熱量限制對(duì)大鼠血清支鏈氨基酸、芳香族氨基酸、甘氨酸水平的影響及意義

宮環(huán)，楊睿悅，韓怡文，孫亮，崔菊，張延，張恩毅，張鐵梅(北京醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所，衛(wèi)生部北京老年醫(yī)學(xué)研究所，北京100730)

熱量限制對(duì)大鼠血清支鏈氨基酸、芳香族氨基酸、甘氨酸水平的影響及意義

宮環(huán)，楊睿悅，韓怡文，孫亮，崔菊，張延，張恩毅，張鐵梅
(北京醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所，衛(wèi)生部北京老年醫(yī)學(xué)研究所，北京100730)

摘要:目的觀察熱量限制( CR)對(duì)大鼠血清支鏈氨基酸［纈氨酸( Val)、異亮氨酸( Ile)、亮氨酸( Leu)］、芳香族氨基酸［酪氨酸( Tyr)、苯丙氨酸( Phe)］及甘氨酸( Gly)水平的影響，并探討其與胰島素敏感性的關(guān)系。方法將20只雄性SD大鼠隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組各10只，對(duì)照組給予自由飲食，觀察組限制熱量攝入為對(duì)照組的60%。喂飼12周后稱取兩組體質(zhì)量及附睪旁脂肪墊質(zhì)量;行胰島素耐量試驗(yàn)，繪制血糖值曲線并計(jì)算曲線下面積。采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)兩組血清Val、Ile、Leu、Tyr、Phe及Gly。結(jié)果觀察組體質(zhì)量、附睪旁脂肪墊質(zhì)量均低于對(duì)照組，P均＜0.01。觀察組血糖值曲線下面積為728.1±65.7，對(duì)照組為955.1±39.0，P＜0.01。觀察組血清Ile、Leu、Tyr水平均低于對(duì)照組，Gly水平高于對(duì)照組，P均＜0.05。兩組血清Val、Phe水平比較，P均＞0.05。結(jié)論CR可能通過升高大鼠血清Gly水平，降低Ile、Leu、Tyr水平而提高其胰島素敏感性。

關(guān)鍵詞:熱量限制;胰島素敏感性;支鏈氨基酸;芳香族氨基酸;甘氨酸;大鼠

Effects of caloric restriction on levels of serum branched chain amino acids，aromatic amino acids and glycine of rats

GONG Huan，YANG Rui-yue，HAN Yi-wen，SUN Liang，CUI Ju，ZHANG Yan，ZHANG En-yi，ZHANG Tie-mei
( Beijing Hospital and Beijing Institute of Geriatrics，Ministry of Health，Beijing 100730，China)

Abstract:Objective To observe the effects of caloric restriction ( CR) on levels of serum branched chain amino acids［valine ( Val)，isoleucine ( Ile)，leucine ( Leu)］，aromatic amino acids［tyrosine ( Tyr) and phenylalanine ( Phe)］and glycine of rats，and to investigate their relationships with insulin sensitivity.Methods Twenty male SD rats were randomly divided into the control group which was fed ad libitum and the observation group which was fed 60% of the food as in the control group.After 12 weeks，body weight was measured and insulin tolerance test ( ITT) was performed.Blood glucose value curve was drawn and wevcalculated the area under the curve ( AUC).The levels of Val，Ile，Leu，Tyr，Phe and Gly were determined by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.Results Both body weight and epididymal fat pad weight were lower in the observation group than in the control group ( all P＜0.01).AUC of blood glucose in the observation group was 728.1±65.7，and 955.1±39.0 in the control group，respectively ( P＜0.01).The serum concentrations of Ile，Leu and Tyr in the observation group were lower than those of the control group，and the concentration of Gly was higher ( all P＜0.05).No significant difference was found in the serum levels of Val and Phe between the two groups ( all P＞0.05).Conclusion CR increases the serum level of Gly，reduces the levels of Ile，Leu and Tyr，and thus it increases the insulin sensitivity.

Key words:caloric restriction; insulin sensitivity; branched chain amino acids; aromatic amino acids; glycine; rats

研究發(fā)現(xiàn)，血液中支鏈氨基酸( BCAAs)水平與肥胖、胰島素抵抗或2型糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)［1～3］;芳香族氨基酸( AAAs)和甘氨酸( Gly)等均為與代謝綜合征有關(guān)的代謝因子［3］。近年來以胰島素抵抗為特征的代謝綜合征發(fā)病率逐年上升，熱量限制( CR)是被證實(shí)可以預(yù)防其發(fā)生、發(fā)展的有效

手段［4，5］。2014年5～9月，我們觀察了SD大鼠CR后血清BCAAs、AAAs及Gly水平的變化，并探討其與胰島素敏感性的關(guān)系，以期為代謝綜合征的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料雄性8周齡SD大鼠20只，體質(zhì)量242 ～282 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。纈氨酸( Val)、異亮氨酸( Ile)、亮氨酸( Leu)、酪氨酸( Tyr)、苯丙氨酸( Phe)及Gly標(biāo)準(zhǔn)品、色譜純甲酸均購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，同位素內(nèi)標(biāo)物( Val-D8、Ile-D10、Leu-D3、Tyr-D4、Phe-D5和Gly-D5)均購自Cambridge同位素實(shí)驗(yàn)室，色譜純乙腈購自美國(guó)Fisher公司。1200型高效液相色譜儀購自美國(guó)Agilent公司，API 4000 Triple Quadruple質(zhì)譜儀購自美國(guó)AB SCIEX公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理將20只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組和對(duì)照組，各10只。兩組均于清潔級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)，室內(nèi)光照12 h晝夜循環(huán)，室溫22～25℃;對(duì)照組自由飲食，觀察組限制熱量攝入為對(duì)照組的60%，共喂飼12周。

1.3相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1體質(zhì)量及附睪旁脂肪墊質(zhì)量?jī)山M過夜禁食12 h后，稱取體質(zhì)量。用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，分離附睪旁脂肪墊并稱其質(zhì)量。

1.3.2胰島素耐量?jī)山M禁食5 h后，腹腔注射胰島素0.5 IU/kg，分別于注射即刻及注射后15、30、60、120 min取尾血，采用強(qiáng)生血糖儀及配套試紙條測(cè)定血糖值。采用GraphPad Prism 5.01軟件繪制血糖值曲線，并計(jì)算曲線下面積( AUC)。

1.3.3血清氨基酸水平采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。收集兩組腹主動(dòng)脈血，離心后取血清，－80℃保存。分別取0.05 mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和血清樣品，加入內(nèi)標(biāo)混合溶液0.05 mL、0.1%甲酸乙腈溶液0.4 mL震蕩離心。吸取上清液0.05 mL于入樣瓶中，室溫下氮?dú)獯蹈?，加?.1%甲酸水溶液0.2 mL，復(fù)溶后上機(jī)。采用Waters Shield C18色譜柱( 3.5 μm，2.1× 150 mm)，流動(dòng)相為10%乙腈、含0.01%甲酸水溶液流速0.3 mL/min，柱溫20℃。串聯(lián)質(zhì)譜采用正離子電噴霧離子化的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，霧化氣、加熱氣、氣簾氣和碰撞氣分別為620.5、482.7、517.3和13.8 kPa，噴霧電壓5 500 V，去溶劑溫度700℃。以標(biāo)準(zhǔn)溶液氨基酸水平為X軸，氨基酸和相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為Y軸，進(jìn)行線性回歸分析，將樣品峰面積比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，參照Yang等［6］的方法計(jì)算血清Val、Ile、Leu、Tyr、Phe及Gly水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組體質(zhì)量、附睪旁脂肪墊質(zhì)量比較見表1。

表1　兩組體質(zhì)量、附睪旁脂肪墊質(zhì)量比較( g，珔x±s)

2.2兩組胰島素敏感性比較兩組各時(shí)點(diǎn)血糖水平比較見表2。觀察組AUC為728.1±65.7，對(duì)照組為955.1±39.0;兩組比較，P＜0.01。

表2　兩組各時(shí)點(diǎn)血糖水平比較( mmol/L，珔x±s)

2.3兩組血清氨基酸水平比較見表3。

表3　兩組血清氨基酸水平比較( mg/L，珔x±s)

3　討論

隨著社會(huì)人口的老齡化和生活方式的改變，以胰島素抵抗為特征的代謝綜合征發(fā)病率逐年上升［7］。CR可以通過調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路、提高胰島素敏感性等途徑預(yù)防、延緩和減輕代謝綜合征等衰老或肥胖相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展，但其機(jī)制仍未明了［7，8］。本研究結(jié)果顯示，觀察組體質(zhì)量、附睪旁脂肪墊質(zhì)量均顯著低于對(duì)照組，表明CR模型建立成功。胰島素耐量試驗(yàn)可間接反映胰島素的敏感性［9］。本研究結(jié)果顯示，觀察組胰島素耐量試驗(yàn)中胰島素負(fù)荷120 min的血糖值及AUC均顯著低于對(duì)照組;提示CR可顯著提高大鼠的胰島素敏感性同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)本研究中CR模型建立成功。

早在1969年就有研究發(fā)現(xiàn)，肥胖、胰島素抵抗

或2型糖尿病患者血液中BCAAs、AAAs等氨基酸水平升高［10］。Wang等［11］發(fā)現(xiàn)，血液中Phe和Tyr水平升高會(huì)使2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)上升5倍。一系列研究表明，BCAAs、AAAs及其代謝產(chǎn)物與胰島素抵抗及冠心病發(fā)病密切相關(guān)，且其相關(guān)性高于血清脂肪酸［1，12，13］。Xiao等［14］給小鼠喂飼Leu缺陷飼料，發(fā)現(xiàn)其胰島素敏感性升高。本研究也顯示，觀察組血清Ile、Leu、Tyr水平均顯著低于對(duì)照組。以上結(jié)果提示，血清Ile、Leu、Tyr水平降低可能與CR可提高胰島素敏感性有關(guān)。此外，Hsiao等［15］用降糖效果不同的幾種噻唑烷二酮類藥物處理Zucker肥胖大鼠，發(fā)現(xiàn)其控制血糖效果與BCAAs分解代謝通路酶編碼基因的調(diào)節(jié)能力增強(qiáng)相關(guān)。因此推測(cè)，CR可能調(diào)節(jié)了上述氨基酸代謝通路中的酶，從而改變這些氨基酸的水平。

與上述幾種氨基酸相反，血液Gly水平在消瘦人群中高于超重及肥胖人群，代謝正常的健康人群高于代謝異?；颊?，說明血液中Gly水平升高表示個(gè)體處于健康狀態(tài)，即Gly是保護(hù)性因素［3］。本研究觀察組血清Gly水平顯著高于對(duì)照組，提示CR可升高大鼠血清Gly水平，從而改善其代謝狀態(tài)。

綜上所述，CR可改變大鼠血清氨基酸譜的表達(dá)，而提高其胰島素敏感性。本研究為代謝綜合征患者的飲食干預(yù)治療提供了理論依據(jù)。

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收稿日期:( 2015-04-09)

通信作者簡(jiǎn)介:張鐵梅( 1953-)，女，博士、研究員，研究方向?yàn)樯罘绞礁深A(yù)的作用及機(jī)制。E-mail: tmzhang126@126.com

作者簡(jiǎn)介:第一宮環(huán)( 1977-)，女，博士、助理研究員，研究方向?yàn)闊崃肯拗频淖饔眉皺C(jī)制。E-mail: huan0220@163.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 81300693) ;國(guó)家十二五科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目( 2012BAI10B01)。

文章編號(hào):1002-266X( 2015) 32-0011-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R587.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.004