成病理性新生血管。此新生血管反應可較好地模擬一些視網(wǎng)膜疾病的病理過程，因此，OIR小鼠模型也成為糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等缺血性視網(wǎng)膜病變的重要研究平臺。

對視網(wǎng)膜病變能夠進行定量分析是OIR模型成功應用于ROP病理機制和治療方法研究領域的關鍵。目前對OIR視網(wǎng)膜血管病變的觀察方法主要包括眼底熒光素血管造影(fundus fluorescein angiography，F(xiàn)FA)、熒光素異硫氰酸葡聚糖(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)-Dextran灌注聯(lián)合視網(wǎng)膜鋪片、視網(wǎng)膜鋪片熒光標記的Lectin血管染色等。FFA是臨床觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)的重要手段，因缺乏定量評價指標，因此在OIR模型中的應用相對少于以上另兩種方法。本研究探索了FFA應用于OIR的一種病變定量分析方法，旨在為此類基礎實驗提供一種新的評價手段。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1動物及分組由西安醫(yī)學院動物實驗中心提供健康C57BL/6J孕鼠。在光照/暗室周期12h/12h、背景噪音40±10db、溫度20℃～24℃、自由飲水和進食的條件下飼養(yǎng)。實驗動物及條件符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。將24只小鼠分為A組和B組，每組各12只，根據(jù)前期實驗結果[2]，已知B組的OIR病變比A組嚴重。A組和B組均建立OIR模型，將每組的小鼠隨機分配接受FFA檢查或FITC-Dextran灌注。

1.1.2 主要試劑和儀器體式顯微鏡(德國Zeiss公司)，激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)，光學顯微鏡(德國Leica公司)，F(xiàn)ITC-Dextran(分子量為2 000 000Da，美國Sigma公司)，共焦激光眼底血管造影儀(德國Heidelberg公司)。

1.2方法

1.2.1 OIR模型建立將C57BL/6J新生幼鼠及哺乳母鼠于出生后第7d(P7)置于透明的密閉動物氧箱飼養(yǎng)，箱體內氧分壓維持為(75±1)%，氧氣流量控制在1.5L/min，期間采用氧氣分析儀監(jiān)測容器內的氧分壓?？刂剖覝卦?22±2)℃。正常日光照明，每2d打開氧箱更換墊料，加飼料及更換飲用水。出生后第12d(P12)時取出幼鼠及母鼠置正?？諝庵酗曫B(yǎng)5d。晝夜時間交替維持12h/12h。

1.2.2 FFA檢查及結果判定小鼠于P17時行FFA檢查。腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉后散瞳，將20%熒光素鈉注射液稀釋至2%，腹腔注射0.15mL后立即開始計時，3min時開始用共焦激光眼底血管造影儀記錄造影的影像，觀察時間不少于注射后6～8min。盡可能獲取全視網(wǎng)膜圖像，在拼圖狀態(tài)下由對實驗分組不知情的人員利用Photoshop CS3軟件對視網(wǎng)膜無灌注區(qū)的像素進行測量，利用一個采圖視野(一個圓的面積)作為基準區(qū)像素，設定視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積比例=無灌注區(qū)像素/基準區(qū)像素(具體方法見結果部分)。A、B兩組各選擇6只小鼠用于統(tǒng)計分析。

1.2.3 FITC-Dextran血管灌注及視網(wǎng)膜鋪片經(jīng)腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉P17小鼠，待疼痛反射消失后固定四肢，眼科剪打開胸腔，暴露心臟，頭皮針針頭自左心尖插入左心室并推入主動脈，小心剪開右心耳，緩慢推注0.9%的生理鹽水約10mL，觀察雙肺無膨脹，口鼻無出血或水，肝臟等組織逐漸變?yōu)榘咨?。灌注分子?000000Da的FITC-Dextran 1mL(50mg/mL，溶于PBS中)，肝臟、結膜等組織變?yōu)辄S綠色為灌注正確。立即摘除眼球，在4%多聚甲醛中固定3h。在體式顯微鏡下沿角鞏膜緣剪下角膜及虹膜組織，娩出晶狀體和玻璃體，將視網(wǎng)膜感覺層與色素上皮層分離，去除鞏膜，將視網(wǎng)膜感覺層在PBS液中漂洗3次，清除殘存的玻璃體，以視乳頭為中心，將杯狀視網(wǎng)膜放射狀剪為4瓣，平鋪于載玻片上，滴少量甘油后加蓋玻片，激光共聚焦顯微鏡觀察和照相記錄。參照Connor等[3]推薦的方法，利用Photoshop CS3軟件勾畫視網(wǎng)膜無血管區(qū)及全視網(wǎng)膜的邊界，測量無血管區(qū)及視網(wǎng)膜總面積(像素)，最后計算無血管區(qū)面積比例=無血管區(qū)像素/視網(wǎng)膜總像素。A、B兩組各選擇6只小鼠用于統(tǒng)計分析。

圖1兩組小鼠FITC-Dxtran灌注、視網(wǎng)膜鋪片代表圖A：A組；B：B組。

圖2兩組小鼠FITC-Dxtran灌注、視網(wǎng)膜鋪片無灌注區(qū)面積統(tǒng)計分析圖aP<0.05vsA組。

統(tǒng)計學分析：實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，兩組計量資料比較采用Student’s-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積——FITC-Dextran法FITC-Dextran灌注、視網(wǎng)膜鋪片結合經(jīng)典的測量和統(tǒng)計分析證實，B組小鼠在P17時，視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積比為0.63±0.02，A組小鼠為0.43±0.01，兩組相比，B組>A組，差異均有統(tǒng)計學意義(t=22.17，P<0.05，圖1、2)。

2.2視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積——FFA法采用上述自創(chuàng)的評估方法，對FFA的圖像進行軟件處理分析，證實B組小鼠在P17時，視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積比為0.65±0.02，A組小鼠為0.42±0.03，兩組相比，B組>A組，差異均有統(tǒng)計學意義(t=15.30，P<0.05，圖3、4)，統(tǒng)計結果與FITC-Dextran灌注、視網(wǎng)膜鋪片的分析結果趨于一致。

圖3兩組小鼠FFA法視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積比較A1：A組視網(wǎng)膜代表圖；A2，A3：A組測量步驟；B1：B組視網(wǎng)膜代表圖；B2，B3：B組測量步驟。

2.3 FITC-Dextran法與FFA法之間的比較對采用兩種實驗方法獲得的A組的視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積的結果進行統(tǒng)計學比較，組間差異無統(tǒng)計學意義(t=-1.70，P>0.05)；同樣，對兩種方法獲得的B組測量結果進行比較，組間差異也無統(tǒng)計學意義(t=0.61，P>0.05)。提示FFA結合圖像分析軟件對視網(wǎng)膜無灌注區(qū)的定量分析結果與FITC-Dextran灌注結合視網(wǎng)膜鋪片的測量結果有良好的可比性。

3討論

FFA是將能產(chǎn)生熒光效應的染料快速注入血管，同時應用加有濾色片的眼底鏡或眼底照相機進行觀察或照像的一種檢查法。由于染料隨血流運行時可動態(tài)地勾劃出血管的形態(tài)，加上熒光現(xiàn)象，提高了血管的對比度和可見性，使一些細微的血管變化得以辨認，而且利用熒光眼底照相機連續(xù)拍照，使眼底檢查結果更客觀、準確和動態(tài)，從而為眼底病的臨床診斷、療效觀察、預后評價以及探討發(fā)病機制等提供有價值的依據(jù)。近年來，F(xiàn)FA在ROP的篩查中也得到應用。嬰幼兒眼底照相系統(tǒng)RetCam輔助FFA檢查可發(fā)現(xiàn)間接檢眼鏡不能發(fā)現(xiàn)的一些細微的血管病理學改變，如毛細血管擴張、無灌注區(qū)大小和新生血管滲漏情況等。因此，F(xiàn)FA是更為客觀地評價ROP疾病分期和分區(qū)的方法。另外，在FFA上還可以清晰地觀察到病變的消退，對于判斷ROP的預后也十分重要[4-5]。

在OIR動物模型中，F(xiàn)FA也具有很高的應用價值。它可以在活體狀態(tài)下觀察到擴張和迂曲的視網(wǎng)膜血管以及無灌注區(qū)，對視網(wǎng)膜血管病變可進行動態(tài)觀察[6-7]。但是，由于對周邊視網(wǎng)膜觀察困難、眼底照相技術要求較高和缺乏精準的定量標準等，在基礎研究中FFA有被FITC-Dextran灌注[8]和Lectin視網(wǎng)膜血管染色取代的趨勢。雖然目前這些觀察和檢測方法在OIR模型中使用廣泛，然而它們也存在一些不足與局限性。例如，F(xiàn)ITC-Dextran灌注需要多次練習，初學者容易因操作失誤或不當造成視網(wǎng)膜血管的灌注不良，從而造成無灌注區(qū)的假陰性染色結果；同時灌注染料FITC-Dextran也十分昂貴，視網(wǎng)膜鋪片需要犧牲大量動物，因此，實驗所需動物樣本量較大時，一些經(jīng)費不足的實驗室難以承受。Lectin血管染色是對視網(wǎng)膜表面的所有血管組織進行染色，在我們以往的實驗中發(fā)現(xiàn)Lectin染色的視網(wǎng)膜無血管區(qū)面積較FITC-Dextran灌注小，且新生血管團的數(shù)量也有所增加，表明在染色過程中Lectin對已經(jīng)閉塞的血管及新生血管團的假陽性染色較多，且染色背景較強，結果可信度稍差。

圖4兩組小鼠FFA法視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積統(tǒng)計分析圖aP<0.05vsA組。

在小鼠的OIR模型中，視網(wǎng)膜血管無灌注區(qū)集中于視盤周圍，新生血管主要集中于無灌注區(qū)周圍。在小鼠出生后17d時，視網(wǎng)膜無灌注區(qū)及新生血管面積達到最大化[1,3]。我們應用FFA對小鼠OIR進行觀察，采用廣角鏡頭可以完全捕獲視網(wǎng)膜中心的無灌注區(qū)。運用軟件拼圖后測量無灌注區(qū)像素，利用無灌注區(qū)像素與一個造影采圖視野的像素的比值就可以計算出無灌注區(qū)面積的相對大小。即使每只小鼠或者一只小鼠不同發(fā)育階段的視網(wǎng)膜大小不同，有時不能獲得整個視網(wǎng)膜的圖像，采用上述方法，我們也可以準確計算出視網(wǎng)膜血管無灌注區(qū)的相對面積，從而對不同組別的實驗結果進行比較。

在本研究中，A和B兩組小鼠的FFA中視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積統(tǒng)計結果與FITC-Dextran取得的結果趨于一致，說明在OIR模型中應用這兩種血管灌注方法均較為可靠。兩種方法間的微小差異可能與小鼠的個體差異、實驗操作不同等有關。從倫理學和經(jīng)濟學角度上講，減少使用實驗動物的數(shù)量很有必要。FFA能夠在活體上進行觀察和測量，所用熒光素鈉價格相對低廉，不僅能動態(tài)觀察每只動物的視網(wǎng)膜血管變化情況，減少個體差異帶來的實驗誤差，還能節(jié)省實驗費用。因此，在有條件的單位應用FFA結合圖像定量分析對OIR病變進行評估也是一種行之有效的方法。

參考文獻

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3 Connor KM，Krah NM，Dennison RJ，etal. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse:a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.NatProtoc2009;4(11):1565-1573

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Rong Li1, Yuan Chang2

Foundation items:Natural Science Foundation of Shaanxi Provincial Science and Technology Office (No. 2013JC2-19);Natural Science Foundation of Shaanxi Provincial Education Department(No.15JK1624);the Research Foundation of the First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University(No.XYFY2013-04)

1Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University, Xi’an 710077, Shaanxi Province, China;2Department of Ophthalmology and Otorhinolaryngology, Xi’an Medical University, Xi’an 710021, Shaanxi Province, China

Correspondence to:Rong Li. Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University, Xi’an 710077, Shaanxi Province, China.rechelrong198222@163.com

Received：2015-06-17Accepted：2015-12-12

Abstract

?AIM:To investigate avasculopathy-evaluating method using fundus fluorescein angiography (FFA) in mice with oxygen-induced retinopathy (OIR).

?METHODS:OIR model was induced by exposure of mice from groups A and B (the retinopathy was known to be more severe in group B than that in group A by previous research) to high oxygen (75%) from postnatal day 7 (P7) to P12 (n=12 for each group) and returned to normal environment at P12. On P17, the mice from both groups were randomly assigned to accept FFA or high molecular weight fluorescein isothiocyanate dextran (FITC-Dextran) perfusion combined with stretched preparation of retina(each method involved 6 pups from each group). The retinal non-perfused areas were quantified and compared by using image analysis software.

?RESULTS: FFA combined with image analysis software was able to quantify the retinal non-perfused areas, which was comparable to the results analyzed by FITC-Dextran perfusion combined with stretched preparation of retina. No statistical difference was found between the results obtained by the two methods (P>0.05).

?CONCLUSION:FFA combined with image quantification analysis can be used in retinalvasculopathy evaluation in mouse OIR model.

KEYWORDS:?oxygen-induced retinopathy；fundus fluorescein angiography； vasculopathy；quantification analysis

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.1.10

收稿日期：2015-06-17 修回日期： 2015-12-12

通訊作者：李蓉.rechelrong198222@163.com

作者簡介：李蓉，畢業(yè)于第四軍醫(yī)大學，眼科學博士，副主任醫(yī)師，講師，眼科主任，研究方向：視網(wǎng)膜病。

基金項目：陜西省科技廳自然科學基金項目(No.2013JC2-19)；陜西省教育廳自然科學基金項目(No.15JK1624)；西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院自然科學基金(No.XYFY2013-04)
作者單位：`1(710077)中國陜西省西安市，西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院眼科；`2(710021)中國陜西省西安市，西安醫(yī)學院五官科教研室