色素上皮衍生因子對人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞增殖及凋亡的影響

楊福堂，李燕，王淑云(聊城市第二人民醫(yī)院，山東聊城252601)

色素上皮衍生因子對人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞增殖及凋亡的影響

楊福堂，李燕，王淑云
(聊城市第二人民醫(yī)院，山東聊城252601)

摘要:目的觀察色素上皮衍生因子( PEDF)對人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞增殖及凋亡的影響，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法將對數(shù)生長期的人肺腺癌細(xì)胞株SPC-A-1隨機分為觀察組和對照組，觀察組分別加入終濃度為180、360、720 nmol/L的PEDF處理24、48、72 h，對照組不添加PEDF。采用MMT法檢測兩組細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果同一時間點，觀察組不同濃度PEDF細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率均高于對照組( P均＜0.05)。隨著PEDF作用時間的延長及濃度的增加，觀察組細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率均逐漸增加( P均＜0.05) ;但干預(yù)24 h時，觀察組不同濃度PEDF細(xì)胞凋亡率比較，P均＞0.05。結(jié)論PEDF能抑制人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞增殖，并促進其凋亡。

關(guān)鍵詞:肺腫瘤;肺腺癌;色素上皮衍生因子;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

肺癌是臨床常見惡性腫瘤，5年生存率不到15%，腺癌是其主要組織學(xué)類型［1］。色素上皮衍生因子( PEDF)屬于絲氨酸蛋白酶超基因家族，具有抑制新生血管形成及腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移的作用，其在肺癌各組織學(xué)類型細(xì)胞株中均有表達(dá)［2～4］。2013 年6月～2014年9月，我們觀察了PEDF對人肺腺

癌SPC-A-1細(xì)胞增殖及凋亡的影響，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料人肺腺癌細(xì)胞株SPC-A-1購自上海拜力生物科技有限公司，F(xiàn)BS、DMEM/F12培養(yǎng)液購自北京百奧森泰生物技術(shù)有限公司，胰酶、四甲基偶氮唑鹽、二甲基亞砜購自美國Sigma公司，PEDF蛋白購自美國Hyclone公司。CO2培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司，酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司，CytoFLEX流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞株SPC-A-1置于含100 mL/L FBS及2.5 mmol/L谷氨酰胺的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2細(xì)胞培育箱中常規(guī)無菌培養(yǎng)。

1.3 PEDF對SPC-A-1細(xì)胞增殖抑制作用的觀察

將對數(shù)生長期的SPC-A-1細(xì)胞隨機分為觀察組和對照組。采用胰酶消化后離心制備單細(xì)胞懸液，以每孔5×104/mL接種在96孔板中，加入DMEM/F12培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱過夜。細(xì)胞貼壁后，觀察組分別加入終濃度為180、360、720 nmol/L的PEDF，對照組不添加PEDF，觀察組每個濃度及對照組均設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)24、48、72 h時分別加入10 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;出現(xiàn)結(jié)晶后吸去培養(yǎng)液，加入150 μL二甲基亞砜，搖床震蕩10 min;待結(jié)晶溶解后，使用酶標(biāo)儀于570 nm波長處檢測各組光密度( OD)值，重復(fù)3次。增殖抑制率= ( 1－OD觀察組/OD對照組)×100%［5］。

1.4 PEDF對SPC-A-1細(xì)胞凋亡作用的觀察取對數(shù)生長期的SPC-A-1細(xì)胞，采用胰酶消化后以2 ×106/mL密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁生長后，吸去上清液，將細(xì)胞隨機分為兩組。觀察組分別加入終濃度為180、360、720 nmol/L的PEDF，對照組不添加PEDF;觀察組每個濃度及對照組均設(shè)5個復(fù)孔。兩組培養(yǎng)24、48、72 h時分別用PBS清洗，再次消化后室溫孵育48 h，收集兩組細(xì)胞，70%乙醇固定30 min; PBS沖洗后加入5 μL Annexin V-FITC 及10 μL PI溶液混勻，置于流式管中，室溫避光染色30 min;使用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，多組間比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組細(xì)胞增殖抑制率比較同一時間點，觀察組的細(xì)胞增殖抑制率均高于對照組( P均＜0.05) ;隨著PEDF作用時間的延長及濃度的增加，觀察組細(xì)胞增殖抑制率均逐漸增加( P均＜0.05)。

表1　各組培養(yǎng)24、48、72 h時細(xì)胞增殖抑制率比較(珔x±s)

2.2兩組細(xì)胞凋亡率比較同一時間點，觀察組不同濃度PEDF細(xì)胞凋亡率均高于對照組( P均＜0.05) ;隨著PEDF作用時間的延長及濃度的增加觀察組細(xì)胞凋亡率均逐漸增加( P均＜0.05)，但干預(yù)24 h時，觀察組不同濃度PEDF細(xì)胞凋亡率比較，P均＞0.05。

表2　各組培養(yǎng)24、48、72 h時細(xì)胞凋亡率比較(珔x±s)

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)，抑制血管增生可控制腫瘤的發(fā)展［6］。血管增生通過內(nèi)皮細(xì)胞遷移及增殖完成，為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng);同時，血管增生刺激因子與抑制因子平衡紊亂，導(dǎo)致新生血管出現(xiàn)［7］。腫瘤細(xì)胞的快速成長有賴于新生血管的形成，并通過新生血管形成腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移途徑［8］。PEDF是目前發(fā)現(xiàn)的最強的血管增生抑制因子，對肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤均有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，PEDF通過Fas通路上調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)，并激活胱天蛋白酶信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［9］;此外，PEDF可抑制毛細(xì)血管形成，阻礙內(nèi)皮細(xì)胞遷移［10］。PEDF低表達(dá)的肺癌細(xì)胞更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且PEDF表達(dá)水平與肺癌分化程度、臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此檢測PEDF有助于判斷肺癌病變程度［11］He等［7］研究發(fā)現(xiàn)，腺病毒介導(dǎo)的PEDF表達(dá)可抑制Lewis肺癌的生長。

本研究發(fā)現(xiàn)，PEDF可抑制人肺腺癌SPC-A-1

細(xì)胞增殖，且隨著PEDF濃度增加、作用時間延長，細(xì)胞增殖抑制率逐漸增高。細(xì)胞增殖失控是腫瘤形成的重要原因。腫瘤細(xì)胞的增殖周期包含G1、S、G2及M期，與細(xì)胞增殖關(guān)系最為密切的是DNA倍增、染色體復(fù)制的S期。如果在S期通過外界因素作用抑制或減慢DNA合成，則會影響細(xì)胞周期的進展。PEDF可抑制腫瘤細(xì)胞周圍新生血管的形成，減少細(xì)胞增殖所需蛋白質(zhì)的合成，使DNA含量較多的S期細(xì)胞減少，而DNA含量較少的G1期細(xì)胞增多，從而減慢腫瘤細(xì)胞周期進程，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

本研究還發(fā)現(xiàn)，PEDF也具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，隨著PEDF濃度的增加、作用時間的延長，細(xì)胞凋亡率逐漸增高。細(xì)胞凋亡是一種主動的、受遺傳控制的程序性死亡，PEDF可能通過作用于腫瘤的某些旁路途徑，或參與細(xì)胞周期的某些重要的酶、蛋白，進而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，PEDF抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用具有劑量依賴性，這與婁志霞等［12］對人肺腺癌A549細(xì)胞、劉正兵等［13］對肺大細(xì)胞癌NCI-H460細(xì)胞的研究結(jié)果一致。因此，PEDF有望成為治療肺癌的輔助用藥。

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·臨床研究·

收稿日期:( 2015-04-02)

文章編號:1002-266X( 2015) 32-0034-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R734.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.013